廣藿香醇抑制幽門螺桿菌脲酶活性及其機制

連大衛+許藝飛+任文康+扶麗君+范平龍+操紅纓+黃萍

[摘要]探討廣藿香醇對于幽門螺桿菌Helicobacter pylori脲酶活性的抑制及其相關基因的表達變化，為進一步研究廣藿香醇對幽門螺桿菌定植感染的影響奠定基礎。培養幽門螺桿菌并采用革蘭染色、快速尿素酶及PCR的方法鑒定后，在酸性條件（pH 5.3）和中性條件（pH 7.0）培養液中給予不同濃度的廣藿香醇干預1 h，應用瓊脂稀釋法測定細菌的存活率；Berthelot顯色法檢測細菌的脲酶活性；RT-qPCR法檢測細菌中ureA，ureB，ureE，ureH，ureI和nixA相關脲酶基因的表達變化。經過鑒定生長良好幽門螺桿菌在不同濃度的廣藿香醇干預后， 細菌存活率沒有明顯變化；其脲酶活性出現了顯著的下降；同時脲酶的相關基因ureA，ureB，ureE，ureH，ureI和nixA的表達均出現不同程度的降低。廣藿香醇在酸性條件和中性條件下均可以抑制幽門螺桿菌脲酶的活性，可能與降低細菌脲酶相關的基因表達有關。

[關鍵詞]幽門螺桿菌； 脲酶； 廣藿香醇

[Abstract]To investigate the effect of patchouli alcohol on inhibiting Helicobater pylori urease activity， and its effect on expression levels of related genes， and lay the foundation for further research on the effect of patchouli alcohol on H. pylori colonization and infection. H. pyloriwas cultured and identified by gram staining， rapid urease test （RUT） and PCR method. Then agar dilution method was used to detect the bacterial survival after 1 h intervention by different concentrations of patchouli alcoholin the acidic （pH 5.3） and neutral （pH 7.0） conditions； berthelot method was used to detect urease activity and RT-qPCR method was used to detect the expression changes of ureA， ureB， ureE， ureH， ureI， and nixA related urease genes. The results showed that the survival rate of H. pyloriwas not significantly changed but the urease activity was obviously decreased after intervention by different concentrations of patchouli alcohol； meanwhile， the expression levels of ureA， ureB， ureE， ureH， ureI， and nixA were decreased to different degrees. Therefore， patchouli alcohol could inhibit H. pylori urease activity in both acidic and neutral conditions， and the mechanism may be related to down-regulation of urease gene expression.

[Key words]Helicobacter pylori； urease activity； patchouli alcohol

幽門螺桿菌（Helicobacter pylori）屬于彎曲桿狀的革蘭陰性微需氧細菌，定植于宿主的胃部，是世界范圍內最常見的傳染性病原菌之一，全球有超過50%的人群感染。我國約有6億以上人口感染，且有呈逐年上升的趨勢^[1-2]。正常情況下人體的胃內的pH大約在1～2，因此極少有細菌能夠在胃中存活下來，而H.pylori能夠在此環境下生存主要是依靠其能夠產生具有強大活性的脲酶^[3]，該種酶即使在胃液中也可以充分發揮分解胃液中少量的尿素而產生氨的作用，在幽門螺桿菌周圍形成一片“氨云”，中和胃酸保護細菌不被胃酸殺滅^[4]。脲酶占據整個細菌可溶蛋白的10%～15%，其不僅是區別于其他胃腸道微生物的主要特征，也是重要的定植和致病因子^[5-6]。廣藿香是中醫常用的芳香化濕類中藥，其主要藥效研究現多集中于其中的揮發油成分，廣藿香醇為廣藿香醇揮發油中含量最高的成分^[7]，各項研究顯示了廣藿香醇具有良好的抗菌、抗病毒、抗潰瘍等方面的作用，具有多種生物活性^[8]。本實驗旨在觀察廣藿香醇對于H.pylori脲酶活性的抑制及其作用機制，為進一步研究開發提供依據。

1 材料

1.1 儀器和試劑 Campylobacter agar base（Oxoid，批號1589242）；無菌脫纖維羊血[平睿生物科技（北京）有限公司，批號20150917]；Brain-heart unfusion（Oxoid，批號1677862）；胎牛血清（Gibco，批號730840）；革蘭染色液試劑盒（海博生物，批號HB8278）；細菌基因組DNA提取試劑盒（天根生物，批號DP302-2）；Super Real Pre Mix×Plus（天根生物，批號03120）；FastQuant RT Kit（天根生物，批號03326）；Trizol Reagent（Thermo Life technology，批號28218）；麥氏比濁儀（珠海貝索生物技術有限公司）； NU-5831E三氣培養箱（Nuaire）；生物安全柜（ESCO）；全波長酶標儀（Thermo）； BioSpec-nano核酸分析儀（島京）；CFX 96實時熒光定量PCR儀器（Bio-Rad）。

1.2 細菌 H.pylori（SS1）由澳大利亞莫納什大學Richard Ferrero教授饋贈。

1.3 樣品的制備 廣藿香醇（HPLC>98%），由廣州中醫藥大學新藥研究與開發中心蘇子仁教授提供。臨用前用溶解于DMSO，再配成20，10，5 mg·L^-1的含藥BHI培養液。

2 方法

2.1 幽門螺桿菌的復蘇和傳代 將凍存的幽門螺桿菌菌株從超低溫冰箱（-80 ℃）取出，復蘇于彎曲桿菌瓊脂培養基為基礎，含7%脫纖維新鮮羊血及聯合抗生素（萬古霉素10 mg·L^-1，甲氧芐氨嘧啶5 mg·L^-1、頭孢磺啶5 mg·L^-1、兩性霉素5 mg·L^-1） 的血平板上，其中平板分為pH 7的中性平板和pH 5.3的酸性平板。倒置平板置于37 ℃，5%O₂，10%CO₂，85%N₂的培養箱中復蘇48～72 h。待細菌長滿平板后，使用一次性無菌棉簽刮取并重懸于的PBS中接種于新的血平板上，再生長48～72 h。

2.2 幽門螺桿菌菌株的鑒定 使用一次性接種環取部分細菌，于載玻片水滴上充分涂布均勻，酒精燈烤干。使用革蘭染色試劑盒染色細菌，于顯微鏡下使用油鏡觀察細菌形態；取少量菌液置于快速脲素酶試劑里，37 ℃孵育4 h后觀察試劑顏色變化；同時取少量單菌落，按照細菌DNA提取試劑盒說明書操作提取DNA，使用引物16 s：5′-TATGACGGGTATCCGGC-3′和5′-ATTCCACTTACCTCTCCCA-3′，擴增條件為94 ℃預變性2 min，94 ℃解鏈2 s，53 ℃退火2 s，72 ℃延伸30 s，35個循環。配制1.5%瓊脂糖凝膠，100 V，35 min，5 μL上樣量，對PCR擴增產物電泳檢測。擴增產物目的長度為375 bp。

2.3 瓊脂稀釋法檢測幽門螺桿菌存活率 分別收集傳代生長的中性和酸性菌株于PBS之中，隨后冷凍離心（4 ℃，5 000×g，15 min）去除上清液并重懸于PBS中再洗滌2次。將酸性和中性菌株分別置于對應的酸性（pH 5.3）和中性（pH 7）含10%血清的BHI培養液中，使用麥氏比濁儀調整細菌濃度均為1×108 CFU·mL^-1。加入不同劑量的廣藿香醇，使受試藥物濃度最終分別為20，10，5 mg·L^-1，對照組加入等體積的DMSO；放入微需氧環境中孵育1 h。隨后取出部分菌液等比例稀釋并涂板，再放入微需氧環境中培養3 d后進行菌落計數，觀察廣藿香醇對幽門螺桿菌存活率的影響。

2.4 Berthelot顯色法檢測幽門螺桿菌脲酶活性 取部分與不同濃度的廣藿香醇共孵育的幽門螺桿菌菌液于離心管中，冷凍離心（4 ℃，5 000×g，15 min）洗滌3次后，置于-20 ℃保存過夜。第2天取出至室溫解凍后，超聲波振蕩冰浴3 min，冷凍離心（4 ℃，15 000×g，10 min）取上清液混合等體積甘油，在離心管中加入等體積尿素溶液（10 mmol·L^-1），混勻，室溫避光反應20 min，然后加入依據參考文獻方法配制的Berthelot顯色液^[8]，混勻，室溫顯色10 min，吸取反應液在酶標儀上檢測其A635，脲酶殘余活性（residual activity）=（A樣本-A空白）/（A對照-A空白）×100%。

2.5 RT-qPCR法檢測幽門螺桿菌脲酶相關基因表達 取部分與廣藿香醇共孵育后的幽門螺桿菌菌液，經過3次洗滌后去除上清液，加入1 mL Trizol試劑，參照Trizol說明書方法提取細菌的總RNA，在超紫外分光光度儀上測A260/A280達到1.8～2.0后，按逆轉入試劑盒操作方法得到其cDNA。引物設計：委托Takara公司設計并合成引物，具體引物序列見表1。

實時熒光定量RT-qPCR擴增程序按照熒光定量檢測試劑盒進行操作，在Bio-Rad熒光定量PCR儀上擴增。擴增條件：95 ℃預變性10 min，95 ℃變性5 s，60 ℃延伸30 s，40個循環。分析結果，得出各組內參基因和目的基因C_t，運用2-ΔΔCt公式計算。

2.6 統計方法 采用SPSS 20.0統計軟件，數據以±s表示，組間比較采用單因素方差檢驗和最小顯著性差異法（LSD）及Dunnett′s；以P<0.05或P<0.01作為具有統計學差異的標準。

3 結果

3.1 幽門螺桿菌鑒定結果 涂片經革蘭染色后，在油鏡下觀察幽門螺桿菌形態呈紅色彎曲桿狀，沒有發生球變。刮取菌株置于快速脲素酶反應試劑內，試劑變為紫紅色；16s PCR擴增可見在375 bp處有明顯的條帶。綜上表明該菌株為幽門螺桿菌且生長良好（圖1）。

3.2 廣藿香醇對幽門螺桿菌存活率的影響 與對照組相比，不管在酸性和中性條件下，廣藿香醇20，10，5 mg·L^-1均對幽門螺桿菌的存活率無明顯影響。

3.3 廣藿香醇對幽門螺桿菌中脲酶活性的影響 與對照組相比，廣藿香醇20，10 mg·L^-1在酸性和中性條件下均可以對幽門螺桿菌中脲酶活性產生明顯的抑制效果（表2）。

3.4 廣藿香醇對幽門螺桿菌脲酶相關基因表達的影響 與對照組相比，在酸性條件下廣藿香醇20，10，5 mg·L^-1均可以使幽門螺桿菌中ureB，ureE，ureI和nixA的基因表達出現顯著下降，廣藿香醇20 mg·L^-1可以明顯降低ureH基因表達；在中性條件下廣藿香醇20，10，5 mg·L^-1均可以使ureA， ureI和nixA基因表達出現顯著下降，廣藿香醇20，10 mg·L^-1可以使ureH基因表達明顯降低，廣藿香醇20 mg·L^-1可以明顯降低ureE的基因表達（表3，4）。

4 討論與結論

幽門螺桿菌脲酶是一種六聚體鎳金屬酶，相對分子質量約為500～600 kDa^[9]，而脲酶基因簇由多個開放閱讀框架構成，其中ureE，ureF，ureG，ureH 為輔助基因，編碼脲酶輔助蛋白；ureI 為幽門螺桿菌脲酶特有的基因，編碼脲酶特異性通道蛋白；ureA和 ureB 為結構基因，編碼脲酶結構蛋白。細菌體內的脲酶成熟過程由細菌內膜上的高親和力鎳轉運蛋白NixA獨立從外界攝取Ni²⁺進入細菌體內開始，通過形成二聚體的輔酶蛋白UreE將Ni²⁺傳遞給由輔酶蛋白UreF，UreG和UreH組成的復合體，輔酶蛋白復合體攜帶Ni²⁺與脲酶前體蛋白（由結構蛋白UreA和UreB構成）的活性中心結合后將攜帶的Ni²⁺留在脲酶前體蛋白活性中心，促使其成熟并發揮分解尿素的生物學功能。UreI 為酸激活蛋白，在酸性條件下，UreI 被激活而開啟通道，加速轉運尿素進入細胞質，最大化脲酶活動水平^[10-11]?；罨碾迕覆粌H其水解的產物可直接損害組織，同時也可以激活單核細胞，導致免疫炎性遞質和超氧自由基的分泌，促使空泡的形成介導胃上皮細胞凋亡。

在前期實驗中，課題組已經證實廣藿香醇具有體外抑制脲酶活性的作用^[12]，本實驗重點探討廣藿香醇是否具有抑制幽門螺桿菌脲酶活性并對脲酶相關基因表達的影響。與對照組相比，不管在酸性或中性的條件下，廣藿香醇20，10，5 mg·L^-1在與幽門螺桿菌其共孵育的1 h均沒有抑菌或殺菌作用，但20，10 mg·L^-1出現了明顯的脲酶活性抑制效果，說明廣藿香醇在酸性和中性的條件下都可以特異性抑制幽門螺桿菌脲酶的活性。為了探討其作用機制是否與抑制脲酶成熟過程有關，本實驗在不同的條件下檢測廣藿香醇對幽門螺桿菌的脲酶成熟過程所需相關基因表達變化的影響，結果顯示酸性條件下廣藿香醇對結構基因ureB的表達有顯著的抑制作用，而在中性條件下能明顯降低結構基因ureA的表達，同時不論條件如何，均可以不同程度的抑制脲酶輔酶基因ureE，ureH，鎳離子轉運基因nixA和尿素轉運基因ureI的表達，其中以廣藿香醇20，10 mg·L^-1作用更加明顯；因此表明廣藿香醇具有抑制幽門螺桿菌脲酶活性，可能不僅通過影響脲酶結構基因ureA和ureB的表達，而且與抑制脲酶輔酶基因ureE，ureH以及鎳離子轉運基因nixA，從而阻斷鎳離子轉運入脲酶前體的活性中心的途徑，抑制其成熟有關；同時抑制尿素轉運基因ureI，減少尿素與脲酶的接觸，進而抑制其分解作用。

鑒于活化后的脲酶在幽門螺桿菌致病過程的重要作用，廣藿香醇不僅作為植物源性的化合物具有較低的毒性^[13]，且具有下調與Ni²⁺轉運的脲酶相關基因表達，阻斷脲酶成熟過程，從而高選擇性抑制其脲酶活性的作用。研究顯示，Ni²⁺及相關輔助蛋白對脲酶活性極其重要，阻斷脲酶活性位點上的Ni²⁺與脲酶亞基的結合能有效抑制脲酶活性^[14]，因此繼續對廣藿香醇進行深入的結構改造及構效關系研究，有可能開發成新一代的脲酶抑制劑，為從中藥中研發抗幽門螺桿菌感染及相關疾病的創新藥物奠定重要的基礎。

[參考文獻]

[1]Bernard M， Josenhans C. Pathogenesis of Helicobacter pylori infection[J]. Helicobacter， 2014， 19（s1）： 11.

[2]范竹萍，丁佳.幽門螺桿菌的治療現狀與進展[J]. 世界臨床藥物，2013，28（12）：727.

[3]Kosikowska P， Berlicki L. Urease inhibitors as potential drugs for gastric and urinary tract infections： a patent review[J]. Expert Opin Ther Pat， 2011， 21（6）： 945.

[4]Smolka A J， Backert S. How Helicobacter pylori infection controls gastric acid secretion[J]. J Gastroenterol， 2012， 47（6）： 609.

[5]Follmer C. Ureases as a target for the treatment of gastric and urinary infections[J]. J Clin Pathol， 2010， 63（5）： 424.

[6]Sachs G， Scott D R， Wen Y. Gastric infection by Helicobacter pylori[J]. Curr Gastroenterol Rep， 2011， 13（6）： 540.

[7]王俊華， 符紅. 廣藿香揮發油化學成分氣質聯用技術分析[J]. 時珍國醫國藥， 2000（7）：579.

[8]謝建輝. 廣藿香醇抗幽門螺桿菌相關性胃炎機理研究[D]. 廣州：廣州中醫藥大學， 2014.

[9]Dunn B E， Campbell G P， Perez-Perez G I， et al. Purification and characterization of urease from Helicobacter pylori[J]. J Biol Chem， 1990，265（16）：9464.

[10]Fong Y H， Wong H C， Yuen M H， et al. Structure of UreG/UreF/UreH complex reveals how urease accessory proteins facilitate maturation of Helicobacter pylori urease[J]. PLoS Biol， 2013，11（10）：e1001678.

[11]Voland P， Weeks D L， Marcus E A， et al. Interactions among the seven Helicobacter pylori proteins encoded by the urease gene cluster[J]. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol， 2003，284（1）：G96.

[12]Yu X D， Xie J H， Wang H Y， et al. Selective antibacterial activity of patchouli alcohol against Helicobacter pylori based on inhibition of urease[J]. Phytother Res， 2015， 29（1）：67.

[13]何景進， 彭紹忠， 謝慶鳳，等. 廣藿香醇的急性毒性研究[J]. 時珍國醫國藥， 2012， 23（2）：274.

[14]Modolo LV， de Souza A X， Horta L P， et al. An overview on the potential of natural products as ureases inhibitors： a review[J]. J Adv Res， 2015， 6（1）： 35.

[責任編輯 張寧寧]