艾塞那肽對高糖所致新生乳鼠心肌細胞鈣信號紊亂的調控作用

陳澤龍，余懷新，陳淑娟，劉君英，劉文娟，鄧建新，汪新宇，閻德文

(1深圳市第二人民醫院，廣東深圳518035；2深圳大學醫學院)

艾塞那肽對高糖所致新生乳鼠心肌細胞鈣信號紊亂的調控作用

陳澤龍1，余懷新1，陳淑娟1，劉君英1，劉文娟2，鄧建新1，汪新宇1，閻德文1

(1深圳市第二人民醫院，廣東深圳518035；2深圳大學醫學院)

目的 觀察GLP-1類似物艾塞那肽(EX-4)對高糖所致新生乳鼠心肌細胞鈣信號紊亂的調控作用，探討GLP-1的心臟保護機制。方法 分離新生乳鼠心肌細胞，培養24 h后隨機分為對照組、高糖組和高糖+EX-4組，分別加入25 mmol/L甘露醇、25 mmol/L葡萄糖、25 mmol/L葡萄糖+10 nmol/L EX-4，繼續培養24 h。使用激光共聚焦顯微技術檢測各組心肌細胞自發鈣火花發放頻率、場刺激鈣瞬變幅度、鈣庫容量；使用膜片鉗技術記錄L型鈣通道電流。結果 對照組、高糖組、高糖+EX-4組的心肌細胞自發鈣火花發放頻率分別為(1.35±0.07)、(3.86±0.27)、(1.99±0.15)個/(μm·s)，場刺激鈣瞬變幅度鈣瞬變幅度分別為3.95±0.08、3.34±0.07、4.09±0.12，鈣庫容量分別為4.95±0.18、3.26±0.09、4.59±0.15，10 mV時的L型鈣通道電流密度分別為-12.46±0.58、-11.28±0.55、-13.09±0.64,高糖組心肌細胞鈣火花發放頻率、鈣瞬變幅度較對照組升高，鈣庫容量、電流密度較對照組降低(P<0.05或<0.01)，高糖+EX-4組鈣火花發放頻率、鈣瞬變幅度較高糖組降低，鈣庫容量、電流密度較高糖組升高(P<0.05或<0.01)，與對照組比較無統計學意義。結論 EX-4能夠增強心肌細胞L型鈣通道電流，減少肌漿網鈣漏流，從而有效糾正高糖所致心肌細胞鈣調控紊亂，降低高糖所致心肌損傷。

艾塞那肽；心肌細胞；高血糖；鈣火花；鈣瞬變幅度；L型鈣通道電流；激光共聚焦顯微技術

糖尿病是心血管疾病的重要危險因子之一。高血糖作為一個獨立的危險因子，可直接引起心肌損傷，且不依賴于血管疾病[1]。胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)是由人胰高血糖素基因編碼，并由腸道L細胞分泌的一種肽類激素。GLP-1具有促進葡萄糖誘導的胰島素分泌、降低血糖水平、減輕體質量等作用，但其在生物體內的半衰期短。GLP-1類似物艾塞那肽(EX-4)具有與GLP-1相同的作用，而且作用時間更長，能夠更好地控制血糖[2]。近年研究報道，EX-4具有心肌保護作用，但具體機制尚不完全清楚[3，4]。心肌細胞對鈣離子具有調控作用，保持細胞內鈣離子的動態平衡，從而維持細胞正常的舒縮功能。一旦鈣離子的動態平衡被打亂，心臟功能甚至結構都可能發生異常。多種疾病模型可顯著增加心肌細胞自發鈣火花頻率，降低肌漿網鈣庫容量水平，最終降低單細胞收縮期鈣瞬變大小和收縮幅度，引起心臟功能障礙[5]。2014年12月～2015年12月，我們采用倒置共聚焦顯微鏡線掃描方式研究高糖對心肌細胞鈣信號的影響，以及EX-4對高糖引起的鈣信號紊亂的調控作用?，F報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 SD新生大鼠，1～3日齡。EX-4注射液(美國Baxter Pharmaceutical Solutions LLC產品)；HEPES、蛋白酶XIV(美國Sigma公司)，Ⅱ型膠原酶(美國Worthington公司)，鈣熒光指示劑Fluo-4 AM(美國Invitrogen公司)，其余為國產分析純。LSM-780型倒置共聚焦顯微鏡(德國卡爾蔡司)，微量多管道給藥系統(華中科大儀博生命科學儀器)，YC-2型電子刺激器(成都儀器廠)，EPC10膜片鉗系統(德國HEKA公司)。

1.2 心肌細胞的分離與培養 采用胰蛋白酶消化的方法分離乳鼠心肌細胞。取乳鼠開胸，快速取出心臟，置于冰冷的PBS緩沖液中。取心尖部組織剪成1 mm3碎塊，加入胰蛋白酶消化。棄上清，剩余組織塊加入混合消化酶(0.08%胰蛋白酶和0.04%～0.06%Ⅱ型膠原酶等量混合)，37 ℃水浴消化，將各次消化制成的細胞懸液合并后，通過150目孔徑的不銹鋼網濾過。將細胞懸液接種于直徑60 mm培養板中，采取差速法貼壁心肌細胞,37 ℃，5% CO2培養箱中孵育1 h，分離純化心肌細胞。將純化后的細胞按0.8×105～1.0×105/m2接種于直徑35 mm培養皿中。

1.3 心肌細胞的分組與處理 將細胞隨機分成對照組、高糖組、高糖+EX-4組，分別給予甘露醇25 mmol/L、25 mmol/L葡萄糖、10 nmol/L EX-4+25 mmol/L葡萄糖培養24 h。

1.4 心肌細胞自發鈣火花發放頻率檢測 將培養后的心肌細胞與Fluo-4 AM室溫避光共孵育10 min，洗去多余的熒光染料，置于倒置共聚焦顯微鏡系統的載物臺上，臺氏液灌流細胞。40倍鏡下采用相同的放大倍數、線掃描方式進行采集圖像信號，采樣速率為3.84 ms/line，共采集1 000條線，激發光波長為488 nm，收集波長505 nm以上的發射光。以鈣火花發放個數除以采樣時間計算鈣火花發放頻率。

1.5 心肌細胞收縮期鈣瞬變幅度檢測 將加載好熒光染料的細胞置于Zeiss LSM-780倒置共聚焦顯微鏡系統的載物臺上，臺氏液灌流細胞。用線掃描方式采集圖像數據，采樣速率為3.84 ms/line。使用YC-2型電子刺激器給予細胞1 Hz、10 V的場刺激，細胞隨刺激節律收縮，實時鈣熒光強度隨細胞節律性收縮而發生節律性變化，待鈣熒光強度平穩變化后開始記錄實時鈣熒光變化。數據保存后再分析，本底熒光記為F0，熒光最大值記為F，鈣瞬變幅度=(F-F0)/F0。

1.6 心肌細胞鈣庫容量檢測 將加載好熒光染料的細胞置于共聚焦顯微鏡系統的載物臺上，通過快速微量多管道給藥系統在待測量的心肌細胞旁邊給予20 mmol/L咖啡因連續刺激，清空肌漿網內鈣庫，直到記錄完畢。采用線掃描方式采集圖像數據，本底熒光記為F0，熒光最大值記為F，鈣庫容量=(F-F0)/F0。

1.7 心肌細胞L型鈣通道電流檢測 從培養箱取出細胞，用細胞外液洗3次去除培養基，換上細胞外液后把細胞置于倒置顯微鏡上，選取狀態好的單細胞進行實驗。記錄L型鈣通道電流的細胞外液為(mmol/L)：NaCl 137、KCl 5.4、NaH2PO41.2、MgCl21.2、葡萄糖10、HEPES 20、TTX、0.02，pH 7.4。電極內液(mmol/L)：CsOH 120、Aspartate 120、MgCl21、MgATP 4、HEPES 10、EGTA 5、TEA-Cl 20，CsOH調整pH至7.2，電極充以電極內液，入水后阻抗為2～5 MΩ。采用EPC-10放大器，以全細胞記錄方式記錄L型鈣通道電流和細胞電容，電流大小(pA)和電容(pF)應用Clampfit10.0程序分析處理，以pA/pF計算電流密度。

2 結果

2.1 各組細胞自發鈣火花發放頻率比較 對照組、高糖組、高糖+EX-4組細胞自發鈣火花發放頻率分別為(1.35±0.07)、(3.86±0.27)、(1.99±0.15)個/(μm·s)。高糖組鈣火花頻率較對照組增加，高糖+EX-4組較高糖組降低，高于對照組(P<0.05或<0.01)。

2.2 各組細胞收縮期鈣瞬變幅度比較 對照組、高糖組、高糖+EX-4組細胞收縮期鈣瞬變幅度分別為3.95±0.08、3.34±0.07、4.09±0.12。高糖組鈣瞬變幅度較對照組降低(P<0.05)，高糖+EX-4組較高糖組升高(P<0.05)，與對照組比較無統計學差異(P>0.05)。

2.3 各組心肌細胞鈣庫容量比較 對照組、高糖組、高糖+EX-4組心肌細胞鈣庫容量分別為4.95±0.18、3.26±0.09、4.59±0.15。高糖組鈣庫容量較對照組降低,高糖+EX-4組較高糖組增加(P均<0.01)，高糖+EX-4組仍低于對照組(P<0.05)。

2.4 各組心肌細胞L型鈣通道電流密度比較 電流-電壓曲線顯示，電流呈典型的倒鐘型曲線，各組電流峰值在10 mV。對照組、高糖組、高糖+EX-4組在10 mV時的電流密度分別為-12.46±0.58、-11.28±0.55、-13.09±0.64。高糖組電流密度低于對照組，高糖組+EX-4組較高糖組升高(P<0.01)，與對照組相比無統計學差異。

3 討論

糖尿病心肌病是造成糖尿病合并心血管疾病患者死亡的重要原因。高糖可致活性氧、活性氮等自由基升高，造成心肌細胞氧化應激損傷，從而引起糖尿病心肌病的發生。EX-4是以雙激素缺陷為靶向的新型降糖藥物。EX-4為腸促胰素類似物，其作為GLP-1受體激動劑，可與GLP-1受體結合，發揮類GLP-1的作用從而降低血糖。研究發現，EX-4具有心血管保護作用，能改善內皮細胞功能、促進鈉排泄、改善缺血損傷的心肌，恢復心功能，減少心血管疾病的危險因素[6]。

在哺乳動物心肌細胞興奮-收縮耦聯過程中，細胞膜去極化激活電壓依賴性鈣通道引起細胞外鈣離子內流，內流的鈣離子通過鈣-鈣釋放機制觸發肌漿網大量釋放鈣離子，胞內鈣離子濃度瞬間升高，引起細胞收縮[7]。隨后，胞質鈣離子通過肌漿網上的鈣泵回收，少量通過鈉-鈣交換排出胞外，引起細胞舒張。因此，心肌細胞對鈣離子復雜而又精細的調控，使得細胞內鈣離子保持動態平衡，從而保證細胞正常的舒縮功能。一旦鈣離子的動態平衡被打亂，心臟功能甚至結構都可能發生異常。研究表明，長期高糖血癥導致心肌細胞能量代謝異常通路激活、氧化應激壓力增加和線粒體功能異常，引起心肌細胞鈣超載，即靜息期胞質鈣離子濃度升高，可能是導致心肌功能障礙的重要原因[8，9]。

心肌細胞收縮期的鈣主要來自肌漿網鈣庫，而肌漿網鈣主要經Ryanodine受體(RyR)通道釋放到胞質。既往研究認為，收縮期RyR開放不足會造成肌漿網鈣釋放減少，心肌收縮力下降。而舒張期RyR活動對心臟功能的影響直到近年才逐漸被認識[10，11]。正常心肌細胞舒張期RyR通道主要處于關閉狀態，自發性鈣火花頻率較低，有利于維持正常的肌漿網鈣庫容量。而糖尿病模型大鼠離體心肌細胞舒張期RyR活性增強、異常開放，自發鈣火花發放頻率顯著增加，肌漿網鈣漏流增加[12]。肌漿網鈣漏流的一個直接后果是引起肌漿網鈣庫部分耗竭，收縮期細胞內鈣釋放不足，導致收縮期鈣瞬變幅度降低，心肌收縮力降低。與此同時，肌漿網鈣漏流引起的心肌細胞靜息期胞質鈣濃度升高(鈣超載)，進一步損傷心肌細胞。我們的前期研究發現，高血糖及AGEs可以增加肌漿網RyR受體對鈣離子的敏感性，心肌細胞舒張期自發鈣火花發放頻率顯著升高，鈣火花介導的肌漿網鈣漏流增加，最終導致鈣庫容量水平下降，鈣瞬變幅度下降；抑制晚期糖基化終產物受體能顯著減少心肌細胞鈣火花的頻率，對心功能具有較好的保護作用[13]。在本研究中，高糖組的自發鈣火花頻率增加，導致肌漿網鈣庫容量水平部分耗竭，最終降低心肌細胞舒張期鈣瞬變幅度。EX-4減少高糖引起的肌漿網鈣漏流，恢復鈣庫容量，減弱高糖所致的細胞損傷，從而起到保護心功能的作用。這與體外培養的細胞系實驗結果吻合，在體外培養的HL-1心肌細胞系中，GLP-1類似物利拉魯肽可以明顯改善正常培養HL-1細胞的鈣瞬變幅度，改善肌漿網鈣庫容量[14]。這些研究結果提示，鈣火花介導的肌漿網鈣漏流可能是糖尿病心肌病發生的重要機制。

在心肌細胞中，舒張期鈣瞬變幅度不僅與鈣釋放單元有關，還與觸發信號——L型鈣通道電流有密切的聯系，L型鈣通道電流約占鈣釋放的10%。研究顯示，在大動物如犬的心室肌細胞中，GLP-1通過激活依賴性蛋白激酶A通路顯著增加增強心臟L型鈣電流，延長動作電位時程，從而起到正性心肌的作用[15，16]。本研究發現，EX-4治療后可以增加乳鼠心肌細胞L型鈣通道電流密度，使興奮-收縮耦聯過程中的觸發信號增強，增加鈣瞬變幅度；表明EX-4在減少鈣漏流的同時增強觸發信號，從而發揮心肌組織的保護作用。

綜上所述，GLP-1類似物EX-4能夠通過增強心肌細胞鈣電流，減少肌漿網鈣漏流，穩定心肌局部鈣信號，起到良好的心肌保護作用，對延緩糖尿病心肌病的發展具有重要意義，為糖尿病心肌病的防治提供了新的思路。

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Regulating effect of exenatide on disorder of calcium signal in neonatal rat cardiomyocytes induced by high glucose

CHENZelong1,YUHuaixin,CHENShujuan,LIUJunying,LIUWenjuan,DENGJianxin,WANGXinyu,YANDewen

(1SecondPeople'sHospitalofShenzhen,Shenzhen518035,China)

Objective To investigate the regulating effect of GLP-1 analogue exenatide (exenatide-4, EX-4) on the disorder of calcium signal in neonatal rat cardiomyocytes induced by high glucose and the cardioprotective mechanism.Methods The neonatal rat cardiomyocytes were isolated and cultured for 24 h, and then were randomly divided into 3 groups: the control group, high glucose group and high glucose +EX-4 group which were separately treated with 25 mmol/L mannitol, 25 mmol/L high glucose and 25 mmol/L high glucose+10 mmol/L EX-4. The frequency of spontaneous Ca2+spark in cadiomyocyte, field-stimulated calcium transient amplitude and calcium storage capacity were detected by laser scanning confocal microscopy. L-type calcium channel current was recorded by using patch-clamp technique.Results The frequencies of spontaneous Ca2+spark in cadiomyocytes of the control group, high glucose group and high glucose+EX-4 group were (1.35±0.07), (3.86±0.27) and (1.99±0.15)/(μm·s), respectively. Field-stimulated calcium transient amplitude was 3.95±0.08, 3.34±0.07 and 4.09±0.12. The calcium storage capacities were 4.95±0.18, 3.26±0.09 and 4.59±0.15, respectively. L-type calcium channel current density at 10 mV were -12.46±0.58, -11.28±0.55, and -13.09±0.64. In the high glucose group, the frequency of Ca2+spark and the Ca2+transient amplitude were higher than those of the control group (P<0.05 orP<0.01), and calcium storage capacity and L type calcium current density were lower than those in the control group (P<0.05 orP<0.01). In the high glucose+EX-4 group, the frequency of Ca2+spark and the amplitude of Ca2+transient were higher than those of the high glucose group (P<0.05 orP<0.01), and calcium storage capacity and L type calcium current density were higher than those of the high glucose group (P<0.05 orP<0.01), while there was no statistically significant difference as compared with those of the control group. Conclusions EX-4 can increase L-type Ca2+current in cardiomyocytes, and reduce the Ca2+leakage current in the plasma, thus effectively correcting the disorder of Ca2+regulation in cardiomyocytes induced by high glucose. Therefore, EX-4 has good myocardial protective effect on patients with diabetes mellitus.

exenatide; cardiomyocytes; hyperglycemia; calcium sparks; calcium transient amplitude; L type calcium channel current; laser scanning confocal microscopy

國家自然科學基金資助項目(31400982)；深圳市科技計劃項目(JCYJ20140416180300394,JCYJ20150330102720148,JCYJ20140418182819136)。

陳澤龍(1975-)，男，副主任醫師，主要研究方向為糖尿病心臟病的臨床治療。E-mail: czlsz@139.com

閻德文(1964-)，男，博士，教授，主要研究方向為糖尿病心肌病的發病機制。E-mail: yandw963@126.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.06.006

R542.2

A

1002-266X(2017)06-0020-04

2016-11-07)