應用克隆文庫構建法研究枇杷根系AMF多樣性

尹利方，任 禛,2,3*，夏體淵**，朱維賢，陳澤斌,2，靳 松，顏家亮，趙曉紅

(1.昆明學院農學院，云南 昆明 650214；2.云南省都市特色農業工程技術研究中心，云南 昆明 650214；3.云南省高校特色生物資源開發與利用重點實驗室，云南 昆明 650214；4.昆明市農業科學研究院，云南 昆明 650034)

應用克隆文庫構建法研究枇杷根系AMF多樣性

尹利方1，任 禛1,2,3*，夏體淵1**，朱維賢4，陳澤斌1,2，靳 松1，顏家亮1，趙曉紅1

(1.昆明學院農學院，云南 昆明 650214；2.云南省都市特色農業工程技術研究中心，云南 昆明 650214；3.云南省高校特色生物資源開發與利用重點實驗室，云南 昆明 650214；4.昆明市農業科學研究院，云南 昆明 650034)

【目的】為進一步探尋和利用寶貴的AMF資源提供有效的研究方法?！痉椒ā吭诶ッ鲗W院隨機采集枇杷根系作為實驗樣品，采用CTAB法提取根系 DNA，進行18S rDNA PCR擴增，產物連接轉入大腸桿菌JM109受體，建立18S rRNA部分基因克隆文庫。從文庫中隨機選取35個白色克隆子，經鑒定，獲得30個陽性克隆子，將陽性克隆子測序。運用Mothur等軟件分析陽性克隆子序列，確定9條差異序列，為不同的AMF序列?！窘Y果】克隆文庫的Coverage C值為93.3 %，克隆文庫的Shannon-Wiener指數為2.079，Simpson指數為0.87，且Rarefaction曲線比較飽和。9個序列分為了兩個不同的類群，代表不同AMF種類；球囊霉屬(Glomus)是枇杷根系的主要AMF類群，OUT1和OTU2代表了文庫中的主要類型，其中OTU1為根內根生囊霉(Rhizophagusirregularis)；OTU3、OTU4、OTU5和OTU6代表著文庫中的常見類型；其余序列則為枇杷根系中的少見或稀有AMF類型?！窘Y論】球囊霉屬(Glomus)是枇杷根系的主要AMF類型，其中根內根生囊霉(Rhizophagusirregularis)為優勢AMF種類。

枇杷；AMF；克隆文庫；18S rRNA基因；系統發育分析

叢枝菌根真菌(Arbuscular Mycorrhizal Fungi，AMF)是在農業生態系統中分布最廣泛的一類內生性真菌，參與了碳、氮、磷等多種元素的生物地球化學循環過程，能與80 %以上的植物形成菌根結構[1]，是與植物關系比較友好的微生物之一?！狙芯恳饬x】AMF與植物建立互惠互利共生的關系，主要表現在促進植物根系對營養元素的吸收，提高植物根系對水肥吸收利用率、增強植物對逆境的抵抗能力、提高苗木移栽后的水分吸收，促進成活、增強植株光合作用能力，增加植物內有機物的合成，使植物生長茂盛，增加植物生物量、提高作物產量和改善產品品質等有利方面[2-4]?！厩叭搜芯窟M展】研究表明，接種叢枝菌根真菌后的棉花生長速度明顯提高，植株對營養吸收的狀況也得到了改善，楊梅在接種叢枝菌根真菌后，幼苗的光合作用能力也得到明顯提高，抗逆性得到加強[5]。因此，選擇適合的AMF菌劑用于經濟作物以及農作物的生產是可行的。叢枝菌根真菌在自然環境中能夠促進生物間的物質交換，促進生態系統氮循環，加強植物之間的信息傳遞，促進生態環境能量的流動以及保護和提高生物的多樣性，穩定生態系統平衡。因此，AMF的生態結構及群落多樣性成為研究新型生物肥的基礎，大量研究者的關注使其成為研究熱點?！颈狙芯康那腥朦c】枇杷(Eriobotryajaponica)是AMF的普遍寄主之一，當AMF侵染枇杷根系并建立穩定的共生體后，能夠改善枇杷的光合特性，促進植物根系對營養元素的吸收并促進植株生長，增強植株對鹽脅迫和低溫等逆境的適應能力，增產增收[6-8]。本研究以AMF侵染的枇杷根系為材料，提取DNA。運用巢式PCR擴增枇杷根系AMF的18S rRNA基因部分片段，目的產物通過特定引物連接后轉化入大腸桿菌，構建克隆文庫，應用Mothur軟件分析，篩選出差異類群測序，并對具有差異類群的序列進行系統發育樹分析，探明枇杷根系AMF多樣性和親緣關系?！緮M解決的關鍵問題】本研究旨在探明AMF侵染枇杷根系的主要類群和稀有類群，為進一步研究枇杷根系AMF真菌主要的功能類群和相應作用奠定基礎，為其他植物根系AMF 18S rDNA克隆文庫的構建提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

選擇昆明學院農學樓西側無明顯病害枇杷樹，隨機采集枇杷部分根系，用蒸餾水把采集后的根系清洗干凈，然后將清洗干凈的根系剪成長度為0.2 cm的小段。

1.2 根系DNA提取

DNA提取的方法參照任禛等改進的CTAB法[9]進行，獲得的DNA加入TE溶解，-20 ℃條件下保存。

1.3 目的片段的巢式PCR擴增

枇杷根系DNA適當稀釋后進行巢式PCR擴增，試驗所用引物見表1[10]。首次擴增引物為Geo A2和Geo11，18S rDNA通用引物，片段長度為1.8 kb。反應所用試劑及用量：10 × PCR buffer 2.5 μl，dNTP(2.5 mmol/L)2 μl，Geo11(10 μmol/L)1 μl，GeoA2(10 μmol/L)1 μl，Taq(5 U/μl)0.2 μl，模板DNA 1 μl，ddH2O補充至25 μl。反應過程：95 ℃ 5 min，95 ℃ 1 min，57 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，30個循環，72 ℃ 10 min。將上述獲得的產物進行第2次擴增，所使用引物為AMF特異混合引物，擴增片段長度為550 bp。反應所用試劑及用量同第一步，反應過程為95 ℃ 預變性5 min，95 ℃ 45 s，65 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min 30 s，30次循環，72 ℃ 10 min。使用Tiangen多功能膠回收純化PCR 最終產物，獲得質量較好、純度較高的目的片段，將獲得的DNA片段構建克隆文庫。

1.4 目的基因克隆、陽性克隆子確定以及Mothur分析

運用Takara pMD 18-T Vector克隆試劑對純化的目的產物進行連接反應，連接產物轉入感受態細胞JM109，隨后轉化產物在含有青霉素、X-Gal及IPTG的LB平板上隔天培養，篩選陽性克隆子。隨機挑選35個白色克隆子，擴大培養在液體培養基中進行，使用試劑盒抽提質粒，并運用PCR擴增方式檢驗插入DNA片段長短，最終得到30個陽性克隆子，之后對30個陽性克隆子進行測序。對測序后的結果進行目的基因的提取。使用ClustalX 1.8進行目的基因對比分析。將開始和末尾處長度不同的序列剪切整齊，避免長短不一的序列增加序列間的差異。應用Mothur軟件對剪切后的序列進行分析。根據軟件對比分析結果，認為2種序列相似性在98 %的克隆子為相同的基因型，每種基因型代表一個可操作分類單元(Operational Taxonomic Unit，OTU)，挑選代表不同序列的克隆子，編號為不同OTU。

1.5 克隆文庫評價及多樣性計算

依據Moyer等[11]的文獻，根據克隆文庫中每個OTU對應的克隆子數目和總的OTU數目，計算克隆文庫的庫容值Coverage C，計算公式為C=[1-(n/N)]×100 %，n為單個克隆子的OTU數，N代表總的OTU數目。使用Analytic Rarefaction version 1.3繪制克隆文庫的稀有度飽和曲線(Rarefaction Curve)[12]，枇杷根系AMF文庫的多樣性指數運用SPADE軟件計算[9]。

表1 Nest-PCR引物

1.6 系統發育樹分析

使用GenBank數據庫中的BLAST程序，把挑選出來的OTU分別進行相似性比對，選擇相似度較高的序列進行系統發育樹分析。分析軟件為Mega4.1，通過鄰近法(Neighbor-Joining)構建系統進化發育樹。

2 結果與分析

2.1 DNA提取及PCR擴增結果

枇杷根系所提取的菌根真菌DNA風干后呈透明狀，數量較少，電泳檢測結果看到的條帶不是很清晰，DNA較為分散、雜亂，難以看到明顯的片段，但是有少量的DNA存在，后續擴增不受影響，可以將提取物直接用于PCR擴增。由巣式PCR擴增結果可以看出(圖1)，DNA通過第1次PCR擴增后，電泳檢測圖看到，在1.8 kb左右的條帶比較明亮，表示此次擴增比較成功，同時說明得到了大量的DNA，在800 bp左右有模糊條帶，表示有微弱的非特異性擴增，不過第2次擴增不受影響。將第1次PCR擴增產物按比例稀釋后，進行第2次擴增，由圖1看出，在550 bp左右獲得明亮條帶，說明成功獲得目標產物，能夠進行后續試驗。證明反應體系和條件滿足實驗要求。采用回收試劑盒回收電泳檢測的目標產物目的片段，回收后的目的片段連接到pMD 18-T 載體中，轉化到JM109中，成功建立克隆文庫。

M1：λ-hind Ⅲ digest DNA Marker；M2、M3均代表DL2000 Marker；1為根系提取的DNA；2為第1次PCR擴增產物；3為第2次PCR擴增產物M1:λ-hind Ⅲ digest DNA Marker; M2, M3 represent the DL2000 Marker; Lane1: DNA of the roots; Lane2: Results of the first Nested PCR; Lane3: Results of second Nested PCR圖1 Nested-PCR擴增結果Fig.1 Amplification by Nested-PCR

2.2 陽性克隆篩選以及Mothur

隨機挑選的35個白色克隆子。通過驗證，共確定30個陽性克隆子，確定的陽性克隆子測序后，提取目的片段，去除多余的引物并通過ClustalX 1.8分析獲得的目的基因(圖2)。為降低目的基因的差異，以最短基因長度為標準，切除其他基因多余的部分。整理好的基因使用Mothur軟件分析，共確定了9個差異序列，選擇每個差異序列中代表序列，分別命名為不同的OTU。將不同的OTU序列與GenBank的序列對比，結果表明9個OTU序列為不同的AMF類群。

2.3 枇杷根系AMF克隆文庫評價及多樣性指數

通過驗證，排除了5個假陽性克隆子，n=2、N=30?？寺∥膸霤overage C為93.3 %，通過Rarefaction軟件繪制出的克隆文庫的稀有度飽和曲線表明，隨著克隆子數目的增加，克隆文庫的OTU數目增加逐漸緩慢(圖3)，說明所建立的文庫能夠說明枇杷根系內實際的AMF類群，表明所取OTU序列建立的克隆文庫能夠代表枇杷根系實際的AMF類群，更多的取樣也可能只產生少量新的OTU，樣品中所代表的AMF類群在實際土壤中占有的比例較大，庫容較為飽和。文庫的Simpson指數和Shannon-WienerSimpson指數分別為0.87和2.079，說明枇杷根系的AMF種類較多。

圖2 陽性克隆子確定Fig.2 Identified results of positive clones

圖3 克隆文庫的稀有度飽和曲線Fig.3 The rarefaction curve of clone library

2.4 AMF的系統發育樹分析

運用BLAST軟件分析表明，9個OTU序列中，5個OTU序列與叢枝菌根(AM)真菌根內根生囊霉(Rhizophagusirregularis)部分序列相似性較高，關系比較近；2個OTU序列與不可培養球囊霉(UnculturedGlomus)屬克隆子親緣關系比較近；2個OTU序列與不可培養球囊菌門(Uncultured Glomeromycota)相似度高，關系比較近(表2)。

從GenBank中分別篩選出與9個OTU相似度較高的序列，參與系統發育樹的構建。構建的系統發育樹中看出，9個OTU序列被劃分為2個大的類群。OTU4、OTU5、OTU6、OTU9劃分在一個支系中。在這個支系中，OTU6獨立于其他3個OTU。根據GenBank中相似對比結果，OTU6與根內根生囊霉(Rhizophagusirregularis)相似度較高。進一步細分后，OTU9與 OTU4 、OTU5被劃分為兩個小支系，兩支系間的關系較為相近。OTU9與根內根生囊霉(Rhizophagusirregularis)相似度較高。OTU4被分到兩個不可培養的球囊霉屬(UnculturedGlomus)之間，表明兩者親緣關系較近。OTU5在進化樹中，被分到兩個不可培養的球囊霉屬(UnculturedGlomus)之間，表明三者親緣關系較近。對進化樹支系親緣關系分析并結合GenBank對比結果(表2)表明，OTU4與根內根生囊霉(Rhizophagusirregularis)相似性為99 %，但在進化樹中與2個不可培養的球囊霉屬(UnculturedGlomus)關系較近，可認為OTU4為球囊霉屬(Glomus)的序列，表示該類群；OTU5與不可培養的球囊霉屬(UnculturedGlomus)相似性為100 %，認為OTU5代表該球囊霉屬類型；OTU9、OTU6與根內根生囊霉(Rhizophagusirregularis)相似性為99 %，認為OTU9、OTU6代表該類群，且OTU9和OTU6分別獨立在進化樹的不同分支上，可能代表著比較新穎的根內根生囊霉(Rhizophagusirregularis)。

另一分支中，OTU1、OTU2、OTU3、OTU7和OTU8集聚在一個大的支系，為一個類群，支系中沒有已知的AMF進行比較。且OTU1、OTU2、OTU7與OTU3、OTU8分散在不同的分支上。由表2可知，OTU1、OTU7與GenBank中根內根生囊霉(Rhizophagusirregularis)相似度較高，相似度分別為100 %、99 %，可認為2種序列為根內根生囊霉；OTU2與GenBank中不可培養的球囊霉屬(Glomus)相似度較高，相似度為100 %，可認為OTU2為該類型；OTU3、OTU8與不可培養的球囊菌門(Uncultured Glomeromycota)相似度較高，相似度分別為98 %、99 %，可認為OTU3、OTU8為該類群。OTU1、OTU2、OTU7與GenBank中相近序列的相似性高達99 %～100 %，但在系統進化發育樹中與GenBank中相近序列分開，獨立成為一個新的分支，說明OTU1和OTU7可能代表較為新穎的根內根生囊霉，OTU2可能代表著新穎的球囊霉屬。

9個OTU代表序列在文庫中所對應的克隆子類型和數目不同。由表2可知，主要侵染的AMF類型是根內根生囊霉(Rhizophagusirregularis)和球囊霉屬(Glomus)，從OTU序列數目可知，侵染枇杷根系的主要真菌類群是OTU1和OTU2，OTU3、OTU4、OTU5和OTU6則代表了常見類群，OTU7、OTU8和OTU9為文庫中的少有或稀有AMF種類。

表2 9條OTU序列的BLAST

圖3 枇杷根系AMF 18S rDNA部分序列系統發育樹分析Fig.3 Phylogenetic tree analysis based on AMF 18S rRNA gene partial sequences from loquat roots

3 討 論

AMF是一類具有實際生產應用價值和重要生態學意義的土壤微生物，其在農業生態系統中發揮著重要作用，菌根作為未來的菌肥、生物防治劑和生物調節劑，對于促進植物生長、農田生態系統結構的穩定和農業可持續發展有不可忽視的作用，并被廣泛認同，在農業生產上有著很高的利用價值和廣闊的應用前景。但是，目前還不能實現人工培養AMF真菌，這給研究這類真菌提出了新的難題，成了研究這類真菌一大瓶頸。伴隨新技術的出現，分子生物學方面的技術也不斷得以發展、完善，各種生物技術逐漸應用到AMF的菌種鑒定和群落結構的分析中，甚至多種生物技術的結合協作，克服了傳統研究方法的不足，AMF類型及多樣性的研究更加準確。至今，國外對于這方面的研究比較廣泛，而國內相關的研究比較少，并且研究方式單一，占主導地位的是運用PCR-DGGE分析。龍良鯤等[13]最早使用了DGGE研究AM真菌并陳述的相關的研究結果，不足之處是DNA條帶清晰度不高、重復性不好，作者的觀點是PCR產物太大，使得最終的結果不理想。接偉光等[14]在DGGE技術的基礎上，降低了擴增產物過大的情況，獲得了新的成果。黃檗根系和根際土壤中的AM真菌DNA條帶清晰，可靠性強，在此之后，該作者在AMF真菌孢子的鑒定中又使用DGGE技術[15]。蔡邦平等[16]采用AFLP技術分析了梅根系中AMF的DNA多樣性，得到了理想的結果。與之比較后，筆者認為，本研究采用的rDNA序列分析更具有優勢。它能夠克服DGGE、AFLP方法的不足。DGGE方法獲得的DNA不多，信息量涵蓋少、基因片段長度不夠，AFLP方法的靈敏度低、結果不夠明顯，且具有費用較高，對使用的儀器要求較高的缺點[17]，因此克隆文庫建立必將成為研究AMF多樣性的主要技術手段。

系統進化樹結果表明，9個OTU序列中，有5個序列獨立于一個大分支上，且又分散在兩個小的支系上。其余4個OTU分散在不同序列間，屬于不同的AMF?？傮w呈現大分散，小聚集的序列結構?？梢娗秩捐凌烁档腁MF的種類比較豐富。大多為新穎的AMF類型。這與任禛等[9]在番茄根系中的研究不太一致，在植物的根系中，發現了兩種類型截然不同的AMF。但存在與GenBank中相似性較遠的序列。自然界中的AMF類型眾多，并且不僅僅只局限于人們探明的類型，只有運用合適的實驗手段，才能反映真實的AMF情況。在克隆文庫建立中，為提高實驗結果的準確性，筆者著重于幾方面的實驗過程：第一，目的基因片段使用巢式PCR擴增，特異性強、高靈敏度，對提取到的DNA濃度要求不高，少量的DNA通過擴增，也能獲得目的片段；第二，3次擴增，將引物AM1、AM2和AM3進行混合，混合引物能夠提高特異性，獲得更多文庫中的AMF類型；第三，克隆子數目的增加，提高了實驗的真實性。本實驗對枇杷根系AMF克隆文庫的建立屬于初步研究，第1次巣式PCR擴增中存在非特異性擴增，因此還需要對DNA提取和特異引物選擇等方面進行改進。

通過系統發育樹分析表明，所提取序列較復雜，但都是AM真菌的特異序列，可為后續研究提供參考依據。其中OTU1、OTU2所代表的Rhizophagusirregularis和Glomus屬是侵染枇杷根系的優勢類群，這也是中國農田生態系統中常見的AMF，它們在植物中形成菌根后具有重要的生態學意義。宋放[18]等通過對柑橘根部采樣測序，發現柑橘根系AMF主要為Glomus屬和Rhizophagus屬，其中豐富度最高的菌種是Rhizophagusirregularis、Rhizophagusfasciculatus和Glomussp. W3347，在人工檸條林的根系，利用DGGE技術找到了Glomusintraradices(現常用名為Rhizophagus irregularis)[19]、Glomusfasciculatum、以及其它2種未知AMF類型[20]。任禛[9]曾發現，Glomusmosseae是主要侵染玉米根系的AMF類群。因此，不同的AMF選擇不同植物形成共生關系，不同植物根系內的AMF類群和多樣性也不相同。通過分子生物學的手段，能夠準確認知不同植物根系的AMF群落結構特點，為研究、收集、開發使用AMF資源打下堅實的基礎。目前，在世界范圍內的研究者對AMF熱情高漲。AMF在生態、生理學的研究，新技術的應用等方面均有相關報道。盡管從枝菌根真菌多樣性的研究成為了熱點，也取得了比較多的成就，但目前對于不同生態系統中的AMF多樣性的認識還不夠具體[21]，但可以預知，在未來的叢枝菌根真菌研究發展方向上，對其研究所使用的技術將逐漸大眾化，其應用技術的商品化程度將更高，今后叢枝菌根真菌菌劑將成為農業生產中依賴的生物科學技術之一。

4 結 論

從枇杷根系AMF克隆文庫中發現，球囊霉屬(Glomus)是枇杷根系的主要AMF類群，OUT1和OTU2代表了文庫中的主要類型，其中OTU1為根內根生囊霉(Rhizophagusirregularis)；OTU3、OTU4、OTU5和OTU6代表著文庫中的常見類型；OTU7、OTU8和OTU8則為枇杷根系中的少見或稀有AMF類型。

[1]Yao M, Tweddell R, Desilets H. Effect of two vesicular-arbuscular mycorrhizal fungi on the growth of micropropagated potato plantlets and on the extent of disease caused by Rhizoctonia Solani[J]. Mycorrhiza, 2002, 12(5): 235-242.

[2]林雙雙,孫向偉,王曉娟,等.我國菌根學研究進展及其應用展望[J].草業學報,2013,22(5):310-325.

[3]Idoia Garmendia. Effectiveness of three Glomus species in protecting pepper(CapsicumannuumL.)againstVerticilliumwilt[J]. Biological Control, 2004, 31: 296-305.

[4]余卓玲,梁計南.VA菌根真菌對植物吸收能力及抗逆性的影響研究進展[J].廣東農業科學, 2005(3): 44-47.

[5]補 娟,崔衛東,羅 明.接種叢枝菌根真菌對棉花生長和黃萎病的影響[J].新疆農業科學,2009, 46(3): 549-555.

[6]賀忠群,賀超興,張志斌,等.不同叢枝菌根真菌對番茄生長相關生理因素的影響[J].沈陽農業大學學報, 2006, 37(3): 308-312.

[7]任志雨,賀超興,孫世海,等.叢枝菌根真菌對番茄幼苗生長和礦質元素吸收的影響[J].北方園藝, 2008(4): 35-37．

[8]閆 妍,孫 超,于賢昌,等.低溫脅迫對接種叢枝菌根真菌番茄幼苗生理特性的影響[J].中國農業大學學報, 2011, 16(6): 64-69.

[9]任 禛,王建武,馮遠嬌,等.應用克隆文庫研究玉米根系AMF多樣性方法的建立[J].玉米科學, 2011, 9(5): 19-24.

[10]Vincent C, David R, Alain O, et al. Molecular analysis of arbuscular mycorrhizal community structure and spores distribution in tree-based intercropping and forest systems[J]. Agriculture, Ecosystems and Environment, 2009, 131: 32-39．

[11]Moyer C L, Tiedje J M, Dobbs F C. A computer-simulated restriction fragment length polymorphism analysis of bacterial small-subunit rRNA genes: efficacy of selected tetrameric restriction enzymes for studies of microbial diversity in nature[J]. Applied and Environment Microbiology, 1996, 62(7): 2501-2507.

[12]Ravenschlag K, Sahm K, Pernthaler J. High bacterial diversity in permanently cold marine sediments[J]. Applied and Environment Microbiology, 1999, 65(9): 3892-3989.

[13]龍良鯤,羊宋貞,姚 青,等.AM真菌DNA提取與PCR-DGGE分析[J].菌物學報,2005,24(4): 564-569．

[14]接偉光,蔡柏巖,葛菁萍,等.黃檗叢枝菌(AM)真菌PCR-DGGE條件研究[J].黑龍江大學自然科學學報, 2008, 25(4): 534-538．

[15]蔡柏巖,接偉光,葛菁萍,等.黃檗根圍叢枝菌根(AM)真菌的分離與分子鑒定[J].菌物學報,2008, 27(6): 884-893.

[16]蔡邦平,陳俊愉,張啟翔,等.梅根系叢枝菌根真菌AFLP分析[J].北京林業大學學報,2012,34(增刊1): 82-87.

[17]Johnson D, Vandenkoornhuyse P J, Leake J R. Plant comunities affect arbuscular mycorrhizal fungal diversity and community composition in grassland microcosms[J]. New Phytol, 2004, 161(2): 503-515.

[18]宋 放,安劍勇,白福璽.柑橘叢枝菌根真菌群落結構鑒定[A].見：杜永臣.中國園藝學會2014年學術年會論文摘要集[C]. 南昌：中國園藝學會、中國農業科學院蔬菜花卉研究所, 2014: 1-2.

[19]李曉亮.藏東南地區海拔和土地利用方式對叢枝菌根真菌多樣性和群落結構的影響[D].中國農業大學, 2015:87-89.

[20]劉永俊,馮虎元.不同演替階段人工檸條林叢枝菌根真菌分子多樣性研究[J].中國沙漠,2009, 29(6): 1141-1147.

[21]汪 茜, 張金蓮, 龍艷艷,等. 廣西柳江生姜根際土壤叢枝菌根真菌資源研究[J].西南農業學報,2016,29(1): 115-119.

StudyonSpeciesDiversityofAMFCommunityColonizingLoquatRootsbyConstructingCloneLibrary

YIN Li-fang1, REN Zhen1,2,3*, XIA Ti-yuan1**, ZHU Wei-xian4, CHEN Ze-bin1,2, JIN Song1, YAN Jia-liang1, ZHAO Xiao-hong1

(1.Agriculture College, Kunming University, Yunnan Kunming 650214, China; 2.Engineering Research Center for Characteristics Agriculture of Yunnan Province, Yunnan Kunming 650214, China; 3.Key Laboratory of Special Biological Resource Development and Utilization of Universities in Yunnan Province, Yunnan Kunming 650214, China; 4.Kunming Academy of Agriculture Science, Yunnan Kunming 650034, China)

【Objective】This study aimed to find the effective research methods for exploring and utilizing valuable AMF resources.【Method】The roots of loquat were collected randomly as experimental samples from Kunming University. The 18S rRNA partial gene clone library was established by connected DNA which used the CTAB method and amplified toEscherichiacoliJM109. 30 positive clones that were selected randomly from 35 white clones in the library were sequenced. The Mothur software analyzed the sequence of positive clones, and got 9 different AMF sequences.【Result】The Coverage C of the clone library was 93.3 %. The Shannon-Wiener was 2.079, and the Simpson index was 0.87 in the clone library, the curve was saturated. The 9 sequences were divided into two distinct groups representing different AMF species;Glomuswas the main AMF groups of loquat root. OUT1 and OTU2 represented the main types of the library, here OTU1 wasRhizophagusirregularis. OTU3, OTU4, OTU5 and OTU6 represented the common types of the library; the rest sequences were rare AMF types.【Conclusion】Glomusis the main type of AMF in the roots of loquat, in whichRhizophagusirregularisis the dominant AMF species.

Loquat; AMF; Clone library; 18S rRNA gene; Phylogenetic analysis

1001-4829(2017)5-1009-07

10.16213/j.cnki.scjas.2017.5.005

2016-09-29

云南省都市特色農業工程技術研究中心項目(TSNY0201)；云南省教育廳科學研究基金項目(2014Y390)；云南省應用基礎研究青年項目(2013FD040)；云南省應用基礎研究自籌項目(2013FZ099)；昆明學院人才引進項目(YJL14005)；昆明學院人才引進基金項目(YJL12010)；昆明學院校立重點基金項目(XJL12020)；昆明學院大學生科研項目(XJD16081)；云南中煙品牌省內原料產地生態與主栽品種合理布局研究項目；云南省高校優勢特色重點學科(生態學)建設項目資助(05000511311)；昆明市農業局滇池流域農業面源污染綜合防控對策研究(2016JC01)；云南省高校特色生物資源開發與利用重點實驗室開放基金項目(GXKJ201623)

尹利方(1981-)，女，云南昆明人，碩士，講師，主要從事都市農業的教學科研工作，E-mail: 563454379@qq.com；*為共同第一作者，E-mail: 10067994@qq.com，**為通訊作者，E-mail: xiatiyuan@sohu.com。

S667.3

A

(責任編輯 王家銀)