脫酰胺對葵花籽蛋白酶解肽的鈣結合量及體外消化性的影響

袁興宇 馮文君 包小蘭

(內蒙古農業大學食品科學與工程學院，呼和浩特 010018)

脫酰胺對葵花籽蛋白酶解肽的鈣結合量及體外消化性的影響

袁興宇 馮文君 包小蘭

(內蒙古農業大學食品科學與工程學院，呼和浩特 010018)

通過谷氨酰胺酶對葵花籽蛋白酶解肽進行脫酰胺，得到脫酰胺的葵花籽蛋白酶解肽，以此為試樣，研究脫酰胺對葵花籽蛋白酶解肽的鈣結合能力的影響。結果發現，脫酰胺的葵花籽蛋白酶解肽的鈣結合量由72.97 mg/g顯著增加到98.20 mg/g，說明脫酰胺可以顯著提高葵花籽蛋白酶解肽的鈣結合量；通過傅立葉紅外光譜對脫酰胺前后葵花籽蛋白酶解肽的鈣結合位點進行分析，發現葵花籽蛋白酶解肽與鈣結合后，氨基的特征吸收峰均發生移動，N-H的伸縮振動帶由3 323 cm-1移動至3 340 cm-1，酰胺Ⅱ帶由1 160 cm-1移動至1 656 cm-1，酰胺Ⅲ帶由1 241 cm-1移動至1 246 cm-1，同時脫酰胺使其酰胺Ⅰ帶由1 660 cm-1移動至1 656 cm-1，說明葵花籽蛋白酶解物肽鏈上的氨基及羧基是鈣的主要結合位點，且脫酰胺后C=O伸縮振動引起的酰胺Ⅰ帶進一步向低頻移動，表明脫酰胺后羧基上的氧原子與鈣的配位作用得到增強，促進了葵花籽蛋白酶解肽鈣結合量的提高；另一方面研究還發現體外消化后脫酰胺的葵花籽蛋白酶解肽鈣復合物的鈣結合量能保持86%以上，與未脫酰胺的花籽肽鈣復合物相比消化后的鈣結合量提高24%以上。表明脫酰胺能夠顯著提高葵花籽蛋白酶解肽鈣復合物的消化穩定性，即提高葵花籽蛋白酶解肽的鈣結合穩定性。

葵花籽蛋白酶解肽 鈣結合能力 脫酰胺 消化穩定性

前期研究發現，葵花籽蛋白酶解肽肽鏈上的羧基及氨基與鈣離子結合形成水溶性復合物[1]，如何進一步提高葵花籽蛋白酶解肽的鈣結合量及其穩定性對其促進人體鈣吸收的研究具有重要意義。有研究表明，通過谷氨酰胺酶對大豆蛋白酶解肽進行脫酰胺處理，可以顯著提高大豆蛋白酶解肽的鈣結合量及鈣結合穩定性，提高其對胃蛋白酶及胰蛋白酶的消化的抑制能力[2]?？ㄗ训鞍酌附怆呐c大豆酶解肽均是重要的植物性蛋白來源的多肽，谷氨酰胺酶是否也會對葵花籽蛋白酶解肽的鈣結合能力及消化穩定性產生影響還尚不清楚。

本研究探討了脫酰胺對葵花籽蛋白酶解肽鈣結合量及結合穩定性的影響，以期為進一步探究葵花籽蛋白酶解肽對促進人體鈣吸收作用提供參考。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

葵花籽分離蛋白:自制；Protease M(51.5 AU/g,粉體)、谷氨酰胺酶:日本天野酶制劑株式會社；氫氧化鈉、鹽酸、無水氯化鈣、醋酸、醋酸鈉、磷酸氫二鈉等:國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 主要儀器與設備

AL204電子天平：梅特勒-托利多儀器有限公司；HJ-6電熱恒溫水浴鍋：金壇市城西春蘭儀器廠；PB-10酸度計：賽多利斯科學儀器北京有限公司；MS-H280-PRO恒溫加熱磁力攪拌器：大龍興創實驗儀器有限公司；SC-3612低速離心機：安徽中科中佳科學儀器有限公司；LGJ-25C冷凍干燥機：北京四環科技有限公司；BCD-223MTX新飛冰箱：河南新飛電器有限公司；HJ-1磁力攪拌器：金壇市榮華儀器制造公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 葵花籽蛋白酶解肽的制備

稱取1g葵花籽分離蛋白于燒杯中，加入50 mL蒸餾水，用1 mol/L HCl調節pH至3，放入50 ℃恒溫水浴鍋中加入0.01 g protease M。酶解溫度保持50 ℃，酶解時間60 min。酶解后90 ℃水浴滅酶10 min。冷卻至室溫，3 000 r/min離心20 min后取上清液，用1 mol/L NaoH調節pH至7.4后冷凍干燥備用。

1.3.2 水解度的測定[3]

將水解液定容至50mL，吸取20 mL樣品2份，分別置于燒杯中，加水50 mL，用0.05 mol/L NaOH標準溶液滴定至pH 8.2。加入10 mL中性甲醛溶液，混勻，再用0.05 mol/L NaOH標準溶液滴定至pH 9.2，記錄消耗NaOH標準溶液體積，同時做空白對照試驗[3]。水解度測定結果計算公式：

式中：V1為空白試劑加入甲醛后滴定消耗的氫氧化鈉標準溶液的體積/mL；V2為測定樣品加入甲醛后消耗的氫氧化鈉標準溶液的體積/mL；c為氫氧化鈉標準溶液的濃度/mol/L；V3為水解液總體積/mL；V4為滴定用水解液的體積/mL；

1.3.3 葵花籽蛋白酶解肽的脫酰胺的方法

將葵花籽蛋白酶解肽配置成2 %溶液，在pH 7.0、溫度為50 ℃的條件下添加谷氨酰胺酶(E/S=1/50)進行酶解，在反應時間為0、1、2、3、4h時分別取樣，真空冷凍干燥備用[4-5]。

1.3.4 葵花籽蛋白酶解肽脫酰胺率的測定方法[6]

稱取樣品0.05 g于螺口培養管中，加入5 mL、3 mol/L鹽酸，放入110 ℃烘箱中，3 h后取出。然后取康威氏皿，在中央內室加入2 %硼酸3 mL和指示劑1滴，在外室一側加入處理好的樣品2 mL，另一側加飽和K2CO3溶液3 mL，將康威氏皿放入30 ℃恒溫箱中，36 h后取出。最后用0.01 mol/L HCL滴定內室吸收液，以藍紫色為終點。脫酰胺率的計算公式如下：

脫酰胺率=

1.3.5 脫酰胺葵花籽蛋白酶解肽鈣復合物的制備及鈣結合量的測定

稱取脫酰胺后的葵花籽蛋白酶解肽溶解于蒸餾水中，在37 ℃水浴中放置10 min，使其充分溶解。然后加入0.06 mol/L的CaCl2溶液，反應30 min后，離心(4 500 r/min，20 min)去除沉淀。取上清液加入到透析袋(MWCO：500 u，10 cm×31 mm)中，將透析袋用專用夾夾緊，轉移到裝有蒸餾水的燒杯中，在冰箱內(4 ℃)用磁力攪拌器進行透析，以除去酶解物中沒有結合的游離鈣。透析過程中每4 h更換一次透析液，持續透析48 h，取部分樣品冷凍干燥，即為葵花籽蛋白酶解肽鈣復合物。其余樣品移到25 mL容量瓶中，透析袋用蒸餾水沖洗3次，定容到30 mL，采用原子吸收光譜法測定透析液中鈣的含量。

1.3.6 傅里葉變換紅外光譜分析[7]

稱取微量凍干粉樣品放于金剛石窗片上，壓平后用Nic-Plan 紅外顯微鏡(美國Nicolet公司)在Magna-IR 750傅里葉變換紅外光譜儀檢測，掃描64次，分辨率為4 cm-1。

1.3.7 脫酰胺葵花籽蛋白酶解肽的肽鈣復合物的消化試驗

胃蛋白酶消化試驗：將脫酰胺的葵花籽蛋白酶解肽肽鈣復合物配制成0.5%(m/V)的溶液，用1 mol/L的HCl將溶液的pH調到2.0，加入1%(E/S)的胃蛋白酶在37 ℃條件下進行消化，消化到120 min時分別取出樣品，在沸水中加熱5 min滅酶，轉移至透析袋(MWCO：500 u)中，然后透析。透析48 h，分別收集透析液，測定其鈣含量。

胰蛋白酶消化試驗：將上述經胃蛋白酶消化后的析液樣品溶液用1 mol/L的NaOH將溶液的pH調到7.4，加入1%(E/S)胰蛋白酶在37 ℃條件下繼續消化，消化到240 min取出樣品，80 ℃加熱15min滅酶，將樣品轉移至透析袋(MWCO：500 u)中透析48 h，分別收集透析液，測定其鈣含量。

1.3.8 統計與分析

每個試驗重復3次，對脫酰胺葵花籽蛋白酶解肽的鈣結合能力、脫酰胺率及消化后脫酰胺蛋白酶解肽的鈣結合能力的數據進行分析，利用SPSS19.0軟件進行統計分析，差異顯著性水平為0.05。

2 結果與分析

2.1脫酰胺對葵花籽蛋白酶解肽的鈣結合量的影響

前期研究發現酶解60 min水解度為10.2 %的葵花籽蛋白酶解肽的鈣結合量為72.97 mg/g，其鈣結合量顯著高于酶解30、90、120、150 min的酶解產物的鈣結合量，因此選取酶解時間為60 min的產物進行進一步研究。以葵花籽分離蛋白為原料，采用蛋白酶protease M將其酶解60 min獲得葵花籽蛋白酶解產物，進一步采用谷氨酰胺酶對其進行脫酰胺處理，在1、2、3、4 h分別取樣，獲得脫酰胺的葵花籽蛋白酶解產物，測定其脫酰胺率及鈣結合量，結果如表1所示。

表1 葵花籽蛋白酶解肽的脫酰胺率及鈣結合量

結果發現，葵花籽蛋白酶解肽的鈣結合能力隨著脫酰胺時間及脫酰胺率的增加得到了顯著的提高，在脫酰胺時間為180 min、脫酰胺率為20.42%時其鈣結合量達到97.37 mg/g。繼續延長脫酰胺時間，葵花籽蛋白酶解肽的脫酰胺率及鈣結合量無顯著變化(P<0.05)。說明脫酰胺可以提高葵花籽蛋白酶解肽的鈣結合量。脫酰胺反應是一種肽分子修飾及改性的重要手段，通過谷氨酰胺酶將蛋白質或肽側鏈上的酰胺基團脫去轉變為羧基的反應[8]，能增加金屬離子與肽的結合位點[9]。前期研究發現，大豆肽與鈣的結合位點主要是其肽鏈上天冬酰胺及谷氨酰胺上的羧基，經過脫酰胺處理后可提高大豆肽的鈣結合量[10]，大豆肽脫酰胺后鈣結合量增加的主要原因是通過脫酰胺反應使肽鏈上的羧基更多暴露出來，從而增加了鈣的結合位點。本試驗采用谷氨酰胺酶對葵花籽蛋白酶解肽進行脫酰胺，也提高了葵花籽蛋白酶肽的鈣結合能力，說明脫酰胺可以提高大豆肽、葵花籽肽等植物蛋白來源多肽的鈣結合量。

由先前試驗可知，脫酰胺可以顯著提高葵花籽蛋白酶解肽的鈣結合能力，但葵花籽蛋白酶解肽與鈣的具體結合位點及脫酰胺對其產生的影響依然尚未明確。肽鏈上不同基團由于分子伸縮振動、變形振動在紅外光譜中會形成特征吸收峰，可以反映有機配體與金屬離子螯合的結合信息[11]。通過傅里葉變換光譜紅外對脫酰胺的葵花籽蛋白酶解肽進行分析，明確其結合機制。結果如表2、圖1所示。

表2 脫酰胺后葵花籽蛋白酶解肽及其肽鈣復合物的中紅外光譜

注：酶解物字母含義與圖1一致。

注：A表示未加鈣的葵花籽蛋白酶解物；B表示加鈣反應的葵花籽蛋白酶解物；C表示加鈣反應的脫酰胺率為15.18%葵花籽蛋白酶解肽;D表示加鈣反應的脫酰胺率21.17%的葵花籽蛋白酶解肽。圖1 葵花籽蛋白酶解肽及其肽鈣復合物的中紅外光譜

2.2脫酰胺對葵花籽蛋白酶解肽鈣復合物消化穩定性的影響

研究食物源蛋白質派生出來的肽的生理活性，需要證明食物蛋白質在消化道中是否被消化道中的蛋白酶消化，形成游離狀態的小分子肽[12]，如果是消化道中的蛋白酶以外的蛋白酶酶解得到的肽及還需要明確對消化道中的蛋白酶的耐受性[13]，研究發現肽鈣復合物通過消化系統在小腸中直接被小腸刷狀緣細胞吸收到細胞或血液中，提高鈣在機體內的生物利用率[14]，因此研究肽鈣復合物對胃蛋白酶及胰蛋白酶的消化穩定性具有重要的意義。本次主要研究脫酰胺對葵花籽蛋白酶解肽鈣復合物消化穩定性及其鈣結合量的影響。蛋白質在胃里消化是胃蛋白的最佳pH為1～2，在十二指腸消化時里胰蛋白酶的最佳pH為7～8。食物在胃里半排空的時間是0.5～3 h，在十二指腸、空腸的駐留時間是2～2.7 h[15]，因此，為了更好的模擬體內消化道環境，采用體外胃蛋白酶和胰蛋白酶水解模式來模擬消化道環境[16]，確定消化時間為胃蛋白酶消化2 h，胰蛋白酶消化2 h[17]，對脫酰胺化的可溶性葵花籽蛋白酶解肽鈣復合物作消化處理，測定處理前后的鈣結合量，結果如表3、表4所示。

表3 胃蛋白酶、胰蛋白酶消化不同時間的葵花籽蛋白酶解肽鈣復合物的鈣結合量

表4 胃蛋白酶、胰蛋白酶消化不同時間的脫酰胺葵花籽蛋白酶解肽鈣復合物的鈣結合量

從表3、表4中可以看出，經胃蛋白酶及胰蛋白酶消化后，脫酰胺的葵花籽蛋白酶解肽鈣復合物的鈣結合量能保持86 %以上，與未脫酰胺的葵花籽蛋白酶解肽鈣復合物相比消化后的鈣結合量提高了24%，且顯著高于未脫酰胺的葵花籽蛋白酶解肽鈣復合物的鈣結合量的保持率(P<0.05)。前期研究發現，鈣離子易與氨基酸羧基配位，與氮配位原子作用較弱，谷氨酰胺和天冬酰胺同時含氧、氮配位原子[18]，脫酰胺后肽鏈上的氮配位原子減少而含氧配位原子增加，使肽鏈上的羧基與鈣的結合位點增加，鈣結合能力更強，從而提高其消化穩定性。結果表明脫酰胺能夠提高葵花籽蛋白酶解肽鈣復合物的抵抗胃蛋白酶及胰蛋白酶消化的能力；脫酰胺可以提高葵花籽蛋白酶解肽的鈣結合穩定性。

3 結論

3.1 葵花籽蛋白酶解肽的鈣結合能力隨著脫酰胺時間及脫酰胺率的增加得到了顯著的提高，表明脫酰胺可以提高葵花籽蛋白酶解肽的鈣結合量。通過傅立葉紅外光譜對葵花籽蛋白酶解肽的鈣結合位點進行分析，表明葵花籽蛋白酶解物肽鏈上的氨基及羧基是鈣的主要結合位點，且脫酰胺后C=O伸縮振動引起的酰胺Ⅰ帶進一步向低頻移動，表明脫酰胺后羧基上的氧原子與鈣的配位作用得到增強，促進了葵花籽蛋白酶解肽鈣結合量的提高。

3.2 通過胃蛋白酶及胰蛋白酶消化試驗，表明脫酰胺可以提高葵花籽肽鈣復合物對胃蛋白酶和胰蛋白酶消化的抑制作用，即提高了葵花籽蛋白酶解肽的鈣結合穩定性。

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Effect of Deamidation of Sunflower Seed Protein Peptide on Amount of Calcium andinvitroDigestibility

Yuan Xingyu Feng Wenjun Bao Xiaolan

(College of Food Science and Technology, Inner Mongolia Agricultural University, Huhehaote 010018)

Sunflower seed protein peptide of deamidation, which is prepared by deamidation of sunflower seed protein peptide using glutaminase, was the objects of research on effect of deamidation of sunflower seed protein peptide on Amount of Calcium. The results showed that the amount of calcium of deamidation of sunflower seed protein peptide increased from 72.97 mg/g to 98.20 mg/g significantly. The deamidation of the sunflower tryptic peptide samples was analyzed by Fourier infrared spectrum. Amino characteristic absorption peaks were moved. The N—H stretching vibration band were moved from 332 3 cm-1to 334 0 cm-1.The amide Ⅱ band were moved from 116 0 cm-1to 165 6 cm-1.The amide III band were moved from 124 1 cm-1to 124 6 cm-1.The deamidation cause the amide I band were moved from 166 0 cm-1to 165 6 cm-1. The results showed that the Amino and carboxyl groups on the peptide chain of Sunflower seed protein peptide were mainly calcium binding sites. The C=O stretching vibration caused by the amide I band further to the low frequency shift after deamidation. It showed that the coordination of oxygen atoms and calcium in the carboxyl group was enhanced, which promoted the increase of the calcium binding capacity of the sunflower seed protein. On the other hands, the study also found that deamidation of sunflower seed protein peptide calcium complexes had high maintain ability to calcium binding amount more than 86% which was increased more than 24% obviously compared with sunflower seed protein peptide calcium complexes. The results showed that the digestion stability of sunflower seed peptide calcium complex substance was enhanced by deamidation and the calcium binding stability of sunflower seed peptide was increased.

sunflower seed protein peptide, amount of calcium, glutaminase, digestion stability

TS201.2

A

1003-0174(2017)10-0073-05

國家自然科學基金地區科學基金(31460404)

2016-08-30

袁興宇，男，1992年出生，碩士，糧食油脂及植物蛋白工程

包小蘭，女，1969年出生，副教授，植物蛋白加工利用