川芎提取物通過激活Nrf2通路對抗心肌缺血大鼠氧化應激損傷

汪剛+劉瑩+侯雪峰+柯仲成+封亮+賈曉斌

[摘要] 川芎是臨床常用于心腦血管疾病的一味中藥，現代醫學證實川芎提取物具有良好的抗氧化活性。該文主要探討川芎提取物對大鼠心肌缺血損傷氧化應激干預作用及可能的機制。采用皮下注射鹽酸異丙腎上腺素誘導大鼠心肌缺血損傷模型，記錄各組大鼠心臟指數，比色法檢測血清肌酸激酶（CK）、乳酸脫氫酶（LDH）、谷草轉氨酶（AST）、超氧化物歧化酶（SOD）、總抗氧化能力（T-AOC）的活性及血清中丙二醛（MDA）含量，同時光鏡下觀察心肌組織形態學變化，Western blot法檢測心肌組織中核因子E2相關因子2（Nrf2）、醌氧化還原酶（NQO1）和血紅素氧合酶-1（HO-1）蛋白表達的變化。結果顯示，川芎提取物能顯著降低心臟指數和血清心肌酶CK，LDH，AST水平，提高血清SOD和T-AOC活性并降低MDA含量，改善缺血損傷后心肌組織形態結構，增加心肌組織中Nrf2，NQO1，HO-1 蛋白的相對表達。該研究表明川芎提取物對大鼠心肌缺血損傷具有保護作用，其機制可能與激活Nrf2信號通路，增加心肌組織抗氧化能力，抑制氧化應激反應有關。

[關鍵詞] 川芎； 氧化應激； 心肌缺血損傷； Nrf2信號通路

[Abstract] Ligusticum chuanxiong is one of the common traditional Chinese medicinal herbs for treating various cardiovascular and cerebrovascular diseases， and a number of previous studies have demonstrated that the extract of L. chuanxiong has strong antioxidative activity. This paper was mainly aimed to investigate the effects and possible mechanisms of L. chuanxiong extraction on oxidative stress induced by myocardial ischemia injury in rats. The rats were subcutaneously injected with isoprenaline hydrochloride to induce myocardial ischemia injury and treated for 2 weeks. Then the cardiac indexes of the rats were recorded. The concentration of malondialdehyde （MDA） and activities of serum creatine kinase （CK）， lactate dehydrogenase （LDH）， aspartate transaminase （AST）， superoxide dismutase （SOD） and total antioxidant capacity （T-AOC） were measured by colorimetry. Light microscope was used to observe the morphological changes of myocardium， and the protein expressions of nuclear factor E2 related factor 2 （Nrf2）， quinone oxidoreductase （NQO1） and hemeoxygenase-1 （HO-1） in cardiac tissue were evaluated by Western blot. The results showed that L. chuanxiong extraction could decrease cardiac indexes and the values of CK， LDH and AST in blood serum， increase activities of serum SOD and T-AOC， reduce serum MDA concentration， improve myocardium structure after ischemia injury， and up-regulate the protein expressions of Nrf2， NQO1 and HO-1 in cardiac tissue. These findings revealed that the cardioprotective effects of L. chuanxiong extraction may be related to inhibiting oxidative stress through the activation of Nrf2 signaling pathway.

[Key words] Ligusticum chuanxiong； oxidative stress； myocardial ischemia injury； Nrf2 signaling pathway

心肌缺血損傷是指由于心臟供血量減少和供養不足，從而導致心肌能量代謝異常，心肌結構和功能發生改變[1]。其發生機制可能與多種因素有關，具有多層次、多靶點的特點。大量臨床和實驗研究表明氧化應激在心肌缺血性損傷性疾病的發生發展過程中扮演著重要的作用[2-3]，心肌缺血時伴隨有大量活性氧簇（ROS）產生和堆積，引發機體內源性氧化應激，心肌細胞膜上不飽和脂肪酸發生脂質過氧化反應。一方面促進心肌細胞凋亡和心肌組織壞死；另一方面造成細胞膜通透性和流動性發生改變，導致胞內大量心肌酶外漏，加重心肌缺血損傷[4-5]。因此，有效地干預內源性氧化應激是改善心肌缺血損傷和保護心肌組織的重要途徑。endprint

川芎為傘形科藁本屬植物川芎Ligusticum chuanxiong Hort.的根莖，素有“行氣活血，祛風止痛”之功效?，F代研究表明川芎具有較好的抗心肌缺血藥效，廣泛應用于冠心病、心絞痛、動脈粥樣硬化等心血管疾病的治療與預防[6-7]。近年來研究證實川芎及其有效成分具有顯著的抗氧化活性，對機體產生的羥基自由基、過氧化氫超氧自由基、氫自由基、過氧化亞硝基等活性氧簇都有一定的清除作用[8-10]，但其抗心肌缺血氧化應激損傷的作用機制目前尚不明確。故本研究建立大鼠心肌缺血模型，觀察不同川芎提取物預處理對心肌缺血損傷的影響，旨在探討川芎提取物通過其抗氧化應激作用發揮心肌缺血損傷保護作用機制。

1 材料

1.1 動物 健康雄性SD大鼠，SPF級，體質量（200±20） g，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，合格證號SCXK（滬）2016-0125。所有大鼠均分籠，并飼養于江蘇省中醫藥研究院實驗動物中心，適應性喂養1周后開始實驗。飼養條件：溫度（25±1） ℃，相對濕度（45±5）%，光暗各12 h，自由進食飲水。

1.2 藥物與試劑 川芎（亳州市萬珍中藥飲片廠，批號1604109）；鹽酸地爾硫卓片（天津田邊制藥有限公司，批號1603019）；鹽酸異丙腎上腺素（Sigma，批號WXBC2200V）；水合氯醛（中國醫藥集團上?；瘜W試劑公司，批號F20160116）；肌酸激酶（CK）試劑盒（批號20161012），乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒（批號20161012），天冬氨酸轉氨酶（AST）試劑盒（批號20161012），丙二醛（MDA）試劑盒（批號20161023），超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒（批號20161023），總抗氧化能力（T-AOC）試劑盒（批號20161023）均購自南京建成生物工程研究所；兔抗大鼠Nrf2單克隆抗體，兔抗大鼠NQO1單克隆抗體，兔抗大鼠HO-1單克隆抗體購自英國Abcam公司；BCA蛋白含量檢測試劑盒，ECL化學發光試劑盒購自江蘇凱基生物技術股份有限公司。

1.3 儀器 ECGV-6012心電圖機（深圳衛康明科技有限公司）；MS105DU型分析天平（美國Mettler Toledo公司）；全自動酶標儀（ThermoElectrom公司）；高速冷凍離心機（美國Beckman公司）；CHA-S型數顯氣浴恒溫振蕩器（金壇市雙捷實驗儀器廠）；TL-820A型全自動切片機（湖北泰維科技實業有限公司）；Milli-Q超純水機（美國Millipore公司）；PNHW型電熱套（鞏義市予華儀器有限責任公司）；Hei-VAP Value Digital型旋轉蒸發儀（德國Heidolph儀器有限公司）；Western電泳儀（美國 Bio-Rad公司）；JS-1070化學發光凝膠成像分析系統（上海培清科技有限公司）。

2 方法

2.1 提取物制備 川芎醇提物制備：稱取500 g川芎，加入10倍體積的80%乙醇加熱回流提取2次，每次1.5 h，合并2次提取液，減壓濃縮至干浸膏，加蒸餾水溶解至所需溶液濃度。

川芎水提物制備：稱取500 g川芎，加入10倍體積水煎煮2次，每次1.5 h，合并2次提取液，減壓濃縮至干浸膏，加蒸餾水溶解至所需溶液濃度。

2.2 分組與給藥 取健康SD大鼠56只，隨機分成7組，分別為空白組（給予等量蒸餾水）、模型組（給予等量蒸餾水）、陽性對照藥鹽酸地爾硫卓組（20 mg·kg-1）、川芎醇提物高劑量組（1 200 mg·kg-1）、川芎醇提物低劑量組（600 mg·kg-1）、川芎水提物高劑量組（1 200 mg·kg-1）、川芎水提物低劑量組（600 mg·kg-1）。連續灌胃給藥14 d。

2.3 ISO誘導的大鼠心肌缺血模型建立 參照Karthick等[11]的方法，通過前期對ISO給藥劑量的考察，稍作改動建立心肌缺血模型。除空白組外其余各組于第13天、第14天，皮下注射ISO 40 mg·kg-1，每天1次，連續注射2 d進行模型制備?？瞻捉M注射等體積的生理鹽水，實驗期間大鼠自由飲水和進食。在第14天給藥1 h后，隨即用水合氯醛腹腔注射麻醉，將電極分別插入大鼠四肢皮下，監測注射ISO后20 min內Ⅱ導聯心電圖變化。判定大鼠陽性心肌缺血標準為（出現以下指征之一者）：①J點偏移大于0.1 mV；②T波高聳，超過同導聯R波的1/2；③T波高聳伴J點移位[12]。

2.4 心臟指數測定 實驗結束后處死大鼠，快速摘取心臟，用生理鹽水洗凈，再用濾紙吸干多余水分，稱取心臟質量，心臟質量除以大鼠體質量，計算各組大鼠心臟指數。

2.5 生化指標檢測 測完心電圖后，經腹主動脈取血5 mL，3 000 r·min-1離心15 min，分離血清冷凍保存。嚴格按照試劑盒說明書操作步驟，分別測定各組大鼠血清中CK，LDH，AST，SOD，MDA和T-AOC等生化指標。

2.6 心肌組織病理學觀察 取心肌組織，10%甲醛溶液固定，常規石蠟包埋，切片，蘇木素-伊紅（HE） 染色，光學顯微鏡下觀察各組大鼠心肌組織病理學變化。

2.7 Western blot 法測定心肌Nrf2，NQO1和HO-1蛋白表達 取心臟組織，加入含1 mmol·L-1 PMSF的RIPA細胞裂解液低溫研磨，充分裂解，于4 ℃ 12 000 r·min-1離心15 min，收集上清液，采用BCA蛋白含量檢測試劑盒測定蛋白濃度。將蛋白變性處理后，取等量總蛋白進行SDS-PAGE電泳分離，然后轉至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉液封閉。再加入稀釋后的Nrf2，NQO1和HO-1抗體，4 ℃孵育過夜，TBST液洗滌3次，每次10 min。加入相應稀釋后的二抗，室溫孵育4 h，TBST液洗膜3次，每次10 min。用ECL化學發光法檢測各組大鼠蛋白表達情況。endprint

2.8 統計學分析 實驗數據采用SPSS 16.0統計學軟件分析，計量資料用±s表示。首先進行數據正態性檢驗；然后多組間計量資料比較采用單因素方差分析，方差齊時采用LSD檢驗，方差不齊時采用Tamhane′s T2檢驗；P<0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 川芎提取物對心肌缺血大鼠心臟指數的影響 與空白組相比，模型組大鼠心臟明顯水腫，心外膜可見部分灰白色區域，大鼠心臟質量與體質量比值即心臟指數明顯升高（P<0.01）。與模型組相比，鹽酸地爾硫卓組顯著降低心肌缺血大鼠心臟指數（P<0.01）；川芎醇提物與水提物高、低劑量組均能降低心臟指數，改善心肌缺血大鼠心肌水腫程度（P<0.05或P<0.01）。與川芎水提物同劑量組相比，川芎醇提物組減輕心肌水腫效果更為顯著（P<0.01），見圖1。

3.2 川芎提取物對心肌缺血大鼠血清心肌酶的影響 與空白組相比，模型組大鼠血清中CK，LDH和AST含量顯著增加（P<0.01）。與模型組比較，鹽酸地爾硫卓組大鼠血清中CK，LDH和AST含量顯著下降（P<0.01）；川芎醇提物與水提物各劑量組均能減少心肌缺血大鼠血清中CK，LDH和AST的含量（P<0.05或P<0.01），且川芎醇提物組比相同劑量的川芎水提物組效果更為明顯（P<0.05或P<0.01），見表1。

3.3 川芎提取物對心肌缺血大鼠氧化應激的影響 與空白組相比，心肌缺血模型組大鼠血清中MDA含量明顯升高，SOD與T-AOC活力顯著下降（P<0.01）；與模型組比較，鹽酸地爾硫卓組大鼠血清中MDA含量明顯下降，同時SOD與T-AOC活力明顯提高（P<0.01）；川芎各給藥組大鼠血清中MDA含量降低，SOD與T-AOC活力也有一定程度的升高（P<0.05或P<0.01），且川芎醇提物組比同劑量的川芎水提物組效果顯著（P<0.05或P<0.01），見表2。

3.4 川芎提取物對心肌缺血大鼠心肌組織病理形態的影響 取染色后的心肌組織切片在光鏡下觀察，見圖2?？瞻捉M大鼠心肌纖維排列整齊，組織結構完整，細胞核形態正常，間質無水腫和炎性細胞浸潤；模型組大鼠心肌損傷明顯，心肌纖維排列紊亂，肌束間隔增寬，并出現廣泛性心肌纖維斷裂，空泡樣變性明顯，間質水腫，大量炎性細胞浸潤；鹽酸地爾硫卓組大鼠大部分心肌纖維排列整齊，局灶性斷裂，細胞間隙水腫減輕，間質內偶見部分炎性細胞浸潤。川芎醇提物高劑量組大鼠心肌纖維輕度排列紊亂，肌束間隔略增寬，局部少量炎性細胞浸潤。川芎醇提物低劑量組與川芎水提物高劑量組大鼠心肌纖維中度紊亂，輕中度空泡樣變性，肌束間隔中度增寬，輕度水腫，間質少量炎性細胞浸潤。川芎水提物低劑量組大鼠心肌纖維局灶性斷裂，空泡樣變性明顯，間質有明顯炎性細胞浸潤。

3.5 川芎提取物對心肌缺血大鼠Nrf2，NQO1和HO-1蛋白表達的影響 與空白組比較，模型組Nrf2，NQO1和HO-1蛋白表達明顯降低（P<0.01）；與模型組相比，各給藥組Nrf2，NQO1和HO-1蛋白表達均增加（P<0.05或P<0.01），其中川芎醇提物組比相同劑量的川芎水提物組增加明顯（P<0.05或P<0.01），見圖3。

4 討論

心肌缺血損傷是多種心血管疾病的始動因素和主要病理特征，與臨床上心絞痛、心肌梗死、冠狀動脈粥樣硬化、血管痙攣等病癥的發生發展密切相關。心肌缺血損傷發生機制較為復雜，現代研究表明氧化應激反應是其發生的關鍵環節之一。正常生理條件下，心肌組織的氧化與抗氧化系統處于動態平衡 狀態，ROS生成較少，維持基礎水平；病理狀態下，心肌缺血的過程中，平衡被打破，ROS大量產生，組織抗氧化能力下降，引起脂質、蛋白質和核酸的過氧化，使細胞膜結構遭到破壞、蛋白變性、DNA鏈斷裂，最終導致心肌細胞損傷、凋亡或壞死[2]。因此，靶向減少ROS水平的抗氧化干預措施將有效延緩和預防心肌缺血損傷。

在本研究中采用皮下注射異丙腎上腺素誘導心肌缺血的病理過程。異丙腎上腺素作為β-受體激動劑，能夠通過收縮冠狀動脈、增加心肌收縮力、加快心率等環節，造成心肌耗氧量增加，心臟負荷過重，心肌微循環障礙，冠狀動脈痙攣，心肌梗死樣變化等，進而誘發心肌缺血。SOD是機體清除ROS抗氧化防御系統中重要酶，它可清除超氧陰離子，保護心肌組織免受自由基損傷，其活性能夠反映機體的抗氧化儲備功能狀態[13]。MDA為ROS與細胞膜上不飽和脂肪酸發生脂質過氧化反映的終產物，其含量可以間接反映脂質過氧化程度[14]。T-AOC代表機體抗氧化物的總體水平，可以綜合反映心肌組織的清除ROS的能力。本研究發現心肌缺血模型組血清SOD與T-AOC活力顯著下降，MDA含量明顯增加，說明氧化應激參與了心肌缺血的病理過程，與文獻報道結果相一致[15]。川芎各提取物組均可顯著抑制大鼠血清SOD，T-AOC活性的下降和MDA含量的升高，且川芎醇提物組比水提物組效果顯著，提示川芎各提取物能有效減輕異丙腎上腺素所致心肌缺血大鼠氧化應激損傷，川芎醇提物抗氧化作用強于水提物。

Nrf2通路是近年來發現的最為重要的內源性抗氧化應激通路，在氧化應激反應應答中起到樞紐的作用，且在心血管系統中分布廣泛，與改善心肌缺血損傷密切相關[16]。通常其發揮抗氧化作用方式有：一方面，氧化應激可促進Nrf2 mRNA轉錄，使得Nrf2蛋白合成增加；另一方面，當機體受到親電子物質，ROS或者上游信號通路刺激時，Nrf2與其伴侶蛋白Keap1 解離，Nrf2被激活，使得由細胞質轉移至細胞核中的Nrf2增加，繼而與肌腱纖維瘤蛋白以異二聚體形式與抗氧化反應元件（antioxidant response elements，ARE） 結合，然后通過上調下游Ⅱ相解毒酶及抗氧化酶基因NQO1和HO-1等的表達減輕氧化應激損傷[17-18]。本研究顯示異丙腎上腺素誘導的心肌缺血氧化損傷過程中，Nrf2，NQO1，HO-1蛋白水平顯著下調。提示心肌細胞的抗氧化能力下降，導致自由基代謝失衡，引起心肌損傷。但與模型組相比，川芎各提取物組Nrf2，NQO1，HO-1蛋白水平均有不同程度升高，川芎醇提物比水提物更為明顯，考慮川芎提取物能夠激活Nrf2，促進 Nrf2 蛋白的合成和核轉位，上調下游NQO1，HO-1 基因表達及蛋白合成，發揮抗心肌缺血損傷的作用。endprint

川芎作為臨床常用的活血化瘀藥，現代科學研究已經證實川芎及其活性成分可以有效預防和治療心肌缺血損傷[19-21]。本研究同樣表明，川芎提取物對大鼠心肌缺血損傷具有一定程度的保護作用，且川芎醇提物比水提物藥效更為顯著，可以明顯降低心肌指數，減少心肌酶CK，LDH及AST的泄漏，減輕心肌組織形態結構的損傷，同時提高血清中SOD與T-AOC活力，減少MDA含量。進一步研究發現川芎提取物預處理后，可增加Nrf2表達，激活下游抗氧化基因NQO1，HO-1的表達從而減輕心肌缺血氧化應激損傷，提示Nrf2信號通路在川芎提取物對心肌缺血損傷的保護中發揮著重要作用，這為川芎在臨床上的合理應用提供了寶貴的科學實驗依據。

[參考文獻]

[1] 許波華，許立.中藥抗心肌缺血作用機制的研究進展[J].中國實驗方劑學雜志，2011，17（15）：265.

[2] He H， Xu J， Xu Y， et al. Cardioprotective effects of saponins from Panax japonicus on acute myocardial ischemia against oxidative stress-triggered damage and cardiac cell death in rats[J]. J Ethnopharmacol， 2012， 140（1）：73.

[3] Yan Y， O W， Zhao X， et al. Effect of essential oil of Syringa pinnatifolia Hemsl. var. alashanensis on ischemia of myocardium， hypoxia and platelet aggregation[J].J Ethnopharmacol， 2010， 131（2）：248.

[4] Murphy E， Steenbergen C. Mechanisms underlying acute protection from cardiac ischemia-reperfusion injury[J]. Physiol Rev， 2008， 88（2）：581.

[5] 張衛萍，鄧楊陽，任建勛，等.淫羊藿總黃酮對大鼠心肌急性缺血再灌注損傷氧化應激干預機制的研究[J].中國中藥雜志， 2016，41（18）：3400.

[6] 趙自冰，牛燕運.加用復方川芎膠囊治療冠心病伴頸動脈粥樣硬化斑塊50例[J].廣西中醫藥， 2015，38（2）：15.

[7] 姜溪，邵鳳，鄭歆，等.川芎救心滴丸對動物實驗性心肌缺血的保護作用研究[J].現代藥物與臨床，2014，29（5）：476.

[8] Hou Y Z， Zhao G R， Yang J， et al. Protective effect of Ligusticum chuanxiong and Angelica sinensis on endothelial cell damage induced by hydrogen peroxide[J]. Life Sci， 2004， 75（14）：1775.

[9] 李瑞芳，王紅偉，朱世超，等.川芎嗪對異丙腎上腺素誘導的小鼠急性心肌缺血的保護作用[J].中國臨床藥理學雜志， 2016，32（4）：340.

[10] 范智超.川芎多糖的研究[D].西安：陜西師范大學， 2004.

[11] Karthick M， Stanely M P P. Preventive effect of rutin， a bioflavonoid， on lipid peroxides and antioxidants in isoproterenol-induced myocardial infarction in rats[J].J Pharm Pharmacol， 2006， 58（5）：701.

[12] 梁曉萍，陳曦，王義明，等.雙龍方配伍配比對大鼠急性心肌缺血模型的影響[J].中國中藥雜志， 2011， 36（22）：3176.

[13] Valko M， Leibfritz D， Moncol J， et al. Free radicals and antioxidants in normal physiological functions and human disease[J]. Int J Biochem Cell Biol， 2007， 39（1）：44.

[14] Malinska D， Kulawiak B， Kudin A P， et al. Complex Ⅲ-dependent superoxide production of brain mitochondria contributes to seizure-related ROS formation[J]. Biochim Biophys Acta，2010， 1797（6/7）：1163.

[15] Tang Y N， He X C， Huang H， et al. Cardioprotective effect of total saponins from three medicinal species of Dioscorea against isoprenaline-induced myocardial ischemia[J]. J Ethnopharmacol， 2015， 175：451.

[16] Zhu Y， Di S， Hu W， et al. A new flavonoid glycoside （APG） isolated from Clematis tangutica attenuates myocardial ischemia/reperfusion injury via activating PKCε signaling[J]. Biochim Biophys Acta， 2017， 1863（3）：701.

[17] Hu T X， Wei G， Xi M M， et al. Synergistic cardioprotective effects of Danshensu and hydroxysafflor yellow A against myocardial ischemia-reperfusion injury are mediated through the Akt/Nrf2/HO-1 pathway[J]. Int J Mol Med， 2016， 38（1）：83.

[18] Li J， Ichikawa T， Janicki J S， et al. Targeting the Nrf2 pathway against cardiovascular disease[J]. Expert Opin Ther Targets， 2009， 13（7）： 785.

[19] Yuan Z， Zhang J， Yang C. Ligusticum wallichii extract inhibited the expression of IL-1β after AMI in rats[J]. Evid Based Complent Alternat Med， 2014， 2014：620359.

[20] 陳德森，郭俐宏.川芎提取物對大鼠心肌缺血再灌注損傷的影響[J].現代中西醫結合雜志， 2010， 19（27）：3427.

[21] Liu X， Li X， Ji S， et al. Screening of bioactive ingredients in Ligusticum chuanxiong Hort for protection against myocardial ischemia[J]. Cell Physiol Biochem， 2016， 40（3/4）：770.

[責任編輯 張寧寧]endprint