阿特拉津降解菌AT2的分離鑒定及其模擬土壤修復研究

李曉微（齊齊哈爾市機動車排氣污染防治中心 黑龍江 齊齊哈爾 161000）

1 引言

阿特拉津是一種對一年生禾本科雜草和闊葉雜草以及多年生雜草具有較好防除效果的旱地除草劑。自其19世紀50年代問世以來，以其價格低廉、除草效果好的特點在全世界

很多國家得到了廣泛的應用，并且使用的數量也逐年遞增。由于阿特拉津在環境中具有難降解、遷移速度快、存在生物毒性的特點，因此其在減少雜草數量、提高糧食產量的同時也給環境和各類生物帶來了很大的危害。許多研究表明：一些曾經大量施用阿特拉津的國家的地表水以及地下水中均有阿特拉津被檢出。另外，阿特拉津還可通過揮發和浮塵進入大氣，并通過干沉降和濕沉降等方式返回地面，許多未曾施用過阿特拉津的國家的高山和湖泊中也有阿特拉津被檢出，其對生態環境的影響具有全球性。

阿特拉津污染的微生物修復是當前有關阿特拉津污染治理研究領域中的熱點問題。近年來，很多國家的學者已從不同的樣品中分離出能夠很好的降解阿特拉津的菌株，主要包括細菌、放線菌和真菌。目前，有關Pseudomonas和Arthrobacter菌屬的阿特拉津降解菌的基本生長降解特性、降解途徑及降解基因種類等方面有較為深入的研究，而有關Rhizobium屬阿特拉津降解菌的報道則相對較少。本研究從我國黑龍江省長期施用阿特拉津的農田黑土中分離得到具有降解阿特拉津能力的細菌菌株Rhizobium AT2，研究不同培養條件對其生長和降解能力的影響，并對其在阿特拉津污染土壤修復中的應用進行模擬試驗，為我國北方地區阿特拉津污染土壤的原位修復提供理論基礎，同時也有利于今后進一步了解降解菌株分解阿特拉津途徑的多樣性以及不同種屬菌株降解基因之間的聯系。

2 材料與方法

2.1 材料

2.1.1 土壤樣品

土壤樣品采自黑龍江省五常市多年施用阿特拉津的玉米大田表層土壤（0-20cm），土壤為典型的北方黑土。土壤樣品采集后用密封袋帶回實驗室，手工挑去植物殘體及其他雜物后置于冰箱內4℃保存，待用。

2.1.2 富集、分離用培養液和培養基

每升富集培養液中含有：K2HPO41.6g，KH2PO40.4g，MgSO40.2g，NaCl0.1g，葡萄糖3.0g作為碳源，加入適量阿特拉津純藥為唯一氮源。

固態分離培養基為含有1.5%-2%瓊脂粉的富集培養液。

2.1.3 其他試劑

Taq酶、引物及PCR反應體系中所應用的其他試劑均購自上海生物工程有限公司，菌株基因組提取試劑盒購自上海超世生物科技有限公司。

2.2 阿特拉津降解菌的富集與分離

稱取10克新鮮土壤樣品并置于含有90ml富集培養液的三角瓶中，培養液中阿特拉津的初始濃度為100mg·L-1。將上述土壤混合液置于30℃，150r·min-1條件下震蕩培養，每隔7d吸取10ml混合液并轉移至新鮮的富集培養液中繼續震蕩培養，每次轉移時增加培養液中阿特拉津的濃度。重復上述操作，連續富集兩個月（轉移8次）。隨后采用稀釋平板法進行分離，挑選固態分離培養基上菌落周圍帶有透明降解圈且形態、顏色不同的單菌落進行劃線分離，以此獲得不同種類的純培養菌株。將所分離到得菌株接種于阿特拉津作為氮源的富集培養液中，考察不同菌株對阿特拉津的降解情況，選取降解能力最強的菌株進行深入研究。

2.3 阿特拉津降解菌的鑒定

對所選定降解菌株進行形態學觀察及生理生化反應鑒定，具體的方法見參考文獻〔9〕。采用購自上海超世生物公司的基因組DNA提取試劑盒，按照說明書中的方法提取菌株的基因組DNA，以DNA為模板，R518和F338GC為PCR反應引物按如下反應條件對所提取的基因組DNA進行擴增：95℃預變性3min，94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共40個循環，最后72℃延伸5min。PCR反應采用25μl反應體系，反應體系為：引物各0.5μl，10 ×buffer緩 沖 液 2.5μl，Mg2+（25mM）2.0μl，dNTP（10mM）0.5μl，Taq酶0.5μl，模板2μl，蒸餾水補足至25μl。將PCR反應產物純化后委托上海超世生物公司進行序列測定。將所得到的序列與GenBank數據庫中已記錄的具有降解阿特拉津能力的菌株序列進行Blast比對，進而確定所分離的菌株所屬的類別（鑒定到屬）。利用MEGA3.1軟件對Blast比對中搜索到的與分離出菌株同源性較高的序列進行聚類分析。

2.4 菌株生長量和阿特拉津濃度的測定

2.4.1 菌株生長量的測定

由于菌體在波長600nm下有最大吸收峰，因此在本試驗中以未接入菌株的富集培養液為空白樣品，利用分光光度計在600nm波長條件下測定待測樣品的OD600值，以此表示待測樣品中菌株的生長量。

2.4.2 培養液中阿特拉津的提取與測定

將待測樣品倒入分液漏斗中，加入相同體積的三氯甲烷，震蕩后靜置，通過裝有適量經高溫煅燒處理的無水硫酸鈉的漏斗收集下層有機相，利用旋轉蒸發儀在45℃的條件下將所收集的有機相減壓濃縮至1ml。采用裝有內涂OV1701的大口徑毛細管柱、FID檢測器的GC-14C型氣相色譜儀測定濃縮樣品中的阿特拉津，測定時所采用的氣譜條件及阿特拉津濃度計算方法見參考文獻〔7〕。

2.4.3 模擬修復試驗中土壤中阿特拉津的提取與測定

根據土壤樣品的含水率，稱取相當于10g風干土重的土壤樣品置于三角瓶中，加入50ml提取液（V丙酮：V水=4：1的丙酮溶液），浸泡8-10h后于200 r·min-1條件下震蕩20min，減壓抽濾收集濾液，再用10ml提取液洗滌三角瓶，重復2次，收集所有濾液后，利用旋轉蒸發儀在60℃減壓蒸餾，以除去丙酮相。將剩余水相轉移至分液漏斗中，依次加入2克NaCl和15mlCHCl3后震蕩萃取，收集下層有機相，再重復上述操作2次，合并所有有機相共計45ml于45℃的條件下減壓蒸餾至1ml后測定濃度。測定時所采用的氣譜條件及阿特拉津濃度計算方法見參考文獻〔6〕。

2.5 不同培養條件對菌株AT2生長和降解能力的影響

配制一定體積阿特拉津濃度為100mg·L-1的富集培養液，依次吸取10ml置于三角瓶中，培養液以及培養條件按如下所述幾種方法進行調整：（1）培養液pH值，用1mol·L-1的HCl溶液和NaOH溶液調節培養液的pH值，使其分別為3、4、5、6、7、8、9、10、11；（2）培養液的鹽度，依次向培養液中加入適量的Na－Cl，最終使培養液中NaCl的質量分數分別為0.01%、1%、2%、3%、4%、5%；（3）外加氮源物質，分別向培養液中加入硝酸銨、硝酸鉀、蛋白胨、硫酸銨并最終使他們在培養液中的濃度為500mg·L-1，同時設不外加其他氮源物質的樣品為空白樣品。按1%的接菌量分別向上述經不同處理的培養液中接入OD600值為1的AT2菌懸液并置于30℃，150r·min-1條件培養，培養72h后按照2.4中所述的方法測定上述培養液的OD600值與剩余阿特拉津的濃度。（4）培養溫度，將接入菌株的樣品置于4℃、10℃、20℃、30℃、40℃下培養，培養時間及測定指標同上；（5）菌株AT2對阿特拉津的耐受性試驗，按1%的接菌量依次向阿特拉津濃度分別為500mg·L-1、1000mg·L-1、1500mg·L-1、2000mg·L-1的無機鹽培養液中接入OD600為1的AT2菌懸液，同時以不接菌處理的樣品為空白對照樣品，所有樣品于30℃，150r·min-1條件培養72h后測定樣品中剩余阿特拉津的濃度。

2.6 菌株AT2在阿特拉津污染土壤修復應用中的模擬研究

稱取相當于500g風干土重量的土壤樣品，均勻加入適量濃度為1000mg·L-1的阿特拉津甲醇溶液，最終使土壤中阿特拉津的濃度為10mg·Kg-1，待甲醇揮發后，按2%的接菌量均勻加入OD600為1的AT2的菌懸液。設不接菌處理的土壤樣品為空白對照樣品，每個樣品設3個重復，將所有的樣品置于20℃條件下，定期澆水以保持土壤的含水率，分別于培養的第1、3、7、10、15天取樣，按2.4.3中所述的方法測定土壤樣品中阿特拉津的含量。

3 結果

3.1 阿特拉津降解菌的分離

本試驗共從所采集的土壤樣品中分離得到了具有降解阿特拉津能力的細菌菌株6株。其中菌株AT2對培養液中阿特拉津的降解效果要明顯的好于其他5株菌株，按1%的接菌量分別向阿特拉津濃度為100mg·L-1的分離用培養液中接入OD600為1的AT2菌懸液，于30℃，150r·min-1條件下培養，每隔12h測定培養液的OD600值及剩余阿特拉津的濃度，所得結果如圖1所示。圖1表明：AT2能夠在含有阿特拉津的培養液中很好的生長，培養的36-72h為菌株AT2的對數生長期，在此階段，培養液的OD600值由0.08上升到0.723，而培養液中阿特拉津的濃度則由79.3mg·L-1較低到0mg·L-1，說明AT2在迅速增長的同時對培養液中阿特拉津的降解量也逐漸增多，在上述條件下AT2可在72h內將培養液中濃度為100mg·L-1的阿特拉津全部分解。因此本試驗選定AT2做為試驗菌株進行深入研究。

圖1 AT2的基本生長和降解曲線

3.2 阿特拉津降解菌的鑒定

形態學觀察表明：AT2菌落較大，表面隆起，邊緣規則整體呈圓短桿型。黃色且粘稠，不透明，有光澤。在掃描電子顯微鏡下觀察AT2個體形態為短桿型，兩段略圓（如圖2所示）。菌株AT2的生理生化反應結果如表1所示。形態學觀察及菌株的生理生化反應結果表明：菌株AT2為一株革蘭氏陰性桿菌。

圖2 AT2的掃描電子顯微鏡圖（5000×）

將所測得的菌株AT2的16SrDNA序列利用Blast軟件在GenBank中與已報道的菌株序列進行同源性比較，結果表明：菌株AT2的16SrDNA基因序列與Rhizobium屬的基因序列有較高的相似性，因此初步鑒定鑒定菌株AT2為Rhizobium。利用MEGA3.1軟件構建菌株AT2的系統進化樹，所的結果如圖3所示：

表1 菌株AT2的生理生化特征

3.3 不同培養條件對菌株AT2生長能力和降解能力的影響

3.3.1 培養液pH對菌株AT2生長能力和降解能力的影響

菌株AT2在不同pH培養液中培養72h后的生長和降解情況如圖4a所示，圖4a表明；AT2在pH值為6-8的培養液中具有較好的生長和降解能力，在此條件下AT2對培養液中阿特拉津的降解率達到82.4%-100%之間。當培養液的pH為7時，AT2的生長量與降解率均達到最大值，表明AT2最適合在中性條件下生長。另外，AT2在pH為5和9的培養液中對阿特拉津的降解率分別為32%和35.5%，表明AT2具有一定的耐酸堿的特性。

圖3 菌株AT2 的系統進化樹

3.3.2 培養液鹽度對菌株AT2生長能力和降解能力的影響

圖4 不同培養條件下菌株AT2的生長和降解能力

AT2在不同鹽度的培養液中具有不同的生長和降解能力（如圖4b所示），當培養液鹽度在0.01%-5%的范圍內時，隨著培養液鹽度的增加，AT2的生長與降解能力隨培養液鹽度的增加而逐漸降低，說明培養液鹽度對AT2的生長有較大的影響。另外，從圖4b還可以看出，AT2也具有一定的耐鹽性，其在鹽度低于2%的培養液中的降解率均能達到90.5%以上。結合3.3.1中的結果可以看出，菌株AT2具有一定的耐酸堿及鹽度的特性，因此其具有修復阿特拉津污染的鹽堿土壤的潛質。

3.3.3 不同培養溫度對菌株AT2生長和降解能力的影響

從圖4c可以看出，菌株AT2在不同的培養溫度下表現出不同的生長和降解能力，當培養溫度由4℃升高到30℃時，菌株的生長量由0.013上升到1.18，降解率由4.9%上升到100%，說明在此階段菌株的生長和降解能力均隨培養溫度的升高而增強。當溫度升高到40℃時，AT2的生長和降解能力均受到了一定程度的抑制，此時，生長量和降解率僅為0.18和16.9%。值得一提的是，當培養溫度為10℃時，AT2的降解率仍能保持在46.3%，表明AT2能夠在北方低溫條件下保證一定的降解能力，具有進一步研究其在低溫條件下實際修復污染土壤的價值。

3.3.4 菌株AT2對阿特拉津的耐受性試驗

圖4d表示菌株AT2在不同阿特拉津濃度培養液中的降解情況。如圖所示：AT2對阿特拉津濃度分別為500mg·L-1，1000mg·L-1，1500mg·L-1，2000mg·L-1的培養液中阿特拉津的降解率變化不大，均能保持在81.5%-85.4%之間，說明在此底物濃度區間，菌株AT2分解培養液中阿特拉津的量與培養液中阿特拉津的自身濃度呈線性關系，且培養液中高濃度的阿特拉津對菌株AT2的降解能力無較大的影響。因此可以說菌株AT2具有修復高濃度阿特拉津點源污染的能力。

3.3.5 外加氮源對菌株AT2生長和降解能力的影響

本文選取硝酸銨、硝酸鉀、蛋白胨、硫酸銨四種常見的氮源物質并按2.5中所述的方法研究上述4種氮源物質對菌株AT2生長和降解能力的影響，所得的結果如圖4e和圖4f所示。上述4種氮源物質可以明顯的促進菌株AT2的生長。在外加硫酸銨的樣品中，菌株AT2的生長量達到1.593，遠高于其他處理中菌株AT2的生長量，說明硫酸銨對菌株AT2生長量的促進作用最大。對比圖4e和圖4f可以發現：外加的幾種氮源物質在促進菌株AT2生長的同時對菌株的AT2的降解能力則有一定的影響，但影響的程度并不是很大，各處理樣品中菌株AT2對阿特拉津的降解率均能達到70.5%以上。除外加硝酸鉀的樣品外，其他3種外加氮源物質樣品中均表現為：對菌株AT2生長能力促進的作用越強，則對其降解能力抑制程度也相應較強。

3.4 菌株AT2在阿特拉津污染土壤修復應用中的模擬研究

不同取樣時間下，接菌處理及未接菌處理土壤樣品中阿特拉津的剩余濃度如圖5所示；

從圖5可以看出，在培養的第1天取樣時，接菌處理與未接菌處理土壤樣品中阿特拉津的濃度差異不大。隨著培養時間的延長，接菌處理與未接菌處理土壤樣品中，阿特拉津的濃度變化差異逐漸增大，經過15d的模擬修復試驗，未接菌處理土壤樣品中，阿特拉津的降解率僅為2.8%，而接菌處理樣品中阿特拉津的降解率則達到94.7%，說明菌株AT2在土壤中也有較好的分解阿特拉津的能力。分析未接菌處理樣品中仍有少量阿特拉津被降解的原因可能是由于土壤中存在的土著微生物的作用以及光解等作用造成的。

圖5 不同培養時間下土壤中阿特拉津的變化情況

4 討論

由于不同種類的微生物在不同生長條件下表現出不同的生長與降解能力，因此全面地掌握菌株在不同條件下的生長和降解能力以及菌株在實驗室條件下對土壤中阿特拉津的分解效果對今后更好地將其應用于污染土壤的原位修復進而獲得顯著的修復效果具有十分重要的意義。溫度和鹽度是影響菌株生長和降解能力較為重要的因素。de Souza等人的研究結果表明菌株分解阿特拉津的各步反應是由atzA、atzB、atzC，trzN等礦化基因編碼的酶所催化完成的。在較高或較低的溫度條件下活性下降是大多數酶的基本特證，因此分析菌株在高溫或低溫條件下生長和降解能力受到抑制的原因可能是由于菌體內部催化其自身生長和分解阿特拉津的酶的活性受到抑制所致。此外，高鹽環境則會通過破壞菌體細胞內外的滲透壓使細胞失水死亡而影響菌株的生長和降解能力。然而本文所分離的菌株AT2在10℃時對阿特拉津的降解率仍能保持在46.3%，加之AT2在鹽度為2%的培養液中對阿特拉津的降解率也能保持在90.5%以上，表明菌株AT2具有一定的耐低溫、耐鹽的特性。另外，菌株AT2在阿特拉津污染土壤的模擬修復試驗中也表現出良好的降解能力，說明該菌株具有對阿特拉津污染的黑土土壤特別是在低溫條件下對鹽度較高的污染土壤進行原位修復的能力。

菌株AT2以阿特拉津作為氮源物質生長，外加的其他氮源物質在促進AT2生長的同時對AT2的降解能力則有一定的抑制，這與先前Alvey等人有關外加氮源物質對阿特拉津的生物降解存在副作用的研究結果相一致。因此可以初步認為，盡管微生物可以分解各類結構復雜的有機污染物，但當其生長環境中存在結構更為簡單的碳、氮源營養物質時，其會優先利用這些結構簡單的物質生長，進而對降解菌株降解有機污染物的能力產生不同程度的抑制。這一特性對今后降解菌株在土壤污染實際修復應用中如何平衡修復效果與外加肥料保持土壤肥力之間的矛盾方面提出了新的研究問題，值得深入研究。

5 結論

（1）從黑龍江省長期施用阿特拉津的農田黑土中分離出一株能夠分解阿特拉津的細菌菌株AT2，通過形態學觀察、常規生理生化反應及序列比對，鑒定該菌株屬于Rhizobium；

（2）通過搖瓶試驗對菌株AT2的基本生長和降解特性以及不同培養條件對其生長和降解能力的影響進行研究，結果表明：在30℃，150r·min-1條件下，按1%的接菌量向培養液中接入AT2懸液，其可在72h內將其中濃度為100mg·L-1的阿特拉津全部分解。菌株AT2在pH值為6-8，培養溫度為30℃時具有較好的生長和降解能力。低溫或高溫以及培養液鹽度對其生長和降解能力具有不同程度的影響，AT2具有一定的耐酸堿性及耐低溫的特性。外加的氮源物質在促進AT2生長的同時對其分解阿特拉津的能力有一定的程度的抑制。

（3）菌株AT2在土壤中也有較好的分解阿特拉津的能力，其在15d內對土壤中濃度為10mg·Kg-1的阿特拉津的降解率達到94.7%。

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