活性導向分離瓜蔞皮中具有抗血管緊張素轉化酶作用的成分

王輝俊++柯櫻++葉冠

[摘要]該試驗基于活性導向分離瓜蔞皮中具有抗血管緊張素轉化酶（ACE）作用的成分。瓜蔞皮經水提醇沉后取上清液，然后透析截留獲1 000以上的部分得GLP，GLP經活性跟蹤測定，DEAE Sepharose Fast Flow陰離子交換樹脂分離和Superdex75系列凝膠純化后得GLP11，并對GLP11進行HPGPC分析、單糖組成測定和ACE抑制活性檢測。結果顯示，采用活性跟蹤方法，從瓜蔞皮中得到一種具有ACE抑制作用的均一低聚糖GLP11，相對分子質量為1 367，主要由阿拉伯糖、甘露糖和葡萄糖組成，3種單糖的摩爾比為02∶43∶100，GLP11表現出較強的ACE抑制活性，其IC50為（1134±86） mg·L-1。從瓜蔞皮中成功分離到具有ACE抑制作用的低聚糖，該發現為瓜蔞皮的化學物質基礎提供依據。

[關鍵詞]瓜蔞皮； 低聚糖； 活性導向分離； 血管緊張素轉化酶（ACE）抑制作用

Bioactivityguided isolation of antiangiotensin converting

enzyme constituents from Trichosanthis Pericarpium

WANG Huijun， KE Ying， YE Guan*

（Shanghai Pharmaceuticals Holding Co.， Ltd.， Shanghai 201203， China）

[Abstract]To isolate the antiangiotensin converting enzyme （ACE） constituents from Trichosanthis Pericarpium based on bioactivityguided separation Trichosanthis Pericarpium was extracted with boiling water and precipitated by ethanol， then its supernatant was collected and dialyzed The retentate of the fractions above 1 000 was lyophilized to obtain GLP， which was then successively separated by DEAE Sepharose fast flow anionexchange and Superdex75 gel permeation chromatographic steps to achieve GLP11 A combination of HPGPC， monosaccharide compositions determination and ACE inhibitory activity studies was performed to investigate the structure and bioactivity The results showed that an antiangiotensin converting enzyme oligosaccharide， GLP11， was obtained from Trichosanthis Pericarpium based on activity tracking， whose average molecular weight was estimated to 1 367； mainly composed of arabinose， mannose， and glucose at a ratio of 02∶43∶100 GLP11 showed potent antiangiotensin converting enzyme effect with the IC50of （1134±86） mg·L-1 In this study， an oligosaccharide with antiangiotensin converting enzyme effect was isolated from Trichosanthis Pericarpium， which could lay the foundation for the substance basis study of Trichosanthis Pericarpium.

[Key words]Trichosanthis Pericarpium； oligosaccharide； activityguided isolation； anti angiotensin converting enzyme （ACE） effect

瓜蔞皮Trichosanthis Pericarpium為葫蘆科栝樓屬植物栝樓Trichosanthes kirilowii Maxim或雙邊栝樓T rosthorinii Harms的干燥成熟果皮[1]。瓜蔞皮注射液為上藥集團旗下子公司上海第一生化藥業有限公司獨家產品，是以瓜蔞皮為原料，經水提醇沉，再經過離子交換樹脂洗脫而制成的滅菌水溶液，臨床上用于冠心病，穩定型心絞痛的治療，具有行氣除滿，開胸除痹之功效[2]。瓜蔞皮注射液臨床應用廣泛，但物質基礎尚不明確。目前對瓜蔞皮的化學成分研究也主要集中在小分子上，如從瓜蔞皮中分離出脂肪酸[3]、甾醇[45]、黃酮[6]、氨基酸[7]、核苷酸[8]和生物堿[910]成分，但瓜蔞皮聚糖類成分卻鮮有報道。腎素血管緊張素系統（RAS）和激肽釋放酶激肽系統（KKS）對機體血壓、電解質和體液平衡的維持都起著重要的作用。在RASKKS系統中血管緊張素轉化酶（ACE）起著至關重要的作用，ACE能催化血管緊張素I（angiotensin I，Ang I）轉變為強效升高血壓作用的物質血管緊張素Ⅱ（angiotensin Ⅱ，Ang Ⅱ），與此同時，還將具有降壓作用物質舒緩激肽（bradykinin）降解，使之失去降壓作用，從而參與血壓調節[1112]。大規模臨床試驗數據顯示，血管緊張素轉換酶抑制劑（ACEI）類藥物能顯著降低冠心病患者的死亡率和再發主要心血管事件的風險[13]。鑒于此，本文將瓜蔞皮按照瓜蔞皮注射液國家藥品標準進行提取，并以抗ACE活性跟蹤為前提，對透析截留后的袋內大分子部分進行活性跟蹤分離純化和結構分析，為闡明瓜蔞皮注射液的化學物質基礎提供依據。endprint

1材料

11樣品、對照品及試劑

瓜蔞皮20 kg購自上?？禈蛑兴庯嬈邢薰荆óa地山東，批號150825；生產日期為2015年8月25日），DEAE Sepharose Fast Flow陰離子交換樹脂和Superdex系列分子篩凝膠柱購自通用電氣GE Healthcare；普魯蘭多糖P82標準品套裝：P5，P10，P20，P50，P100，P200，P400，P800，Shodex；水為超純水（實驗室自制）；血管緊張素轉化酶ACE、HipHisLeu、卡托普利、4甲基嗎啉硼烷、單糖標準品（D葡萄糖、D阿拉伯糖、L巖藻糖、L鼠李糖、D甘露糖、D木糖、D半乳糖）和三氟乙酸購自SIGMA公司，硼酸、硼砂、鹽酸、喹啉、苯磺酰氯、無水乙醇和氯化鈉均購自國藥集團上海試劑有限公司；其他的試劑均為分析純。

12儀器

安捷倫1260系列高效液相色譜儀（包括自動進樣器、輸液泵、脫氣機、DAD 檢測器、IR檢測器及安捷倫Cirrus GPC軟件）；安捷倫7890B型氣相色譜儀配備7693型三重四級桿質譜儀，Rxi1ms毛細管柱（025 mm × 30 m，025 μm）購自Restek公司；利穗科技多糖分離系統配置Shodex示差折光IR檢測器；電子天平（賽托利斯SECURA225D）；離心機（SIGMA3K15）；旋轉蒸發儀（BUCHIRotavapor R300）；冷凍干燥機（LABCONCO45L）；純水儀（密理博REFRENCE）。

2方法

21瓜蔞皮低聚糖的提取及分離純化瓜蔞皮的提取

按照國家藥品標準[WS11417（ZD1417） 20022008]的制備流程，即取瓜蔞皮5 000 g，加水40 L煎煮3次，第1次2 h，第2，3次各1 h，分次濾過，合并濾液并減壓濃縮至相對密度為110～125（30 ℃），加入90%乙醇使含醇量為70%，靜置72 h，取上清液，濾過，回收乙醇，真空干燥后得浸膏。浸膏經截留相對分子質量為1 000 的透析袋透析后收集袋內大分子部分，冷凍干燥后樣品記做GLP（3186 g，得率637%）。GLP（50 g）經DEAE Sepharose Fast Flow陰離子交換樹脂通過水，01，02，05，10 mol·L-1NaCl洗脫，苯酚硫酸跟蹤，分別對應得到洗脫組分GLPW，GLP1，GLP2，GLP5，GLP10洗脫部位；活性最強洗脫組分GLP1（1183 mg，得率237%）以02 mol·L-1NaCl溶液為流動相經Superdex 75分子篩凝膠柱色譜，得 GLP11（215 mg，得率182%）。

22低聚糖純度和相對分子質量測定

采用高效凝膠滲透色譜法（HPGPC）法測定低聚糖的純度及相對分子質量[14]。稱取樣品配置成質量濃度為2 g·L-1的溶液，對照品為不同系列普魯蘭多糖，配制成質量濃度為2 g·L-1的混合對照品溶液。色譜柱UltrahydrogelTM 1000（78 mm×300 mm）串聯UltrahydrogelTM 250（78 mm×300 mm），Waters；流動相02 mol·L-1 NaCl溶液；流速08 mL·min-1；柱溫40 ℃。分別精密吸取對照品與樣品溶液各10 μL，注入HPGPC進行檢測，圖譜通過安捷倫Cirrus GPC軟件數據處理。

23單糖組成分析

還原水解法進行糖組成分析[15]，取樣品約1～2 mg，置15 mm×150 mm試管中，加200 μL 3 mol·L-1三氟乙酸溶液和50 μL 4甲基嗎啉硼烷溶液，80 ℃油浴水解5 min，取出加入50 μL 4甲基嗎啉硼烷溶液，120 ℃油浴水解1 h，取出。再加入100 μL 4甲基嗎啉硼烷溶液，轉入25 mL梨形燒瓶，60 ℃水浴減壓蒸干，再加2～3 mL乙腈蒸干3次，然后加200 μL三氟乙酸和200 μL乙酸酐，50 ℃水浴乙?；?0 min，加3 mL水終止反應，室溫放置30 min，用5 mL氯仿萃取全乙?；苌?，氯仿層用水洗3次，無水硫酸鈉干燥，然后用氯仿稀釋至50 mL溶液。GCMS檢測，程序升溫條件：140～198 ℃ （2 ℃·min-1），保持4 min，繼續升溫到217 ℃（1 ℃·min-1），保持4 min，最后升溫到250 ℃（3 ℃·min-1），保持5 min；進樣口溫度為250 ℃；載氣為氦氣（體積流量1 mL·min-1），進樣量為1 μL。

24血管緊張素轉化酶抑制活性篩選

241馬尿酸標準曲線的繪制[16]稱取馬尿酸溶于01 mo1·L-1硼酸鹽緩沖液（pH 83，含03 mo1·L-1 NaCl）配制成04 g·L-1標準應用液。分別取005，010，015，020，025，030，040 mL標準液于10 mL帶塞玻璃試管中，用蒸餾水稀釋至05 mL，另取一支試管只加05 mL蒸餾水作空白。在避光條件下向每只試管加入06 mL喹啉，旋渦器上混合10 s后加入02 mL苯磺酰氯（BSC）（喹啉BSC 32比例最佳），立即蓋緊管塞在旋渦混合器上混合20 s，反應液在30 ℃恒溫水浴鍋中避光放置30 min。隨后向各管加入37 mL無水乙醇，混勻，繼續避光放置30 min。取02 mL反應混合物加入到96孔平底培養板中，用酶標儀在波長492 nm下測定吸光度。以吸光度為縱坐標，馬尿酸含量為橫坐標，繪制標準曲線。每個測定值均作3次重復。

242ACE抑制劑活性的測定[1617]樣品組（a）：將ACE底物HipHisLeu溶于01 mol·L-1的含03 mol·L-1 NaCl的硼酸鹽緩沖液中（pH 83），配制成5 mmol·L-1的溶液。取50 μL 5 mmol·L-1 HipHisLeu溶液與20 μL ACE抑制劑（即洗脫組分GLPW，GLP1，GLP2，GLP5，GLP10，GLP11或卡托普利）混合，在37 ℃恒溫水浴中預熱5 min。隨后加入10 μL 01 U·mL-1 ACE溶液[用01 mol·L-1的含03 mol·L-1 NaCl的硼酸鹽緩沖液中（pH 83）配制]，37 ℃反應30 min加入100 μL 1 mol·L-1 HCl溶液終止反應，并加入硼酸鹽緩沖液至05 mL。然后ACE水解HipHisLeu生成的馬尿酸量按241項馬尿酸標準曲線的繪制方法進行測定。endprint

對照組（b）：將ACE底物HipHisLeu溶于01 mol·L-1的含03 mol·L-1 NaCl的硼酸鹽緩沖液中（pH 83），配制成5 mmol·L-1的濃度。取50 μL 5 mmo1·L-1 HipHisLeu溶液與20 μL 01 mol·L-1硼酸鹽緩沖液混合，在37 ℃恒溫水浴中預熱5 min。隨后加入10 μL 01 U·mL-1 ACE溶液[用01 mol·L-1的含03 mol·L-1 NaCl的硼酸鹽緩沖液中（pH 83）配制]，37 ℃反應30 min加入100 μL 1 mol·L-1 HCl溶液終止反應，然后加入20μL ACE抑制劑（即洗脫組分GLPW，GLP1，GLP2，GLP5，GLP10，GLP11或卡托普利），并加入硼酸鹽緩沖液至05 mL。然后ACE水解HipHisLeu生成的馬尿酸量按241項馬尿酸標準曲線的繪制方法進行測定。

空白組（c）：取10 μL 01 U·mL-1 ACE[用01 mol·L-1的含03 mol·L-1 NaCl的硼酸鹽緩沖液中（pH 83）配制]，加入100 μL 1 mol·L-1 HCl溶液，加入ACE底物HipHisLeu[用01 mol·L-1的含03 mol·L-1 NaCl的硼酸鹽緩沖液中（pH 83）配制成5 mmol·L-1的濃度]，然后加入20 μL ACE抑制劑（即洗脫組分GLPW，GLP1，GLP2，GLP5，GLP10，GLP11或卡托普利），在37 ℃恒溫水浴中加熱35 min。隨后加入硼酸鹽緩沖液至05 mL。然后ACE水解HipHisLeu生成的馬尿酸量按241項馬尿酸標準曲線的繪制方法進行測定。

所有測定均作3次重復，取平均值，計算ACE的抑制程度。ACE抑制率=（Ab-Aa）/（Ab-Ac）×100%，其中，Aa為 ACE及ACE抑制劑都存在的條件下的吸光度，Ab為ACE抑制劑不參與反應的條件下測得的吸光度，Ac為ACE不參與反應的條件下的吸光度。

配制不同濃度的GLP11（200，100，50，25，125，625，3125 mg·L-1），按以上步驟測定其ACE抑制活性，以ACE抑制活性為縱坐標，log （GLP11濃度）為橫坐標繪制曲線，并進行回歸分析得出回歸方程用于計算GLP11的半抑制濃度（IC50）。

25統計學分析

實驗數據采用±s表示，數據分析采用GraphPad Prism軟件進行Oneway ANOVA分析。

3結果

31GLP11的分離純化

瓜蔞皮樣品GLP經DEAE Sepharose Fast Flow分別以蒸餾水，01，02，05，10 mol·L-1 NaCl洗脫分離后，被依次分為5個部分GLPW，GLP1，GLP2，GLP5和GLP10；活性最強的部位GLP1再經Superdex 75凝膠柱進一步純化，收集130～170 min流分，經濃縮、脫鹽和冷凍干燥后得 GLP11，苯酚硫酸法檢測GLP11顯色明顯，表明GLP11為糖類成分。

32純度和相對分子質量測定

GLP11的純度和相對分子質量采用高效液相凝膠滲透色譜法（HPGPC）進行測定，結果顯示GLP11的HPGPC譜圖呈單一峰，見圖1，表明GLP11為均一低聚糖/多糖。以不同相對分子質量的普魯蘭多糖為對照品，經Cirrus GPC軟件分析測得GLP11相對平均相對分子質量為1 367，為低聚糖。

33單糖組成分析

采用還原水解法對單糖糖組成進行分析，結果表明GLP11主要含阿拉伯糖、甘露糖和葡萄糖，3種單糖的摩爾比為02∶43∶100，見圖2。

34血管緊張素轉化酶抑制活性測定

實驗結果顯示GLPW，GLP1和GLP2在200 mg·L-1時均表現出較好的血管緊張素轉化酶（ACE）抑制作用，其中GLP1的活性最強，抑制率為（5812±497）%。GLP1經Superdex 75凝膠純化后的均一低聚糖GLP11經活性檢測后，200 mg·L-1時ACE抑制率為（6909±391）%，IC50為（1134±86） mg·L-1，見圖3。

4討論

瓜蔞皮注射液主要選取水提醇沉上清液，根據文獻報道和猜想：上清液中可能含極性較大的小分子成分、低聚糖和低相對分子質量的多糖成分[1819]，而大相對分子質量的多糖成分主要集中在沉淀部分[20]。大分子成分HPGPC檢測通常采用2根凝膠色譜柱串聯使用以提高分離效率，大孔徑色譜柱連接在前進行初步分離，小孔徑色譜柱連接在后進行精細分離，如本實驗采用UltrahydrogelTM 1000（78 mm×300 mm）串聯UltrahydrogelTM 250（78 mm×300 mm）檢測GLP11的均一性和相對平均相對分子質量。目前前期已對瓜蔞皮注射液中小分子成分進行了系統的UPLC/ESIQTOFMS分析，共鑒定了19個成分，主要為極性較大的小分子，包含氨基酸、核苷酸、黃酮、多肽和唾液酸等，但未檢測到有ACE抑制活性。由于瓜蔞皮注射液樣品量的限制，本文并未直接用瓜蔞皮注射液進行分離純化，而是按照國家藥品標準（WS11417（ZD1417）20022008）瓜蔞皮注射液的制備流程進行制備，并采用活性跟蹤方法篩選抗ACE成分，本文成功從瓜蔞皮中分離得到一種具有較強ACE抑制作用的均一低聚糖GLP11，相對分子質量為1 367，主要由阿拉伯糖、甘露糖和葡萄糖組成，3種單糖的摩爾比為02∶43∶100，其ACE抑制活性IC50為（1134±86） mg·L-1，本發現為瓜蔞皮注射液抗心血管的化學物質基礎提供依據。

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[責任編輯孔晶晶]endprint