人咬肌內注射A型肉毒毒素后組織形態學觀察

朱順文 王君 馬昊 徐國棟 馬福順

人咬肌內注射A型肉毒毒素后組織形態學觀察

朱順文1王君1馬昊2徐國棟2馬福順1

目的 觀察人咬肌內注射A型肉毒毒素后咬肌纖維的組織形態學改變。方法 自2011年4月至2015年10月，收集60例雙側下頜骨肥大伴咬肌肥大患者的左側和右側咬肌標本，共120份。將60份未注射A型肉毒毒素的咬肌標本作為對照組，60份已注射A型肉毒毒素的咬肌標本作為實驗組。兩組標本均行石蠟切片和HE染色，光鏡下觀察兩組咬肌纖維的基本結構，測量其橫截面面積，并進行統計學分析。結果 光學顯微鏡觀察，未發現兩組咬肌纖維的基本結構發生改變，兩組咬肌纖維橫截面面積的差異具有統計學意義（P＜0.05）。咬肌纖維橫截面面積在第12周時減小程度最大，之后減小趨勢放緩，第24周時，與第12周時的面積基本一致。結論 A型肉毒毒素能誘導人咬肌萎縮，在注射后第12周時萎縮程度最大，之后無明顯變化。

A型肉毒毒素；咬肌肌纖維；咬肌肥大；肌纖維橫截面面積

良性咬肌肥大是一種尚未明確具體發病機制的常見臨床現象[1]。其以下頜角區及附近軟組織膨大，伴或不伴有局部疼痛為特點[2]，嚴重肥大者可導致面部輪廓畸形、不對稱。當前良性咬肌肥大的臨床治療方式有手術治療、藥物治療、射頻治療等，但各有優缺點。A型肉毒毒素的咬肌內注射治療通常被認為是一種有效、安全性高、不良反應小的低侵襲性療法[3]，被廣泛應用于臨床。濰坊醫學院收集60例雙側下頜骨肥大伴咬肌肥大患者的咬肌標本，觀察并分析了人咬肌內注射A型肉毒毒素后咬肌肌纖維的組織形態學改變?，F報道如下。

1 實驗材料

1.1 標本來源 咬肌標本來源于自2011年4月至2015年10月行口內入路下頜骨咬肌部分切除術的60例雙側下頜骨肥大伴咬肌肥大患者，共120份（每例患者左、右側各留取標本1份）。男性7例（14份），女性53例（106份）；年齡17～48歲，平均（23.5±5.5）歲。標本的采集部位為近咬肌粗窿1/3處深層咬肌，切取標本量至保留該區域1/3～1/2咬肌，切取的咬肌標本均在術后經4%中性緩沖甲醛液及時固定。全部患者均無其他疾病，且均獲得患者的知情同意。

1.2 試劑與儀器 4%中性緩沖甲醛液、二甲苯、乙醇、中性樹膠封片劑、HE染色試劑盒均購自北京索萊寶公司；A型肉毒毒素購自中國蘭州生物制品研究所；Leica EG1150H石蠟包埋機、Leica RM2255石蠟切片機（德國LEICA公司）；Olympus BX-51正置光學顯微鏡、Olympus DP73數碼照相機、Cell Sens Dimension圖像分析系統（日本OLYMPUS公司）。

2 實驗方法

2.1 實驗分組 將未行A型肉毒毒素注射治療的患者作為對照組，已行A型肉毒毒素注射治療的患者作為實驗組，每組60份。實驗組中，根據患者最后一次注射A型肉毒毒素距手術取材的間隔時間分為4、8、12、16和24周組。兩組咬肌標本均在相同條件和環境下，行石蠟切片、HE染色及組織形態學觀察，并對各組咬肌肌纖維的橫截面面積進行測量及收集數據。

2.2 咬肌石蠟切片及HE染色 取出經4%中性緩沖甲醛液固定的咬肌，將咬肌標本平置于取材板上，橫切一塊大小約為0.5 cm×0.5 cm×0.2 cm的咬肌。將切好的咬肌標本用紗布袋包裹，流水沖洗12 h[4]，再經70%、80%、90%、95%、100%乙醇由低濃度至高濃度的順序分別脫水1 h，經二甲苯透明后，將咬肌標本置于石蠟包埋機中浸蠟，最后經石蠟包埋冷卻后制備成石蠟組織塊。將石蠟組織塊置于冰上及時進行連續切片（切片厚度為4 μm），每個石蠟組織塊制作3張石蠟切片，每張切片進行HE染色。

2.3 測量咬肌肌纖維的橫截面面積 全部石蠟切片在相同條件和環境下經過HE染色后，用Olympus BX-51正置光學顯微鏡觀察，采用Cell Sens Dimension圖像分析系統軟件測量兩組咬肌肌纖維的橫截面面積。選取每例患者左側和右側咬肌標本中染色效果好且視野清晰的切片，400倍光學顯微鏡下隨機取5個視野，測量每個視野內全部咬肌肌纖維的橫截面面積，取其平均值。

2.4 統計學處理 采用SPSS 22.0軟件進行統計學分析。兩組咬肌肌纖維橫截面面積的數值均以±s表示，兩組的差異比較采用U檢驗，實驗組不同時間取材間隔的左側和右側咬肌肌纖維橫截面面積的整體比較均采用多因素方差分析，實驗組組間比較采用snk-q檢驗，檢驗水準α=0.05，P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 兩組咬肌肌纖維的變化 經Cell Sens Dimension彩色圖像分析系統軟件分析后，顯示實驗組較對照組咬肌肌纖維橫截面面積明顯減小。兩組數據進行統計學分析，肌纖維橫截面面積的差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 兩組咬肌肌纖維的橫截面積 μm2

3.2 HE染色組織學觀察 實驗組與對照組的咬肌肌纖維相比，明顯減小。兩組咬肌肌纖維均具有高度相似的基本組織結構，且肌纖維排列整齊，咬肌肌纖維細胞均結構完整，未見變性、水腫、壞死等病理改變（圖1）。

3.3 A型肉毒毒素注射4、8、12、16、24周后咬肌肌纖維橫截面面積的變化 注射A型肉毒毒素后，人咬肌肌纖維的橫截面面積會發生不同程度的減小。隨著時間的推移，咬肌肌纖維的減小程度逐漸增大，第12周時最大，此后減小趨勢逐漸平緩;第24周時，咬肌肌纖維橫截面稍有增大;但與第12周相比，差異無統計學意義（P＞0.05，圖1）。實驗組不同時間間隔的咬肌肌纖維橫截面面積的整體比較，差異有統計學意義（P＜0.05，表2）。實驗組組間數據的分析比較發現，第4周與第8周、第12周與第16周、第16周與第24周右側咬肌肌纖維橫截面面積的差異無統計學意義（snk-q和P值分別為3.75和0.17、9.33和0.06、3.22和0.22）；第8周與第12周右側咬肌肌纖維橫截面面積的差異有統計學意義（snk-q值為22.35，P＜0.05）；第4周與第8周、第12周與第16周、第16周與第24周左側咬肌肌纖維橫截面面積的差異無統計學意義（snk-q和P值分別為4.23和0.15、7.66和0.06、2.77和0.26）；第8周與第12周左側咬肌肌纖維橫截面面積的差異有統計學意義（snk-q值為20.58，P＜0.05），見圖2。

表2 實驗組不同間隔標本的咬肌肌纖維橫截面面積

4 討論

圖1 兩組人咬肌肌纖維的HE染色（×400） a.對照組 b.實驗組A型肉毒毒素注射后4周 c.實驗組A型肉毒毒素注射后8周 d.實驗組A型肉毒毒素注射后12周 e.實驗組A型肉毒毒素注射后16周 f.實驗組A型肉毒毒素注射后24周

圖2 實驗組咬肌肌纖維橫截面面積的變化

良性咬肌肥大的臨床治療方法多種，以手術切除、藥物注射治療、射頻治療為主。由于手術切除肥大咬肌后會給患者留下切口創傷以及瘢痕[5]，且在手術過程中，還可能造成神經、血管損傷，導致血腫、感染等并發癥發生，常令患者難以接受。Huang等[6]研究認為，射頻治療咬肌肥大的效果顯著，但局限于射頻治療適應證的選擇較為嚴格，且治療技術尚不成熟，不能在臨床上大范圍推廣。A型肉毒毒素注射治療具有有效率高、不良反應小等優點，得到了患者的普遍認可。1980年，AB Scott將A型肉毒毒素應用于眼肌痙攣的治療。1992年，JD Carruthers和JA Carruthers首次將A型肉毒毒素應用于眉間區皺紋的美容治療。1994年，AP Moore和GDWddo將A型肉毒毒素用于治療良性咬肌肥大。近年來，國內外學者將A型肉毒毒素應用于治療咬肌肥大、腓腸肌肥大等良性骨骼肌肥大，并取得了滿意的效果[7-9]。

目前，國內外學者的研究多集中在A型肉毒毒素的臨床治療觀察上，對于注射A型肉毒毒素后組織形態學的觀察也是以動物為研究對象而進行的研究[10]。由于動物跟人類的解剖和功能差異較大，不能真實地反映A型肉毒毒素注射后對人咬肌的影響，研究結果具有一定的局限性。因此，進行以人咬肌為研究對象的研究很必要。本研究以人咬肌為研究對象，觀察人咬肌內注射A型肉毒毒素后，咬肌肌纖維橫截面面積的改變情況，以及分析了A型肉毒毒素注射時間的不同對人咬肌肌纖維的影響。A型肉毒毒素是由厭氧型肉毒梭狀芽孢桿菌產生的高強效神經毒素，通過作用于運動神經末梢肌肉接頭處，裂解破壞此處的膜聯系/跨膜蛋白[11]，阻斷神經遞質乙酰膽堿的釋放和神經沖動的傳導，引起肌肉松弛性麻痹，導致肌肉萎縮。研究過程中發現，在A型肉毒毒素注射12周后，其誘導咬肌肌肉萎縮作用出現明顯的減弱，至注射后第24周時，已基本無誘導咬肌肌肉萎縮作用，推測這可能與A型肉毒毒素的化學去神經作用有關[12]。已有研究證實，在注射A型肉毒毒素12周后，骨骼肌在原先萎縮的肌肉中會建立起不同程度的功能連結，這種功能連結主要是以神經發芽的方式來實現的[13]。當萎縮的肌肉再次獲得神經支配時，原先失去功能的神經末梢肌肉接頭將重新恢復神經沖動的傳遞，肌肉將不再萎縮。因此，本次研究過程中所得出的推測是成立的。

咬肌是骨骼肌的一種，咬肌肌纖維根據參與生物氧化代謝所需酶的不同主要分為快肌、慢肌纖維兩種類型[14]。本研究證實了A型肉毒毒素注射后能誘導人咬肌萎縮，但未研究A型肉毒毒素注射后引起何種類型的肌纖維發生萎縮。我們將進一步重點研究人咬肌在注射A型肉毒毒素后何種類型肌纖維發生組織形態學改變，旨在為良性咬肌肥大等骨骼肌肥大的A型肉毒毒素治療提供科學指導。

綜上所述，本研究觀察了人咬肌內注射A型肉毒毒素后其組織形態學的改變，證實了A型肉毒毒素誘導咬肌萎縮的最佳作用時間為注射后3個月，最長有效時間可持續至注射后6個月，為臨床上使用A型肉毒毒素治療良性咬肌肥大等骨骼肌肥大提供了重要的依據。

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本文引用格式：朱順文,王君,馬昊,等.人咬肌內注射A型肉毒毒素后組織形態學觀察[J].中國美容整形外科雜志,2017,28(3):141-144. DOI:10.3969/j.issn.1673-7040.2017.03.006.

關于圖的要求

圖包括曲線圖、示意圖、照片等。每一圖應有簡短確切的題名，連同圖號置于圖下。必要時，應將圖上的符號、標記、代碼，以及實驗條件等，用簡練的文字，橫排于圖的下方，作為圖例說明。

曲線圖的縱橫坐標必須標注“量、標準規定符號、單位”。此三者只有在不必要標明(如無量綱等)的情況下方可省略。坐標上標注的量的符號和縮略詞必須與正文中一致。

照片圖要求主題和主要顯示部分的輪廓清晰，層次分明，反差適中，無雜亂背景。人體照片只需顯示必要部位，但應能看出是人體的哪一部分。顏面或全身照片，若無須顯示眼部和陰部，應說明需遮蓋。使用特定染色方法的顯微照片，應標明染色方法。顯微照片中使用的符號、箭頭或字母，應與背景有很好的對比度。涉及尺寸的照片上應該有表示目的物尺寸的標度。

Histomorphologic changes of masseter muscle after botulinum toxin A injection

ZHU Shun-wen,WANG Jun,MA Hao,XU Guo-dong,MA Fu-shun.(Weifang Medical University,Weifang 261042,China)

ObjectiveThe histomorphologic changes ofmasseter muscle after botulinum toxin A injection were observed.M ethodsFrom April 2011 toOctober 2015,60 patients with bilateral mandibular and masseter hypertrophy were involved in this study.There were a total of120 masseter muscle specimens.Among them,60 specimens without botulinum toxin A injection were selected as the control group,and the other 60 specimens,with botulinum toxin A injection,as the experimental group.Paraffin section and HE stainingwere performed in both two groups.Basic structure of the masseter muscle fiber was observed under light microscope and the cross-sectional area was measured.The data above were analyzed statistically.ResultsNo change of the basic structure of the masseter muscle fiber was found between the two groups.Compared to the control group,the cross-section area of the masseter muscle fiber decreased more significantly(P＜0.05).The cross-section area of the masseter muscle fiber reached a minimum at the 12th week and gradually recovered after that.No further changes were noticed after another 12-week interval.ConclusionMasseter muscle atrophied after Botulinum toxin A injection.The masseter muscle reached a minimum at the 12th week,and no obvious change occurred after that.

Botulinum toxin type A;Masseter muscle fibers;Masseteric hypertrophy;Cross-section area

MA Fu-shun,Email:fushunma@hotmail.com

2016-10-23）

10.3969/j.issn.1673-7040.2017.03.006

1.濰坊醫學院，山東 濰坊 261042；2.濰坊市人民醫院病理科，山東 濰坊 261042

馬福順，Email：fushunma@hotmail.com