阿爾茲海默癥血清多肽組生物標志物研究

孔祥怡++杜建時++馬明++徐金玲++李水明++王勇++趙晴

摘要 采用個體樣品單獨分析的方式分析， 比較9個健康對照者、10個阿爾茲海默癥（Alzheimer′s disease， AD）患者和12個認知功能障礙（Mild cognitive impairment， MCI）患者的血清多肽組分析結果， 以尋找潛在的AD病生物標志物。結果表明， 高強度的α2巨球蛋白肽段VGFYEDVMGR與AD病晚期階段密切相關， 而載脂蛋白 CⅢ、組蛋白12和組蛋白14的大量降解， 則與中早期AD和認知功能障礙相關聯；載脂蛋白 CⅢ和組蛋白1的降解肽段具有明顯的階梯序列特征， 但在不同樣本中的分布具有一定偶然性。AD病發展的晚期與中早期的血清多肽組特征不同， 這4種蛋白質的降解有可能成為AD病潛在的生物標志物。研究結果也證明了， 歸屬于纖維蛋白原α鏈、胸腺素β4和斑聯蛋白等蛋白質的肽段是所有血清樣本中的優勢肽段。本研究提出了利用血清多肽組學方法輔助診斷AD病的方法， 為臨床大規模驗證提供了依據和參考。

關鍵詞 多肽組；生物標志物；血清；阿爾茲海默癥；認知功能障礙

1引 言

阿爾茲海默癥（Alzheimer′s disease， AD）是一種與年齡相關的神經退行性疾病， AD病目前尚無法治愈和逆轉， 早期干預和診斷是延緩AD發生的重要途徑＼[1＼]。神經心理學量表測試、影像學檢查和生物標志物檢測是診斷AD病的3種主要方法＼[2＼]。生物標志物是能夠預測或反映特定生物過程變化的物質＼[3＼]， 目前公認的AD病生物標志物是腦脊液（CF）中淀粉樣蛋白Aβ42水平的下降和磷酸化tau蛋白水平的升高＼[4＼]。但是， 腦脊液檢測是有損分析， 作為一種常規性檢測很難普及， 而在血液、唾液和尿液等體液中尋找AD病的生物標志物， 具有取樣方便和無創傷性的優點， 其中以血液在臨床上最為常用。

Lista等＼[5＼]對基于質譜的AD病血液生物標志物進行了綜述， 匯總了約20種蛋白質的含量改變和氧化應激可成為AD病的生物標志物， 并強調AD等神經退行性疾病的分子水平上的改變在出現臨床癥狀的20年以前就可能發生。血液中tau 蛋白和Aβ42的含量很低， 不是理想的AD標志物， 但炎癥和免疫相關蛋白質與AD病關系密切＼[6＼]。在前期工作中， 本研究組利用iRAQ定量標簽技術對比AD病患者和年齡匹配對照組血清中的蛋白質， 發現了100A8等25種差異表達蛋白， 有可能成為潛在的AD血液生物標志物＼[7＼]。血液中磷脂類等小分子化合物也被用來預測AD?。躘8＼]。O′Bryant等＼[9＼]指出， 基于血液的AD生物標志物在過去十余年取得了顯著進展， 分析時間降低， 可接受性增強， 但重復性較差和缺少不同實驗室之間的交叉驗證制約了研究成果向醫學臨床的轉化。盡管血液中多種蛋白質被認為有望成為AD病生物標志物， 但目前尚未見AD病多肽組生物標志物的相關報道。

氧化石墨烯磷酸鑭納米磁性復合材料（LaGM）由石墨烯、LaPO4納米棒和Fe3O4納米粒子構成， 可快速富集生物樣品中的低豐度多肽＼[10＼]。在前期研究中， 本研究組利用該材料分離多肽， 建立了納升液相色譜高分辨串聯質譜分析的血清多肽組鑒定方法＼[11＼]。本研究采用單個樣本逐一分析的方式， 通過對比AD組、認知功能障礙組（Mild congnitive impairment， MCI）和健康對照組血清多肽組結果的差異， 從蛋白質異常降解的角度尋找潛在的AD病標志物， 為臨床診斷和藥效跟蹤等提供參考。

2實驗部分

21儀器與試劑

Eksigent nanoLCUltraM 2D 納升液相色譜系統、riple OF 5600 plus高分辨質譜儀、Protein Pilot 45軟件（美國AB CIEX公司）；真空冷凍干燥機（美國hermo avant公司）。

納升液相色譜流動相 A為01% 甲酸2% 乙腈， 流動相 B為01% 甲酸98%（V/V）乙腈；C18反相色譜捕集柱（100 μm × 3 cm， 3 μm， 150 ）、C18反相色譜分析柱（75 μm ×15 cm， 3 μm， 120 ， ChromXP Eksigent， 美國ciex公司）。所用試劑均為分析純或質譜純， 購于美國hermo公司。氧化石墨烯磷酸鑭納米磁性復合材料（LaGM）根據文獻＼[10＼]自行合成。所有臨床樣品來自吉林大學中日聯誼醫院， 符合人體樣品使用要求， 患者知情同意。

22多肽的分離和富集

血清樣本共31例， 每例取80 μL人血清樣品， 加入 500 μL去離子水， 與20 μL 30 mg/mL LaGM 復合材料混合， 1000 r/min振蕩10 min， 磁分離， 在沉淀中加入500 μL 水， 渦旋1 min， 振蕩5 min， 磁分離去掉上清液。在沉淀中加入20 μL 80% 乙腈+1% FA（V/V）的洗脫液， 渦旋1 min， 振蕩5 min， 磁分離， 收集上清液， 冷凍干燥。

23反相色譜riple OF質譜分析

將分離凍干的多肽樣品溶解于流動相A中， 在Eksigent nanoLCUltraM 2D系統上進行色譜分析。樣品溶液以2 μL/min的流速上樣到C18預柱（100 μm × 3 cm， 3 μm， 150 ）， 然后保持流速沖洗脫鹽10 min。分析柱是C18反相色譜柱（75 μm × 15 cm， 3 μm， 120 ， ChromXP Eksigent）， 梯度洗脫： 70 min內流動相B由5%升高至80% （V/V）。質譜分析采用ripleOF 5600系統結合納升噴霧Ⅲ離子源（AB CIEX， UA）， 噴霧電壓為24 kV， 氣簾氣壓為02 Mpa， 霧化氣壓為34 kPa， 加熱溫度為150℃， 質譜掃描方式為數據依賴采集模式。

24數據分析條件

質譜采集到的原始wiff圖譜文件， 采用Protein Pilot oftware v 45（AB CIEX， UA）軟件進行數據加工處理和檢索分析， 數據庫為Uniprot庫中的omo sapiens人種專一數據庫（包含20210條蛋白質序列， 2015年1月2日下載）， 檢索參數設置為非酶切， 檢索方式為徹底分析， 假陽性率控制為1% FDR。

3結果與討論

31血清多肽組的個體差異及共同特征

相比于串聯飛行時間質譜技術， 高分辨的四極桿飛行時間串聯質譜的碰撞能更高， 更易于鑒定非特異性酶切的肽段序列。例如， 纖維蛋白原α鏈的肽段FEKYKMADEAGEADEGKRGA由29個氨基酸構成， 但在本實驗中得到了幾乎互補連續的y、b離子序列， 還觀察到了苯丙氨酸、組氨酸和谷氨酸的亞胺離子m/z 12008， m/z 11007和m/z 10208（圖1）。

本研究共對9例健康對照者、10例AD病患者和12例認知功能障礙患者（MCI）的血清樣品進行了多肽組成分分析， 結果如表1所示。對照組中肽段數目最少為212條， 歸屬于40個蛋白質， 最多則為歸屬于130個蛋白質的1195條肽段；在AD和MCI組中鑒定到的肽段數目最少分別為261和406條， 蛋白質數目最少分別為48和65個蛋白質。而在AD組樣品中， 鑒定到的肽段數目最多為956條， 蛋白質數目最多為96個， 在MCI組中， 肽段和蛋白質數目最多分別為1095和123個?？傮w上， AD組和MCI組中的最高肽段數目約為最低數目的2倍， 而在9例健康對照組樣品中， 鑒定到的肽段數目和蛋白質數目則分別相差6倍和3倍。這些結果說明， 血清多肽組的個體差異很大， 如果利用混合樣品進行分析則不能發現這些差異。盡管如此， 來自于纖維蛋白原α鏈、胸腺素β4和斑聯蛋白等蛋白質的肽段在所有個體血清樣品中都為優勢肽段， 與前期研究結果一致＼[10＼]， 例如， 纖維蛋白原α鏈在全部31個血清樣本的28樣本個中鑒定分值排在第一位， 在另外3個樣本中排在第二位， 其特異性肽段的100條以上， 約占總檢出肽段數目的15%～40%。

總體而言， 在血清樣品中檢測到的肽段數目與其所歸屬的蛋白質數目具有正相關性， 但個體差異仍然較大。例如， 在對照組樣品6中鑒定到歸屬于86個蛋白質的593個肽段， 而在樣本4中， 測到了760個肽段， 但對應的蛋白質僅有69個； 在MCI和AD組樣品中也都存在蛋白質數目和肽段數目不是嚴格正相關的情況。健康對照組和AD組所檢出的平均肽段數目約為550條， 對應75種蛋白質， 而在MCI組中， 平均肽段和蛋白質數目則分別為710和88。以上結果表明， 無論是疾病組， 還是健康對照組樣品， 血清多肽組的鑒定數目都存在一定差異， 這是因為即使不考慮相同序列肽段的強度差異， 在定性分析的結果上也必然存在差異。既然在兩個對照組結果之間都存在差異， 可以推測， 不是一組對照組和疾病組樣品之間所有的多肽組差異都可作為潛在的生物標志物。例如， 存在大量階梯序列是血清多肽組的一個顯著特征， 這些肽段的結構具有相似性， 但它們在不同個體樣本中的分布具有隨機性。例如， 在對照組樣品1和2中， 含有序列KMADEAGEADEGKRGA的相同肽段有43條， 而含有該序列的不同肽段在樣品1中有6個， 在樣品2中有7個。同理， 隨機比較對照樣本1和AD樣本6的分析結果發現， 兩個樣本中也有10條共同肽段含有序列KMADEAGEADEGKRGA。因此， 比較兩個不同樣本的正常多肽組分析結果， 通常能找到一些相同肽段和不同肽段， 相同肽段在纖維蛋白原α鏈、胸腺素β4和斑聯蛋白等優勢蛋白中出現幾率更高。另一方面， 此結果也提示在尋找多肽組生物標志物時， 應盡量降低偶然因素的影響。在以上31個樣本中， 歸屬于纖維蛋白原α鏈的肽段在單個樣本中可測定到50條以上， 最多則接近300條。Noguchi等＼[12＼]從30例AD病患者和30例健康對照樣本血清中檢測到了157條總肽段， 根據離子強度分析， 發現其中60個肽段有強度差異， 但只鑒定了包括10條歸屬于纖維蛋白原α鏈的肽段在內的16條肽段的序列， 并據此認為一些定量強度在13倍以內的纖維蛋白原α鏈可以作為AD病生物標志物。但該研究未考慮其分析方法的局限性。

32蛋白質水平上血清多肽組標志物

前期結果表明， 如果不同樣品中同一蛋白或肽段的離子強度相差超過3 倍， 則可認為其含量具有差異＼[13＼]， 本研究綜合考慮相對定量和定性分析結果的差異， 利用離子強度和檢出肽段數目兩種指標衡量不同樣本血清多肽組結果的差異， 尋找潛在的AD病和認知功能障礙（MCI）生物標志物。結果表明， 載脂蛋白 CⅢ、α2巨球（A2M）蛋白、組蛋白12和組蛋白14在對照組和疾病組之間具有明顯差異， 它們的相對含量（離子強度）和肽段檢出數目的增加有可能成為潛在的生物標志物， 結果如表2所示。為了說明個體差異對結果的影響， 表2還列出了各個體樣本的血清多肽組的總離子強度和這4種蛋白質的肽段檢出數目。健康對照組、AD組和MCI組的總離子強度平均值分別為14×106， 24×106和24×106。在9個對照組血清樣本中， 載脂蛋白CⅢ等四種蛋白質的總離子強度普遍偏低， 總離子強度大多低于10×104， 例外的是對照5樣本中組蛋白14的總離子強度為21×104， 可能是因為個體差異所致。

α2巨球（A2M）蛋白在AD病理學中具有重要作用， 與AD相關的A2M基因的DNA多態性導致AD腦中淀粉樣斑塊的積累顯著增加＼[14＼]；也有研究表明， 血液中的A2M濃度與腦脊液中神經元損傷標志物的濃度相關， 較高的基線血清A2M濃度增加了男性患AD病的幾率＼[15＼]。在10例AD病人的血清樣本中， 有6例α2巨球蛋白的離子強度顯著增加， 而其它3種蛋白質的強度無明顯變化。值得注意的是， 以上6例AD病人的發病時間均超過4年， 智力減退癥狀和情感障礙已很明顯， 臨床上已不難診斷。因此， 尋找早期的認知功能障礙（MCI）階段的生物標志物更有意義。在其余的4例AD病和13例MCI血清樣本中， 有10例樣本的載脂蛋白CⅢ的總離子強度和肽段檢出數目顯著增加， 有14例伴隨著組蛋白12和組蛋白14的肽段檢出數目和離子強度的顯著增加。有研究指出， 血漿中低水平的載脂蛋白CⅢ會增加AD病風險， 是AD病的早期標志物， 認為該蛋白因結合β淀粉樣蛋白Aβ結合蛋白而含量降低＼[16＼]。但本研究結果表明， 載脂蛋白CⅢ蛋白質水平上含量的降低也可能由于其降解所致。組蛋白的去乙?；cAD病發病機理密切相關， 但組蛋白的降解與AD通過何種方式聯系目前尚不知曉。盡管如此， 本研究結果表明， 組蛋白12和14的降解是伴隨MCI和發病時間較短的AD病的大概率事件， 可能與AD病的發生發展過程相聯系， 但是在晚期AD病血清中很少能檢測到， 推測該蛋白的降解是人體的應激反應， 發病時間過長， 組蛋白降解的應激反應減弱， 但與α2巨球蛋白降解相關的應激反應加強增加。

33肽段水平上血清多肽組標志物的多樣性

通常， 根據不同樣品中相同肽段的強度差異或者有和無的區別可以確定潛在的肽段標志物， 但是在實際樣品中情況較為復雜。分別以載脂蛋白CⅢ和α2巨球蛋白為例進行說明。在多肽組分析結果中， 蛋白質總離子強度增加常伴隨檢出肽段數目的顯著增加。例如，在第10例AD病血清樣本中， 檢測到了36條歸屬于載脂蛋白CⅢ的肽段， 其中17條肽段列于表3， 這17條肽段可視為以肽段PEVRPAVAA和EAEDALLFMQGYMKAKA為基礎延伸出的兩類階梯序列。在一些對照組樣品中， 能檢測到肽段PEVRPAVAA或EAEDALLFMQGYMKA的類似階梯肽段， 但肽段數目通常較少， 而強度差別有時并不明顯， 即疾病組中載脂蛋白CⅢ強度的增加部分來自于檢出肽段的增加。實際上， 肽段的出現具有偶然性， 例如在有些AD樣本中檢測到的該系列的最短肽段為EAEDALLF， 而最長肽段為EAEDALLFMQGYMKAKAKDALVQEQVAQQA， 因此， 由于個體差異和肽段的多樣性， 以載脂蛋白CⅢ的降解增加做為生物標志物， 比某一特定肽段為潛在生物標志物更為穩健。

相比之下， α2巨球蛋白的肽段分布情況簡單得多。盡管其是血漿中分子量最大的蛋白質， 但檢出的肽段數目最多5條， 很多情況下為1條（結果見表2）， 并且均為VGFYEDVMGR， 而其它肽段均與該肽段大部分序列相同， 包括VGFYEDVM （oxidation）GR、FYEDVMGR、GPEGLRVGFYEDVMG、GFYEDVMGR和GPEGLRVGFYE等， 但它們的檢出數目較少， 并且離子強度低于該肽段一個數量級以上。因此， 可以認為α2巨球蛋白的最主要肽段是VGFYEDVMGR， 6名晚期AD患者α2巨球蛋白的總離子強度較高， 均是因為該肽段強度高所致。組蛋白12和14的肽段分布情況也較為復雜， 不像α2巨球蛋白一樣具有很強的規律性。組蛋白12和14在健康對照組血清樣本中的強度普遍較低， 而在所有MCI樣本和2例AD病血清中離子強度很高， 這可能與組蛋白1的功能相關。文獻＼[17＼]表明， 成年人大腦損傷后， 會向細胞外釋放組蛋白1， 而組蛋白1可通過線粒體損傷和凋亡來殺死神經元， 進而造成進一步的腦損傷和智力行為變化， 釋放出的組蛋白在體內降解后釋放入血液從而被檢測。由于組蛋白的釋放屬于腦損傷的應激反應， 因此， 在正常人血液中組蛋白肽段含量較低。 AD病的一個明顯特征是腦內能量代謝的障礙， 在晚期AD病人體內與組蛋白釋放相關的應激反應減弱， 幾乎檢測不到組蛋白1的降解肽段。因此， 組蛋白12和14有可能將MCI和晚期AD相區別， 并結合其它指標用于AD病的臨床前診斷。

4結 論

本研究發現α2巨球蛋白肽段VGFYEDVMGR與AD病的晚期階段密切相關， 而載脂蛋白CⅢ、組蛋白12和組蛋白14的大量降解與早期AD和認知功能障礙存在關聯。個體樣品的分析結果表明， 生物標志物的多肽組特征與臨床診斷結果之間可能并不完全一致， 例如， 部分AD病人的血漿多肽組學特征更接近MCI， 這可能是由于病人的智力表現與病理生理變化不完全同步所致。本研究進一步驗證了個體血清多肽組結果的差異性和共性， 證明纖維蛋白原α鏈、斑聯蛋白和胸腺素等蛋白質的肽段為血清中的優勢肽段。

References

1elkoe D J cience， 2012， 337： 1488-1491

2Perrin R J， Fagan A M， oltzman D M Nature， 2009， 461： 916-922

3Fagan A M， Xiong C J， Jasielec M ， Bateman R J， Goate A M， Benzinger L ci ransl Med， 2014， 226： 226-230

4Duits F ， Prins N D， Lemstraa A W， Pijnenburga Y A L， Bouwmana F ， eunissenb C E Alzheimers Dement， 2015， 11： 523-532

5Lista ， Faltraco F， Prvulovic D， ampel Prog Neurobiol， 2013， 101102： 1-17

6BIE LiZhan， NI Xiuhi Modern Journal of Integrated raditional Chinese and Western Medicine， 2014， 23（34）： 3867-3871

別立展， 倪秀石 現代中西醫結合雜志， 2014 ， 23（34）： 3867-3871

7hen L， Liao L L， Chen C， Guo Y， ong D L， Wang Y， Chen Y， Zhang K， Ying M， Li M， Liu Q， Ni J J Alzheimers Dis， 2017， 56（1）： 361-378

8 Mapstone M， Cheema A K， Fiandaca M ， Zhong X， Mhyre R， MacArthur L ， all W J， Fisher G Nat Med， 2014， 20（4）： 415-418

9O′Bryant E， Mielke M M， Rissman R A， Lista ， Vanderstichele ， Zetterberg ， Lewczuk P， Posner Alzheimers Dement， 2017， 13（1）： 45-58

10Cheng G， Wang Z G， Liu Y L， Zhang J L， un D ， Ni J Z Chem Commun， 2012， 48（82）： 10240-10242

11KONG XiangYi， I Kai， CONG LeLe， WANG Jing， JIANG LiJun， ONG XiaoYu， LI huiMing， WANG Yong， ZAO Qing Chinese J Anal Chem， 2017， 45（1）： 133-138

孔祥怡， 石 鍇， 叢樂樂， 王 靜， 蔣立軍， 洪曉愉， 李水明， 王 勇， 趙 晴 分析化學， 2017， 45（1）： 133-138

12Noguchi M， ato ， Nagai K， Utagawa I， uzuki I， Arito M， Iizuka N， uematsu N， Okamoto K， Kato ， Yamaguchi N， Kurokawa M Int J Geriatr Psychiatry， 2014 ， 29（8）： 808-818

13ONG XiaoYu， WANG ao， XU JinLing， LI huiMing， WANG Yong. Chinese J Anal Chem， 2016， 44（3）： 403-408

洪曉愉， 王 浩， 徐金玲， 李水明， 王 勇 分析化學， 2016， 44（3）： 403-408

14Kovacs D M Exp Gerontol， 2000， 35（4）： 473-479

15Varma V R， Varma ， An Y， ohman J， eddighi ， Casanova R， Beri A， Dammer E B， eyfried N ， Pletnikova O， Moghekar A， Wilson M R， Lah J J， O′Brien R J， Levey A I， roncoso J C， Albert M ， hambisetty M Mol Psychiatry， 2017， 22（1）： 13-23

16hih Y ， sai K J， Lee C W， hiesh C， Chen W ， Pai M C， Kuo Y M J Alzheimers Dis， 2014， 41（3）： 855-865

17Gilthorpe J D， Oozeer F， Nash J， Calvo M， Bennett D L， Lumsden A， Pini A F1000Res， 2013， 8（2）： 148