超聲波輔助提取藜麥多糖及其抑菌性與抗氧化性

徐瀾+郭晨晨+趙慧

摘要：為明確不同產地（山西省偏關縣、靜樂縣）藜麥種子的多糖提取率及其抑菌性、抗氧化性之間的差異，以蒸餾水為提取劑采用超聲波法輔助提取藜麥多糖，濾紙片法測定抑菌活性；采用消除DPPH自由基法測定水提多糖的抗氧化活性，并用維生素C作陽性對照。結果表明：藜麥種子在料液比為1 g ∶[KG-*3]10 mL時多糖提取率最高，且偏關縣藜麥的多糖提取率（2 094.5 μg/g）顯著高于靜樂縣藜麥的多糖提取率（1 781.5 μg/g）。藜麥多糖對DPPH自由基有清除能力，且隨著多糖質量濃度的增加而呈現增大趨勢。藜麥多糖對大腸桿菌有較強抑菌效果，但對金黃色葡萄球菌抑菌性較弱。

關鍵詞：藜麥；多糖；紙片擴散法；抑菌性；抗氧化性

中圖分類號： R282.2文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）11-0143-03[HS）][HT9.SS]

藜麥（Chenopodium quinoa Willd）是一年生的藜科雙子葉草本作物，原產于南美洲安迪斯山區。藜麥中含有大量的優質蛋白，且含量與肉類含量相當，含有全部8種人體必需氨基酸[1]。除此之外，藜麥中含有豐富的淀粉、脂肪、礦物質元素、維生素等。因此，藜麥被聯合國糧農組織（Food and Agriculture Organization of the United Nations，簡稱FAO）認為是唯一一種單體植物就能滿足人體基本營養需求的全類谷物[2]。藜麥有均衡營養、修復體質、增強機體功能、調節免疫和內分系統的作用，而且具有預防疾病、抗癌、抗衰老及抗氧化的功效，因此藜麥是減肥美容、減少人類慢性病的“功能食品”的優秀代表。

作為生命四大基本物質之一的高分子聚合物多糖，由醛基和酮基通過苷鍵連接，是動物、植物、微生物細胞的重要組成成分，具有抗腫瘤、抗氧化、抗凝血、免疫調節、降血糖和抗病毒等重要功能[3]，因此，從很多動植物中都可以提取到多糖，近幾年關于多糖的提取及其作用的報道也越來越多。目前為止，已有研究者利用不同方法對紅豆、木瓜、銀杏葉、枸杞、黃芪等提取了多糖，并研究它們的抑菌性及抗氧化性[4-8]。結果表明，紅豆多糖和木瓜多糖有抗氧化活性，枸杞多糖、黃芪多糖和水溶性大豆多糖有抑菌效果。藜麥中含有的多糖、多酚、黃酮等活性物質，具有很好的體外抗氧化活性和抑菌性。目前關于藜麥多糖提取方面的研究極少，未見關于藜麥多糖的抗氧化性及抑菌性的相關研究報道。

超聲波輔助提取固體樣品，利用超聲波作用液體時產生的空化作用和機械振動作用，使溶液內產生氣泡，增長并爆破壓縮，導致細胞壁結構破裂[8]。它是物理粉碎過程，伴隨產生熱效應和乳化作用，提高固體中多糖的提取率，具有節能、提取率高、節省提取時間的優點；但如果溫度過高，滲出的雜質也會增多，因此溫度不宜過高[9]。目前關于超聲輔助提取技術已成功應用于提取木瓜多糖、銀杏葉多糖等，但超聲輔助提取藜麥多糖的研究較少見。本試驗采用超聲波輔助提取藜麥多糖，研究其抗氧化性和抑菌性，對于藜麥在功能食品、化妝品、醫藥、生物農藥研發中的應用提供參考，并為藜麥天然抗氧化劑的開發提供依據。

1材料與方法

1.1材料與主要儀器

市售2個產地的藜麥種子（山西省忻州市偏關縣、靜樂縣）；DPPH（1，1-二苯基-2-苦肼基）：由西安沃爾森生物技術有限公司提供；試驗用水為蒸餾水。供試菌種：金黃色葡萄球菌、大腸桿菌，均由忻州師范學院生物系微生物實驗室提供。UV-2102C型紫外可見分光光度計，由上海儀電分析儀器有限公司提供；YXQ-LS-75G型立式壓力蒸汽滅菌鍋，由上海云泰儀器儀表有限公司提供；Supcre系列菌落計數/篩選/抑菌圈測量聯用儀，由杭州迅數科技有限公司提供。

1.2試驗方法

1.2.1藜麥多糖的制備

原材料預處理：分別挑選市售偏關縣和靜樂縣2地藜麥中顆粒飽滿的種子，置于50 ℃烘箱中烘干至恒質量，粉碎后過40目篩，密封備用。脫脂[5]：分別稱取偏關縣和靜樂縣的藜麥粉各5份，每份0.2 g，置于離心管中。向其中各加入2 mL石油醚，靜置過夜，4 000 r/min離心 10 min，棄去上清液。除單糖和低聚糖：向已經脫脂的藜麥中加入2 mL 95%乙醇，靜置過夜，4 000 r/min離心10 min，棄去上清夜。將沉淀放在烘箱中，50 ℃烘干。

1.2.2多糖的提取

根據試驗設計，采用超聲波輔助提取藜麥多糖。按照1 ∶[KG-*3]5、1 ∶[KG-*3]10、1 ∶[KG-*3]15、1 ∶[KG-*3]20、1 ∶[KG-*3]25等5個不同的料液比（g ∶[KG-*3]mL），向各離心管中加入蒸餾水。在超聲功率 320 W、溫度50 ℃的條件下浸提40 min，提取藜麥多糖。浸提結束后4 000 r/min離心10 min，倒出濾液至另一離心管中，舍棄沉淀。向離心管中加入4倍體積的的95%乙醇，放置4 ℃冰箱中醇沉24 h，4 000 r/min離心10 min，收集沉淀。沉淀依次用無水乙醇、丙酮、無水乙醚洗滌，真空干燥，得到粗多糖。

1.2.3脫蛋白

粗多糖用5 mL蒸餾水溶解，向其中加入Sevage試劑1.2 mL[Sevage試劑：取100 mL三氯甲烷，向其中加入20 mL正丁醇，混勻，放入棕色瓶，備用。（Sevage法除蛋白：V多糖溶液 ∶[KG-*3]V氯仿 ∶[KG-*3]V正丁醇=25 ∶[KG-*3]5 ∶[KG-*3]1）][10]，混合物用微型漩渦混合儀劇烈振蕩20 min，4 000 r/min離心10 min。小心取出上層多糖溶液，棄去下層有機相和中間蛋白沉淀。

1.2.4醇沉

按照參考文獻[4]的方法進行醇沉，得到精制多糖。將提取的多糖用2 mL蒸餾水溶解得多糖溶液，放置于冰箱中冷藏備用。

1.2.5試驗設計

根據不同料液比提取的藜麥多糖質量濃度結果，采用多糖提取率最高的料液比，按照上述方法，分別提取2 g偏關縣和靜樂縣藜麥多糖。并用20 mL蒸餾水溶解，制成多糖溶液，放置于冰箱中冷藏備用。

1.2.6標準曲線的制備精確稱取105 ℃干燥至質量不變的葡萄糖對照品10 mg，加入蒸餾水定容至100 mL，得到 0.1 mg/mL 的葡萄糖標準溶液。分別吸取此溶液0、0.1、02、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于10 mL帶塞試管中，蒸餾水定容至1 mL，加入5 mL現配的蒽酮-硫酸試劑，充分搖勻，蓋塞，在沸水浴中15 min，取出后立即用冷水冷卻至室溫。用0號管調零，在620 nm波長下分別測得D620 nm。以D620 nm為縱坐標，葡萄糖質量濃度為橫坐標，繪制標準曲線。

1.2.7藜麥多糖抗氧化作用測定方法

DPPH溶液的配制[6]：準確稱取50 mg DPPH，用無水乙醇定容到100 mL，使DPPH的終濃度為0.5 mg/mL。取10 mL 0.5 mg/mL的 DPPH 溶液，用無水乙醇定容到100 mL，使DPPH的終濃度為0.05 mg/mL。將配好的DPPH溶液置于棕色瓶中，放置冰箱中，待用。

采用維生素C作陽性對照，將配制好的0.01 mg/mL的維生素C標準液置于棕色瓶中，放置冰箱中待用。

抗氧化能力的測定：分別吸取0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL 維生素C標準液，用蒸餾水定容到2 mL，加入濃度為0.05 mg/mL的DPPH 2 mL，充分混勻，放置到黑暗的地方，靜置30 min左右，測定其在517 nm的吸光度D1。同時測定 2 mL DPPH溶液與2 mL蒸餾水混勻靜置30 min后的吸光度D0；以及在2 mL蒸餾水中加入0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL維生素C標準液，用蒸餾水定容至4 mL充分振蕩搖勻后的吸光度D2。以濃度確定的維生素C標準液的體積數為橫坐標，以DPPH·的清除率為縱坐標作圖。

DPPH·的消除率計算公式為：

[JZ]Y=[1-（D1-D2）/D0]×100%。

采用上述方法[4]對偏關縣和靜樂縣的藜麥多糖提取液進行抗氧化能力的測定。

1.2.8藜麥多糖的抑菌作用

供試菌種的活化[11]：連續3次將大腸桿菌、金黃色葡萄球菌進行培養基斜面活化，采用試管牛肉膏蛋白胨固體作為培養基，第3次的菌體備用。菌懸液的制備[12]：用無菌接種環挑取少量活化的供試菌于無菌生理水中，用移液槍輕輕吹打使菌體分散，稀釋搖勻，用顯微鏡直接計數法計數，制成106～107 CFU/mL的菌懸液，待用。圓濾紙片的準備：用打孔器將濾紙裁制成直徑大小為6 mm的圓濾紙片，121 ℃高溫蒸汽滅菌30 min、干燥 30 min。

測定藜麥多糖提取液的抑菌性：在無菌操作臺中，將經過滅菌的培養基倒入培養皿內10～15 mL，室溫下凝固，記號筆標記相應的菌體及不同產地的藜麥多糖。夾取經高溫蒸汽滅菌的圓濾紙片浸泡于藜麥多糖溶液中20 min，備用。用移液槍吸取 200 μL 大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的菌懸液至相應平板上，用無菌涂布器涂布均勻。采用濾紙片擴散法，用無菌鑷子夾取含多糖溶液濾片平放于平板表面，每個板放置5個濾紙片，均勻分散在平板上。將各平板倒置在37 ℃生化培養箱中培養6～8 h，觀察其生長情況，用Supcre系列菌落計數/篩選/抑菌圈測量聯用儀記錄各平板抑菌圈直徑，求平均值。

1.3數據處理

采用料液比為1 g ∶[KG-*3]10 mL時的藜麥多糖提取率，應用Excel 2003對藜麥多糖提取率作圖，DPS 7.05統計分析數據的差異顯著性。

2結果與分析

2.1多糖質量濃度的測定

2.1.1標準曲線的繪制

取7支具塞試管，按濃度梯度配制葡萄糖溶液，以D620 nm值為縱坐標，葡萄糖質量濃度為橫坐標，繪制標準曲線。用最小二乘法得線性回歸方程：y=0.006 69x+0.029 2，r2=0.991 09。根據方程，可計算樣品中多糖質量濃度（圖1）。

2.1.2樣品中多糖提取率的測定

由圖2、圖3可知，超聲波輔助提取藜麥多糖，在超聲波功率為320 W、溫度為50 ℃、提取時間為40 min的條件下，在料液比接近1 g ∶[KG-*3]10 mL時，偏關縣和靜樂縣的藜麥多糖提取率均為最高，且偏關縣的藜麥多糖提取率顯著高于靜樂的多糖提取率（表1）。因此，在相同提取條件下，本試驗選取1 g ∶[KG-*3]10 mL的料液比提取偏關縣和靜樂縣的藜麥各 2 g，得到精制多糖溶液。

2.2抗氧化作用的測定

2.2.1維生素C對DPPH·的清除能力由圖4可知，隨著維生素C標準液的體積的增加（0～2 mL），即隨著維生素C濃度的增加，維生素C標準液對DPPH·的清除率亦增強，且維生素C對DPPH·的清除作用較明顯。表明抗氧化劑維生素C作為陽性對照有良好的清除能力，即有良好的抗氧化性。

2.2.2樣品對DPPH·的清除能力由圖4、圖5、圖6可知，藜麥多糖和維生素C對DPPH·的清除率趨勢相同，清除率隨維生素C標準液、藜麥多糖提取液樣品體積的增加而增強。偏關縣、靜樂縣的藜麥多糖對DPPH·的清除率都隨著多糖溶液體積（0～2 mL）的增加而增強，對DPPH·清除率的趨勢基本相同。但由于偏關縣的藜麥多糖提取率（2 094.5 μg/g）高于靜樂縣的藜麥多糖提取率（1 781.5 μg/g），因此同體積多糖提取液相比較，偏關縣藜麥多糖對DPPH·的清除率高于靜樂縣藜麥多糖。

2.3抑菌作用的測定

由表2可知，偏關縣的藜麥多糖對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均有抑菌現象，但對大腸桿菌的抑菌作用較強，對金黃色葡萄球菌抑菌作用較弱。靜樂縣藜麥多糖對大腸桿菌有抑菌現象，但對金黃色葡萄球菌無抑菌現象。[FL）]

3結論與討論

本研究表明，偏關縣、靜樂縣2地藜麥多糖的提取率分別為 2 094.5、1 781.5 μg/g，均遠低于文獻[3]中0.16 g/g的藜麥多糖提取率。分析原因，首先是提取獲得的目標多糖不同，袁俊杰等提取的是粗制多糖[3]，而本試驗為逐級除雜后中提取的精制多糖；其次是前人以預處理后的藜麥質量作為分母，計算多糖提取率，而本試驗以處理之前的藜麥質量計算多糖提取率；此外，不同試驗設備以及操作過程中損失程度不同；除品種自身差異外，以上因素是造成藜麥多糖提取率差異較大的原因。研究表明，藜麥種子多糖得率在品種間存在明顯差異[3]，這與本試驗中不同產地的藜麥種子多糖提取率存在差異結果一致，可見藜麥多糖含量不僅與品種遺傳有關，也與生態環境、栽培條件有關。

不同產地的藜麥多糖均具有一定抗氧化能力，這與前人有關紅豆多糖、木瓜多糖等的研究結果一致。本試驗中偏關縣的藜麥多糖提取率大于靜樂縣藜麥多糖提取率，2地藜麥多糖對DPPH·的清除能力表現為相同趨勢，[JP2]即偏關縣的藜麥多糖清除DPPH·的能力較強，表現出的抗氧化能力也較強。藜麥多糖和維生素C對DPPH·的清除率趨勢相同。藜麥多糖具有抑菌作用，與文獻[11]結果基本一致。偏關縣產地的藜麥多糖對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均有抑菌現象，但靜樂縣產地的藜麥多糖僅對大腸桿菌有抑菌現象，對金黃色葡萄球菌無抑菌現象。這可能與靜樂縣產地的藜麥多糖提取率低于偏關縣產地的藜麥多糖提取率有關。有關不同產地、生態環境、栽培條件對藜麥種子營養成分及其抑菌性、抗氧化性的具體影響，有待進一步進行更加精確、系統的對比研究。[JP]

藜麥種子在料液比為1 g ∶[KG-*3]10 mL時多糖提取率最高，且偏關縣藜麥的多糖提取率（2 094.5 μg/g）顯著高于靜樂縣藜麥的多糖提取率（1 781.5 μg/g）。藜麥多糖對DPPH自由基有清除能力，且清除率隨著多糖體積的增加而呈現增大趨勢。藜麥多糖對大腸桿菌有較強抑菌效果，但對金黃色葡萄球菌抑菌性較弱。

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