紫花地丁中的抗補體生物堿類成分研究

杜冬生+程志紅+陳道峰

[摘要] 研究中藥紫花地丁Viola yedoensis的抗補體活性成分。采用硅膠、Sephadex LH-20等柱色譜方法，從紫花地丁全草95%乙醇提取物中分離得到15個化合物，通過波譜數據鑒定為生物堿類化合物，分別為：neoechinulin A（1）、N-benzoyl-L-p-hydroxy-phenylalaninol（2）、金色酰胺醇酯（3）、金色酰胺醇（4）、傘形香青酰胺（5）、栝樓酯堿（6）、吲哚-3-甲酸甲酯（7）、3-吲哚甲酸（8）、N-反式對羥基苯乙基阿魏酰胺（9）、N-p-香豆酰酪胺（10）、7′-（3′，4′-dihydroxyphenyl）-N-[（4-methoxyphenyl）ethyl]propenamide（11）、cannabisin F（12）、N-（4-hydroxyphenethyl）octacosanamide（13）、N-（4-hydroxyphenethyl）hexacosanamide（14）和N-benzoyl-L-phenylalaninol（15）。除化合物3和4外，其余化合物均為首次從該植物中分離得到?；衔?～6， 8～12對補體系統的經典和旁路途徑有不同程度的抑制活性：對經典途徑的CH50在0.12～0.33 g·L-1，對旁路途徑的AP50在0.22～0.50 g·L-1。對補體作用靶點研究表明，不同生物堿化合物其作用于補體的靶點不同。

[關鍵詞] 紫花地??； 抗補體； 生物堿； 酰胺

[Abstract] Fifteen alkaloids were isolated from the 95% ethanol extract of the whole plants of Viola yedoensis by various column chromatographic techniques such as silica gel and Sephadex LH-20. Their structures were identified as neoechinulin A（1），N-benzoyl-L-p-hydroxy-phenylalaninol（2），aurantiamide acetate（3），aurantiamide（4），anabellamide（5），trichosanatine（6），indole-3-carboxylic acid methyl ester（7），3-carboxyindole（8），N-trans-feruloyl-tyramine（9），paprazine（10），7′-（3′， 4′-dihydroxyphenyl）-N-[（4-methoxyphenyl）ethyl]propenamide（11），cannabisin F（12），N-（4-hydroxyphenethyl）octacosanamide（13），N-（4-hydroxyphenethyl）hexacosanamide（14）and N-benzoyl-L-phenylalaninol（15）. All the compounds except 3 and 4 were isolated from this plant for the first time. These alkaloids exhibited anti-complement activity against the classical pathway（CP）and the alternative pathway（AP）with the CH50 and AP50 values ranging from 0.12 to 0.33 g·L-1 and 0.22 to 0.50 g·L-1， respectively. Preliminary mechanism study using complement-depleted sera showed that these alkaloids acted on different complement components in the complement activation cascade.

[Key words] Viola yedoensis； anti-complement； alkaloids； amides

紫花地丁為堇菜科植物紫花地丁Viola yedoensis Makino的干燥帶根全草，味苦、辛，性寒，具有清熱解毒、涼血消腫等功效；用于治療黃疸內熱、疔瘡腫毒、喉痹腫痛等疾病[1]?，F代藥理研究表明，其具有抗菌、抗炎、抗病毒、抗凝血、調節免疫等作用[2-3]。紫花地丁的化學成分主要有黃酮及其苷類和香豆素類等[2-3]。為了進一步了解紫花地丁的化學成分，本課題組對其進行了系統的化學成分研究，前期報道了從紫花地丁中分離鑒定的10個倍半萜類化合物[4]和6個黃酮碳苷類化合物[5]。本研究從紫花地丁全草的95%乙醇提取物中分離得到15個生物堿類化合物，分別鑒定為neoechinulin A（1）、N-benzoyl-L-p-hydroxy-phenylalaninol（2）、金色酰胺醇酯（3）、金色酰胺醇（4）、傘形香青酰胺（5）、栝樓酯堿（6）、吲哚-3-甲酸甲酯（7）、3-吲哚甲酸（8）、N-反式對羥基苯乙基阿魏酰胺（9）、N-p-香豆酰酪胺（10）、7′-（3′，4′-dihydroxyphenyl）-N-[（4-methoxyphenyl）ethyl]propenamide（11）、cannabisin F（12）、N-（4-hydroxyphenethyl）octacosanamide（13）、N-（4-hydroxyphenethyl）hexacosanamide（14）和N-benzoyl-L-phenylalaninol（15）。這些化合物除3和4外，均為首次從該植物中分離得到。對這些生物堿類化合物抗補體經典途徑和旁路途徑的抑制活性進行了研究；在此基礎上對部分活性較強化合物作用于補體系統的靶點進行了初步研究。endprint

1 材料

JASCO P-1020型全自動旋光儀；Agilent SLG1946D型質譜儀；Bruker DRX 400型核磁共振光譜儀；上海通微EasySep-1010型半制備液相色譜儀；柱色譜硅膠H（200～300 目）為青島海洋化工廠生產；Sephadex LH-20葡聚糖凝膠為瑞典Pharmacia公司生產；反相柱色譜硅膠填料為日本YMC公司生產；薄層色譜板為煙臺市芝罘黃務硅膠開發試驗廠生產；石油醚、丙酮、乙酸乙酯、乙醇等試劑為分析純。

紫花地丁購自上海華宇藥業有限公司，經復旦大學生藥學教研室程志紅副研究員鑒定為堇菜科植物紫花地丁V. yedoensis的干燥帶根全草，憑證標本紫花地?。∟o. DH2008082905）保存于復旦大學藥學院生藥學教研室。

2 提取和分離

干燥紫花地丁全草20 kg，室溫下以95%乙醇滲漉提取4次，減壓濃縮得浸膏812 g；浸膏懸浮于蒸餾水中，依次用石油醚和乙酸乙酯萃取，得到石油醚萃取物323 g、乙酸乙酯萃取物180 g。

乙酸乙酯萃取物經硅膠柱色譜，以石油醚-丙酮（0∶100～1∶1）梯度洗脫，得到7個部分（Fr. 1～Fr. 7）。Fr. 4（石油醚-丙酮20∶1洗脫部分，12.4 g）經硅膠柱色譜，以石油醚-乙酸乙酯（50∶1～5∶1）梯度洗脫，其中石油醚-乙酸乙酯（20∶1）部分經反復硅膠柱色譜及Sephadex LH-20凝膠柱色譜（二氯甲烷-甲醇，1∶1）分離純化得到化合物1（15 mg），2（20 mg），3（14 mg），4（20 mg），5（67 mg），6（8 mg），7（16 mg）；石油醚-乙酸乙酯（10∶1）部分經反復硅膠柱色譜分離純化得到化合物8（9 mg），9（18 mg），10（5 mg），11（8 mg），12（8 mg），13（19 mg），14（8 mg）。Fr. 5（石油醚-丙酮10∶1洗脫部分，21.5 g）經硅膠柱色譜，石油醚-乙酸乙酯（20∶1～5∶1）梯度洗脫，其中石油醚-乙酸乙酯（20∶1）部分經反復硅膠柱色譜及Sephadex LH-20凝膠柱色譜（二氯甲烷-甲醇，1∶1）分離純化得到化合物15（39 mg）。

3 結構鑒定

4 體外抗補體活性與補體作用靶點研究

4.1 經典途徑和旁路途徑抗補體活性測定[19] 抗補體活性測定按照本課題組前期報道的方法進行。測定了所有化合物1～15的抗補體活性，結果見表1?；衔?～6和8～12對補體系統的經典和旁路途徑有不同程度的抑制活性，CH50和AP50分別為0.12～0.33 g·L-1和0.22～0.50 g·L-1。這些酰胺類生物堿可分為含有苯酰胺片段（2～6，15）和苯丙酰胺片段（9～14）2種，存在苯酰胺片段的化合物中傘形香青酰胺（5）活性最強，CH50和AP50分別為（0.12±0.07） g·L-1和（0.22±0.06 ） g·L-1，其次是3，4，6。具有苯丙酰胺片段的化合物中cannabisin F（12）活性最強，CH50和AP50分別為（0.16±0.07），（0.26±0.11） g·L-1，其次是10，9，11。本文中的酰胺生物堿類化合物抗補體活性為首次報道。

4.2 部分活性化合物的補體作用靶點確定[19] 為進一步了解這些抗補體活性酰胺生物堿的補體抑制作用，本研究也按照本課題組前期報道的方法分別選取含苯酰胺片段的化合物4和5以及含苯丙酰胺片段的化合物9和10進行抗補體作用靶點的研究，結果見圖1。對于補體系統的C1q，C2，C5，C9組分，化合物4的靶點組較相應缺失血清組溶血能力未能恢復；而對于C3和C4組分，化合物4的靶點組較相應的缺失血清組溶血能力顯著恢復，表明化合物4作用于補體系統的C1q，C2，C5，C9組分，見圖1A。類似的，化合物5，9，10分別作用于補體的C1q，C2，C3，C5，C9，見圖1B；C1q，C3，C9，見圖1C；和C1q，C3，C5，C9組分，見圖1D。這4個化合物均作用于補體系統的C1q和C9組分，不同之處在于是否還同時作用于補體的C2，C3或C5組分。該研究表明，盡管這些化合物均具有抗補體活性，但是其在補體作用靶點上并不完全相同。

5 討論

本研究從紫花地丁全草95%乙醇提取物的乙酸乙酯萃取部位分離鑒定了15個酰胺生物堿類化合物，其中13個化合物為首次從紫花地丁中分離得到。同時對分離得到的所有化合物進行了體外抗補體經典途徑和旁路途徑的抗補體活性篩選，進而對部分活性化合物的補體作用靶點進行了初步研究。結果表明，11個化合物能夠不成程度地通過經典途徑或旁路途徑發揮抗補體作用。且補體作用靶點研究表明，這些活性化合物的補體作用靶點并不完全相同，提示紫花地丁中不同的化合物可通過抑制補體不同靶點或多靶點發揮抗補體作用。

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[責任編輯 丁廣治]endprint