普洱茶、紅茶、綠茶中真菌毒素的檢測

王鷺+楊驊+謝國祥+賈偉

[摘要] 檢測茶葉中黃曲霉毒素（B1，B2，G1和G2）、伏馬霉素（FB1， FB2， FB3）和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇，明確茶葉中的真菌毒素含量范圍并為茶葉監管提供依據。采用有機溶劑（0.1%甲酸乙腈溶液）以及80 ℃熱水2種方法提取茶葉中的真菌毒素，利用超高效液相色譜串聯質譜（UPLC-MS/MS）法進行分析測定。黃曲霉毒素B1，G1的線性范圍為39.1～5 000 ng·L-1，黃曲霉毒素B2，G2的線性范圍為 117～15 000 ng·L-1；伏馬霉素（FB1， FB2， FB3）的線性范圍為2.44～313 ng·L-1；脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的線性范圍為3 125～5 000 ng·L-1。所得8種真菌毒素的回歸方程均有良好的線性關系 （r≥0.999 0），回收率為85.7%～99.6%，相對標準偏差<10%。對20種國際市售茶葉中的8種真菌毒素進行測定，結果顯示采用有機溶劑提取法，包括普洱茶、紅茶、綠茶在內的多種茶葉產品都不同程度含有微量的真菌毒素，其中黃曲霉毒素B2在6種茶葉產品中被檢測到，黃曲霉毒素G1在3種茶葉中被檢測到，伏馬霉素FB1在2種茶葉中被檢測到，伏馬霉素FB2在一種茶葉中被檢測到。而采用熱水提取方法，只有一種茶葉產品的茶湯中檢測到微量的伏馬霉素B1，B2，其他各種茶葉的茶湯中均未檢出毒素。以上2種方法檢出的真菌毒素含量在0.15～7.31 μg·kg-1，均未超過國際食品安全規定的真菌毒素限量。80 ℃熱水提取模擬實際的飲茶方法，更能準確地檢測茶葉中進入茶湯的真菌毒素，適用于茶葉（采用熱水沖泡的）飲用產品，而有機溶劑萃取法適用于食用產品中霉菌毒素絕對含量的檢測。

[關鍵詞] 黃曲霉毒素； 伏馬霉素； 脫氧雪腐鐮刀菌烯醇； 液質聯用； 普洱茶； 紅茶； 綠茶

[Abstract] To establish a robust method for the determination of mycotoxins in tea samples， and to provide means for the quality and safety control of tea products. Samples of 20 tea products acquired from international market were extracted by organic solvents （acetonitrile containing 0.1% formic acid） or hot water， respectively. The extracts were analyzed by UPLC-MS/MS.A good linear regression was achieved in a range of 39.1 to 5 000 ng·L-1for aflatoxin B1 （AFB1） and aflatoxin G1 （AFG1）， 117 to 15 000 ng·L-1 for aflatoxin B2 （AFB2） and aflatoxin G2 （AFG2）， 2.44 to 313 ng·L-1for fumonisin B1 （FB1）， fumonisinB2 （FB2） and fumonisin B3 （FB3）， and 3 125 to 5 000 ng·L-1for deoxynivalenol， with recovery rates between 85.7% and 99.6%. The coefficient of the linear equation for all standards was greater than 0.999 0， and the RSD value was less than 10%. Mycotoxins were detected in several tea samples using the two extraction methods but with different outcomes. The levels of mycotoxins detected ranging from 0.15 to 7.31 μg·kg-1 were well below the State or US FDA regulation limits of mycotoxins in food products. Both methods are simple， accurate， and sensitive， and thus， suitable for the quantitative determination of mycotoxins in different food products. The method with the 80 ℃ hot-water extraction is more appropriate to determine the trace amounts of mycotoxins in tea leaves that are likely to be present in brewed tea liquor， while organic solvent method is more suitable for the detection of mycotoxins in ingestible foods.

[Key words] aflatoxins； fumonisins； deoxynivalenol； UPLC-MS/MS； pu-erh tea； black tea； green tea

中國是茶的故鄉和茶文化的發源地，茶的發現和利用在中國已有數千年的歷史，唐代陸羽《茶經》中認為最早利用茶的是神農氏—— “茶之飲，發乎神農”。傳說中“神農嘗百草，日遇七十二毒，得茶而解之，”從那時起古人就知道飲茶可健身，有治病之療效。到了近代，隨著科技的進步、研究方法的不斷改進，人們發現茶葉中含有很多活性成分，包括茶多酚、咖啡因、黃酮、三萜及其苷類等，這些活性成分具有預防心血管疾病、降血脂、降血壓、抑菌、調節血糖以及防治神經退行性疾病等多種功效[1-3]。endprint

中國出產的名茶眾多，其中綠茶、紅茶和普洱茶是國內市場最受歡迎的茶葉品類[4]。同時中國也是茶葉的產銷大國，很多茶葉品種尤其是發酵茶如普洱茶在生產加工和保存過程中，存在真菌毒素污染的可能。黃曲霉毒素（aflatoxins， AF）是由黃曲霉和寄生曲霉代謝產生的一類結構類似的化合物，是一種天然存在的最強致癌物之一，主要有B1， B2， G1， G2 4種，又以B1的毒性最強[5]。伏馬菌素（fumonisins， FB）是最近發現的、由串珠鐮刀菌等產生的一種新型、強毒性的生物毒素，主要包括FB1，FB2，FB3。伏馬霉素同黃曲霉素一樣，廣泛存在于各種農作物和農作物副產品中，對人體健康有很大的潛在危害并且會導致肝癌，還可能誘發其他臟器癌變[6]。脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol） 同樣也是最常見的一類污染性真菌毒素，食用低劑量的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇會引起食欲下降、嘔吐等癥狀[7] 。因此，嚴格控制茶葉中的真菌毒素含量與百姓的安全健康息息相關。

目前真菌毒素的檢測方法主要有酶聯免疫吸附法[8]、免疫親和凈化-HPLC[9-11]、免疫親和柱色譜-酶聯免疫吸附法（ELISA）[12-13]、液相色譜-串聯質譜法（LC-MS/MS法）[14-19]。酶聯免疫吸附法、免疫親和色譜-HPLC、免疫親和柱色譜-酶聯免疫吸附法（ELISA）等受茶葉中茶多酚和茶色素的干擾，在測定真菌毒素時產生“假陽性“結果。液相色譜-質譜聯用技術，具有靈敏度高、選擇性好、多種組分同時檢測等技術優點， 當前廣泛應用于食品中真菌毒素檢測[20]?；诖?，本研究采用超高效液相色譜串聯質譜法對包括普洱茶、紅茶、綠茶在內的20種國際市售茶葉中黃曲霉毒素B1， B2， G1， G2，伏馬霉素FB1， FB2， FB3和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol）進行檢測。

除了采用常規的有機溶劑萃取的方法對茶葉中的真菌毒素進行提取，本研究還模擬實際的飲茶方法采用80 ℃熱水分不同的時間段進行提取，更能準確地檢測茶葉中進入茶湯的霉菌毒素。從而為明確茶葉中的霉菌毒素含量，加強茶葉衛生管理、制定相關衛生標準提供了更全面的技術基礎和資料。

1 材料

AcquityTM超高效液相色譜儀和XevoTM TQ-MS質譜儀器（美國Waters 公司）；Allegra X-15R 和Microfuge 22R 離心機（美國Beckman Coulter公司）；Multi-THERM型冷卻/加熱振蕩器（美國Benchmark Scientific公司）；I24 振蕩器（英國New Brunswick Scientific公司）；凍干機（美國Labconco公司）， XP105DR 型1/10萬電子分析天平（瑞士Mettler公司）；氮氣發生器（Peak Scientific）；Milli-Q超純水處理系統。

黃曲霉毒素混合對照品（黃曲霉毒素 B1， B2， G1， G2）購于美國 Sigma公司（批號A0263）；對照品伏馬菌素 B1（批號 62580）、伏馬菌素 B2（批號 13227）、伏馬菌素 B3（批號 20434）、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（批號11428）均購于美國Cayman公司；色譜純甲醇、乙腈、甲酸、二甲基亞砜（美國Sigma公司）；水為高純水；氯化鈉（純度>99.9%）、硫酸鎂（美國Fisher 公司）；C18硅膠（60A級）購于美國Sorbtech公司。本研究所檢測茶葉樣本為隨機抽取的國際茶葉市場共20種茶葉樣品，其中有8種茶葉購自日本茶商LUPICIA。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱為UPLC ACQUITY BEH C18柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），流動相為0.1%甲酸水溶液（A）-0.1%甲酸乙腈（B），梯度洗脫（0～3.0 min，10%B；3.0～10 min，10%～70% B；10～10.1 min，70%～10% B；10.1～13 min，10% B），流速0.4 mL·min-1，柱溫40 ℃，進樣量5 μL。

2.2 質譜條件

電噴霧離子源（ESI）正離子模式；多反應檢測模式（MRM）；毛細管電壓1.0 kV；脫溶劑氣溫度400 ℃；錐孔流速150 L·h-1；脫溶劑氣流速600 L·h-1。其他質譜參數見表1?；旌蠈φ掌返牡湫蜕V圖見圖1。

2.3 溶液的制備

2.3.1 對照品溶液

精密稱取上述8種對照品適量，加甲醇定容至刻度，搖勻，制成質量濃度均為1.0 g·L-1的對照品儲備液。精密量取各對照品儲備液適量置于同一量瓶中，定容至刻度，制得質量濃度均為1.0 mg·L-1的混合對照品儲備液。以甲醇稀釋成系列質量濃度的對照品溶液。

2.3.2 樣品處理

2.3.2.1 有機相萃取 稱取粉碎后的樣品0.3 g 于50 mL具塞離心管中，加入10 mL 乙腈-0.2%甲 酸水（1∶1），超聲提取30 min。之后加入2.0 g硫酸鎂和0.5 g氯化鈉，渦旋5 min，4 000 r·min-1離心10 min。吸取2.0 mL上清液至5.0 mL 具塞離心管中，加入0.1 g C18硅膠和0.3 g硫酸鎂，渦旋5 min，4 000 r·min-1離心10 min，吸取1.0 mL上清液至另一試管中，再加入200 μL二甲基亞砜，氮氣吹干，加入800 μL甲醇復溶，渦旋振蕩30 s，經0.22 μm濾膜過濾，供檢測使用。

2.3.2.2 水相萃取 考慮到日常泡茶、飲茶習慣，采用如下2種熱水提取方法進行茶葉中毒素的萃取檢測。①稱取粉碎后的樣品1.0 g于50 mL具塞離心管中，加入20 mL 80 ℃熱水。在0.5，1，3，6，12 h后，分別吸取1.2 mL的樣品溶液到1.5 mL的離心管中，使用4 000 r·min-1離心10 min，再分別吸取1.0 mL上清液至1.5 mL 離心管中，冷凍干燥后加入800 μL甲醇溶解，渦旋振蕩30 s，離心后上清液供檢測使用。②稱取粉碎后的樣品1.0 g于50 mL具塞離心管中，加入20 mL 80 ℃熱水。在0.5，1，3，6，12 h后，分別吸取1.2 mL的樣品溶液到1.5 mL的離心管中。每一時間點均棄去剩余水溶液，并重新加入20 mL 80 ℃熱水。水提液經4 000 r·min-1離心10 min，再分別吸取1.0 mL上清液至1.5 mL 離心管中，冷凍干燥后加入800 μL甲醇溶解，渦旋振蕩30 s，離心后上清液供檢測使用。endprint

2.4 線性關系檢測限和定量限考察

分別精密吸取混合對照品溶液適量，加甲醇溶液稀釋至不同質量濃度，渦旋，制得系列混合對照品溶液，分別取以上混合對照品溶液按2.1和2.2項下色譜與質譜條件進行測定。以對照品質量濃度為橫坐標（X）峰面積為縱坐標（Y），繪制標準曲線。用加權最小二乘法（W=1/x2）計算回歸方程。以0.3 g茶葉樣本計算得到有機相萃取和1.0 g茶葉樣本計算得到的水相萃取的定量下限見表2。

2.5 加樣回收率考察

取上述8種真菌毒素未檢出的空白茶葉樣品，平行取6份，加入混合標準溶液，按2.3.2項樣品處理方法制備樣品并進行回收測定，得到本實驗的平均回收率和精密度，見表3。

2.6 樣品測定

采用2.3.2項方法處理茶葉樣本，在上述儀器測定條件下對20種茶葉進行測定。將樣本中檢測到的真菌毒素的峰面積代入表2 方程，計算得到樣本中真菌毒素的實際濃度。有機相萃取結果見表4， 在6種茶葉中檢測到黃曲霉毒素B2，在3種茶葉中檢測到黃曲霉毒素G1，在2種茶葉中檢測到伏馬霉素B1和在1種茶葉中檢測到伏馬霉素B2。水提取樣本中，僅一種茶葉（糯香普洱）檢出伏馬霉素B1以及伏馬霉素 B2，結果見表5，其余樣本均未檢出。

3 討論

本實驗建立的定量分析茶葉中8種真菌毒素UPLC-MS/MS方法，在其各自的質量濃度范圍內，線性良好，所有測定樣品的準確度，回收率等均滿足定量分析要求。

對市售的20種茶葉樣本進行測定，采用有機溶劑提取，在2種普洱茶，3種綠茶和1種紅茶中檢出 了黃曲霉毒素B2；2種普洱茶和1種紅茶中檢出了黃曲霉毒素G1；2種普洱茶中檢出了伏馬霉素B1以及1種普洱茶中檢出了伏馬霉素B2。其中毒性最強的黃曲霉毒素B1并未檢測到，普洱茶產品并不比 其他的茶葉（紅茶、綠茶等）產品含有更多的霉菌毒素。而水相提取樣本除在1種糯香普洱產品中檢出微量的（0.15～3.33 μg·kg-1）伏馬霉素B1和B2以外，其余所測樣本中8種真菌毒素均未檢出。采用80 ℃熱水提取模擬實際的飲茶方法（單次沖泡和多次沖泡茶葉取樣），能更準確地檢測茶葉中進入茶湯的霉菌毒素，而有機溶劑萃取法更適合檢測食品中的霉菌毒素的含量。

美國食品藥品監督管理局以及中國國家標準GB2761《食品中真菌毒素限量》中規定食品、玉米、玉米制品、花生、花生制品中的黃曲霉素限量標準為20 μg·kg-1[21-22]；脫氧雪腐鐮刀菌烯醇在玉米、玉米面、大麥、小麥中的限量為1 000 μg·kg-1[9]；伏馬菌素歐盟限定標準為玉米和玉米制品中不得超過1 000 μg·kg-1[23]。從上述限量標準來看，黃曲霉毒素毒性最強，控制得最嚴。本研究所采用的2種方法對20種市售茶葉產品所檢出的幾種霉菌毒素含量在0.15～7.31 μg·kg-1，均未超過相關食品安全規定的真菌毒素限量。

黃曲霉毒素具有很高的脂溶性，難溶于水，茶葉受到黃曲霉菌污染，所含有的毒素只有少量會在沖泡過程中進入茶湯。飲茶是用開水泡茶，飲用的是茶湯，與玉米、花生等糧食在食用方法（后者全部入口）和用量上（前者幾克，后者往往數百克）相比有著根本的差異，所以評價飲茶中攝入的霉菌毒素不應該采用糧食中檢測毒素的有機溶劑提取方法。事實上有人用有機溶劑提取法對西班牙超市中售賣的多種咖啡樣本進行分析，檢測出多種霉菌毒素，其中有的超標很高[14]。所以食品安全評價中的分析方法不當，會夸大問題，引起大眾不必要的恐慌。

另外，包括黃曲霉菌在內的常見寄生霉菌，廣泛存在于生長溫度為25～40 ℃的溫暖地區，因此位于熱帶地區或者常溫條件下的實驗室也容易受到污染，在食品分析過程中對于實驗設備、材料、試劑等排除微量霉菌的污染，從而保證高靈敏的分析儀器不受干擾，也是一個容易忽視卻又非常重要的質量控制環節。

[參考文獻]

[1] 趙龍飛， 周紅杰， 安文杰. 云南普洱茶保健功效的研究[J]. 食品研究與開發， 2005， 26（2）：114.

[2] 余鵬輝， 袁沛， 童杰文. 紅茶對人類疾病防治功效研究進展[J]. 茶葉通訊， 2014， 41（3）：8.

[3] 李麗， 許利嘉， 彭勇，等. 綠茶與其他4種別樣茶的比較[J]. 中國中藥雜志， 2011， 36（1）：5.

[4] 陳小強， 葉陽， 成浩，等. 三類茶中茶氨酸、咖啡堿及多酚類的比較分析[J]. 食品研究與開發， 2007， 28（12）：141.

[5] Carnaghan R B， Hartley R D， O′Kelly J. Toxicity and fluorescence properties of the aflatoxins [J]. Nature， 1963， 200（4911）：1101.

[6] 金海濤， 陳道付， 李紹鈺. 伏馬菌素的毒性作用研究[J]. 飼料工業， 2007， 28（20）：55.

[7] 霍星華， 趙寶玉， 萬學攀，等. 脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的毒性研究進展[J]. 毒理學雜志， 2008， 22（2）：151.

[8] 馮翀. 食品中真菌毒素檢測分析——以酶聯免疫吸附法（ELISA）為例 [J]. 中國科技博覽， 2011（36）：264.

[9] 劉麗娜，李耀磊，金紅宇，等. 免疫親和凈化HPLC柱后光化學衍生熒光法測定動物藥中黃曲霉毒素 [J].中草藥， 2017，48（6）：1220.

[10] 李佐卿，謝東華，孫大為，等.免疫親和柱HPLC熒光檢測酒中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2[J].光譜實驗室，2001，18（1）：28.

[11] 黎睿， 謝剛， 王松雪. 高效液相色譜法同時檢測糧食中常見8種真菌毒素的含量[J]. 食品科學， 2015， 36（6）：206.endprint

[12] 陳旭明， 李婷. 酶聯免疫吸附結合免疫親和柱-高效液相色譜法檢測大米中黃曲霉毒素B1的研究[J]. 包裝與食品機械， 2016（6）：68.

[13] 張羽， 唐亞芳， 王燁旻. 免疫親和柱凈化高效液相色譜法與酶聯免疫吸附法測定小麥中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇[J]. 糧食與油脂， 2016， 29（6）：78.

[14] García-Moraleja A， Font G， Maes J， et al. Simultaneous determination of mycotoxin in commercial coffee[J]. Food Control， 2015， 57：282.

[15] Campbell K， Cavalcante A L F， Galvin-King P， et al. Evaluation of an alternative spectroscopic approach for aflatoxin analysis： comparative analysis of food and feed samples with UPLC–MS/MS [J]. Sensor Actuat B-Chem， 2017， 239：1087.

[16] Ediage E N， Poucke C V， Saeger S D. A multi-analyte LC-MS/MS method for the analysis of 23 mycotoxins in different sorghum varieties： the forgotten sample matrix [J]. Food Chem， 2015， 177：397.

[17] Flores-Flores M E， González-Peas E. An LC-MS/MS method for multi-mycotoxin quantification in cow milk [J]. Food Chem， 2017， 218：378.

[18] Andrade P D， Dantas R R， Caldas E D. Determination of multi-mycotoxins in cereals and of total fumonisins in maize products using isotope labeled internal standard and liquid chromatography/tandem mass spectrometry with positive ionization [J]. J Chromatogr A， 2017：138.

[19] Al-Taher F， Cappozzo J， Zweigenbaum J， et al. Detection and quantitation of mycotoxins in infant cereals in the U.S. market by LC-MS/MS using a stable isotope dilution assay [J]. Food Control， 2017， 72：27.

[20] 宋衛得， 蘇征， 惠希東，等. 液質聯用技術在食品真菌毒素檢測中的研究進展[J]. 食品工業科技， 2016， doi：10.13386/j.issn1002-0306.2016.17.070.

[21] 食品安全國家標準食品中真菌毒素限量. GB2761[S]. 2011.

[22] FDA. FDA Mycotoxin Regulatory Guidance： a guide for grain elevators， feed manufacturers，grain processors and exporters[S]. 2011.

[23] Commission Regulation （EC）. Laying down the methods of sapling and analysis for the official control of the levels of mycotoxins in food stuffs [S].2006.

[責任編輯 丁廣治]endprint