β—細辛醚對Aβ1—42聯合2—VO致AD大鼠的保護作用及機制初探

王博林+宣玲+戴世杰+姬麗婷+李昌煜+楊元宵

[摘要] 該文通過側腦室注射Aβ1-42聯合2-VO建立AD大鼠模型，探究β-細辛醚對該模型學習記憶障礙的保護作用，并初步探討其作用機制。將105只大鼠隨機分為7組，分別為假手術組、AD模型組、β-細辛醚低、中、高劑量組（10，20，30 mg·kg-1）、多奈哌齊組（0.75 mg·kg-1）和銀杏葉提取物組（24 mg·kg-1），不同藥物給藥4周后檢測大鼠學習記憶能力、局部腦血流量變化、海馬CA1區病理改變、皮質HIF-1α水平及血清CAT，SOD和MDA水平。結果顯示，側腦室注射Aβ1-42聯合2-VO導致大鼠學習記憶障礙，局部腦血流量降低，CA1區神經元排列紊亂、出現大量空泡、淀粉樣沉淀增多，皮質HIF-1α陽性細胞數顯著增加，血清CAT和SOD顯著下降，MDA顯著上升。給予20，30 mg·kg-1β-細辛醚后，上述癥狀均得到顯著改善。結果表明，β-細辛醚能夠緩解Aβ1-42聯合2-VO建立AD大鼠模型的癥狀，其作用機制可能是β-細辛醚通過提高機體抗氧化能力，降低體內的活性氧類物質，從而降低HIF-1α水平，減輕了過氧化物及HIF-1α對神經細胞的損傷，最終達到緩解AD的目的。

[關鍵詞] β-細辛醚； 阿爾茨海默； Aβ1-42； 雙側頸總動脈結扎術； 抗氧化酶； HIF-1α

[Abstract] This study was aimed to investigate the protective effect and mechanism of β-asarone on the animal model of Alzheimer′s disease（AD） which was induced by intracerebroventricular injection of Aβ1-42 combined cerebral ischemia. One hundred and five rats were randomly divided into seven groups including sham-operated group， AD model group， β-asarone 10 mg·kg-1 group， β-asarone 20 mg·kg-1group， β-asarone 30 mg·kg-1group， donepezil group（0.75 mg·kg-1） and Ginkgo biloba extract group（24 mg·kg-1）. Rats′ learning and memory abilities， cerebric regional blood flow， pathological changes in hippocampal CA1 region， the expression level of HIF-1α and serum CAT， SOD and MDA level were detected 4 weeks later. The results showed that the application of intracerebroventricular injection of Aβ1-42 joint 2-VO could lead to rats′ dysfunction of learning and memory， decrease in regional cerebral blood flow. Neurons in CA1 region were arranged in disorder， and amyloid deposition was increased. The number of cerebral cortical cells expressing HIF-1α was increased as well. The level of serum CAT and SOD decreased， while level of serum MDA increased. However these symptoms were improved by 20 mg·kg-1 and 30 mg·kg-1β-asarone. The results indicated that β-asarone could effectively relieve the symptoms of the AD model induced by intracerebroventricular injection of Aβ1-42 combined cerebral ischemia， and the potential mechanism might be that it could attenuate damage of MDA to the body by improving the level of CAT and SOD， meanwhile the level of HIF-1α decreased as the decline of hyperoxide which might attenuate its damage to neuron， so it finally achieved alleviating Alzheimer′s disease.

[Key words] β-asarone； Alzheimer′s disease； Aβ1-42； 2-VO； antioxidant enzymes； HIF-1α

阿爾茨海默?。ˋlzheimer′s disease， AD）為一種神經退行性疾病，臨床表現為記憶力減退、認知障礙等，嚴重影響患者的生活。目前其發病機制仍未明確，存在多種假說：氧化應激假說、β淀粉樣蛋白級聯假說、Tau蛋白異常磷酸化假說和膽堿能系統損傷假說等[1]，其中以β淀粉樣蛋白級聯假說占主導地位[2]?；谠摷僬f的腦內注射Aβ1-42模型也已作為較常用的AD模型制備方法。同時，越來越多的研究表明腦缺血與AD密切相關[3]，能導致AD的發生發展[4-7]。因此本研究采用側腦室注射Aβ1-42聯合雙側頸總動脈結扎（2-VO）建立AD大鼠模型，較目前常用的模型能更全面地模擬AD特征。endprint

目前被FDA認可用于改善AD癥狀的藥物僅有5種，包括多奈哌齊、加蘭他敏等，然而這些藥物對胃腸道刺激大，易導致心動過緩和心肌梗死[8]。中藥由于其具有多靶點整體調節、毒副作用小等特點受到研究者的重視，其中石菖蒲具有醒神益智、開竅豁痰等功效[9]，在防治AD方面一直備受關注，其主要有效成分為β-細辛醚。β-細辛醚在中樞神經系統方面表現出良好的抗老年癡呆作用[10]，本實驗室在前期發現β-細辛醚能有效緩解大鼠大腦中動脈閉塞引起的局部腦缺血[11]，對Aβ1-42誘導星形膠質細胞活化所致的PC12 細胞損傷也具有保護作用[12]，但它對側腦室注射Aβ1-42聯合2-VO致AD大鼠這一模型的作用未見報道，因此本研究主要探討β-細辛醚對Aβ1-42聯合2-VO建立AD模型的作用，并從抗氧化的角度初步探討其作用機制。

1 材料

1.1 動物

SPF級健康成年雄性SD大鼠，體質量（280±20） g，購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司，許可證號SCXK（滬）2013-0016，浙江中醫藥大學動物實驗中心，許可證號SYXK（浙） 2013-0184。溫度（22±2） ℃，濕度50%～60%，12 h光照，自由飲水，標準普通飼料喂食。

1.2 儀器

Morris水迷宮（西班牙Panlab公司，型號Smsrt-Mass 0800916s）；腦立體定位儀（上海奧爾科特生物技術有限公司，型號Alc-H）；激光多普勒腦血流儀[埃德儀器國際貿易（上海）有限公司，型號ML191Laser Doppler Blood Flowmeter]；微量注射器（上海高鴿工貿有限公司，規格10 μL）；牙科鉆（深圳瑞沃德生命科技有限公司，型號strong 90）；酶標儀（美國BIO-TEK儀器有限公司，型號Power Wave X340 BIO-TEK）；顯微鏡（Nikon公司，型號Nikon eclipse 80i）；封閉式組織自動脫水機（德國Leica公司，型號ASP200S）；包埋機（德國Leica公司，型號AP280-2）；切片機（德國Leica公司，型號leica RM2245）；臺式高速冷凍離心機（Thermo公司，型號FRESC017）。

1.3 試劑

Aβ1-42（寡聚體）（吉爾生化有限公司）；β-細辛醚（金壇市威德龍化學有限公司，批號131203，純度98%）；安理申[衛材（中國）藥業有限公司，批號130821A，每片含鹽酸多奈哌齊5 mg]；銀杏葉提取物（貴州信邦制藥股份有限公司）；SOD檢測ELISA試劑盒（上海信帆生物科技有限公司，批號201603）；CAT檢測ELISA試劑盒（上海信帆生物科技有限公司，批號201603）；HIF-1α抗體（Affinity Biologicals Inc.，AF1009）；二抗HRP polymer conjugate（Invitrogen，1289835A）；丙二醛（MDA）檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號201708）。

2 方法

2.1 大鼠模型的制備

2.1.1 動物分組 SD大鼠經Morris水迷宮初篩后，按隨機數字分成7組，分別為假手術組、AD模型對照組、β-細辛醚低、中、高劑量組（10，20，30 mg·kg-1）、多奈哌齊組（0.75 mg·kg-1）、銀杏葉提取物組（24 mg·kg-1），每組15只。

2.1.2 AD模型大鼠的制備及給藥 術前將大鼠適應環境1周，術前12 h禁食，4 h禁水。3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠，沿頸正中切口，分離出雙側頸總動脈，分別用3-0型蠶絲線雙重結扎雙側頸總動脈的遠心端和近心端，縫合皮膚。假手術組僅分離暴露雙側頸總動脈而不結扎。在2-VO手術24 h后，進行神經功能學評價。

手術大鼠飼養恢復1周后，進行側腦室注射Aβ1-42，SD大鼠腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉后，固定于腦立體定位儀上，行正中切口暴露前囟，參照包新民[13]《大鼠腦立體定位圖譜》，以前囟為基點，后移0.8 mm，中線旁開1.2 mm為側腦室注射位點，以牙科鉆鉆開顱骨，用10 μL微量注射器自腦表面垂直向下進針4 mm，左右兩側分別緩慢注入Aβ1-42 3.5 μL（3.5 μg），5 min內均勻緩慢注入，留針5 min使Aβ1-42充分浸潤，假手術組注射等量生理鹽水，用少量骨蠟將骨窗封住，青霉素局部噴灑消毒后縫合皮膚，常規飼養，各組動物均在相同環境中自由攝食和飲水，造模7 d后經Morris水迷宮篩選及模型驗證，分組給藥。

β-細辛醚低、中、高劑量組分別按10，20，30 mg·kg-1劑量灌胃給藥，多奈哌齊組按0.75 mg·kg-1劑量灌胃給藥，銀杏葉提取物組按24 mg·kg-1給藥，正常對照組、AD模型對照組給予等劑量的生理鹽水，1次/d，連續4周。

2.1.3 大鼠神經功能學評價 在2-VO手術24 h后，對大鼠進行神經功能學評分，參照評分標準[14]：功能正常時得分最高為18分，1～6分為重度損傷，7～12分為中度損傷，13～18分為輕度損傷。剔除重度損傷和中度損傷大鼠，選擇13～18分的輕度損傷大鼠繼續實驗。

2.2 Morris水迷宮檢測大鼠學習記憶能力

SD大鼠分別在造模1周后和給藥4周后進行Morris水迷宮實驗，包括定位航行試驗和空間探索試驗2部分，方法參照文獻[15]。

定位航行試驗：測量大鼠獲取經驗（學習）的能力。實驗前1 d下午將大鼠放入水中適應2 min，使其熟悉實驗環境。正式實驗歷時2.5 d，每天分上、下午2個時段各訓練1次，將大鼠朝向池壁放入，同一次訓練所有大鼠入水點相同。設定潛伏期上限為120 s，記錄各組大鼠找到平臺的時間，即逃避潛伏期（escape latency）。如果大鼠在120 s內未找到平臺，需將其引至平臺并停留10 s以強化記憶，這時逃避潛伏期記為120 s。endprint

空間探索試驗：第3天下午撤除平臺，將大鼠在第6入水點面向池壁放入水池，記錄大鼠120 s內穿越原平臺所在位置的次數，作為空間探索能力的指標。

2.3 激光多普勒腦血流儀檢測大鼠局部腦血流量

分別于2-VO手術24 h后、給藥4周后檢測腦局部血流量。3%戊巴比妥鈉腹腔注射進行麻醉后，將大鼠固定至腦立體定位儀上，將激光多普勒腦血流儀的探頭固定在顱窗的軟腦膜上，以780 nm激發光照射監測大鼠頂葉局部5 min的腦血流量。

2.4 HE染色與剛果紅染色檢測腦組織病理變化

給藥4周后，每組隨機選取3只SD大鼠，10%水合氯醛腹腔麻醉，4%多聚甲醛心臟灌注，取出腦組織，固定于4%多聚甲醛溶液中24 h，依次脫水、透明、浸蠟及包埋切片。

將石蠟切片脫蠟至水，蘇木素染色，鹽酸乙醇分化，水洗藍化，置伊紅液復染后，常規脫水，透明，封片。在光鏡下觀察海馬CA1區神經元形態的變化。

石蠟切片常規脫蠟至水，甲醇剛果紅染色，堿性酒精分化液分化，水洗后Mayer蘇木素染核，脫水透明后中性樹膠封固。在光鏡下觀察海馬CA1區淀粉樣變化。

2.5 免疫組化檢測AD大鼠皮質HIF-1α

切片置于60 ℃烤箱烘烤2 h，脫蠟至水，蒸餾水洗2 min，經高壓熱修復后；用3%H2O2溶液阻斷過氧化物酶，經PBS洗滌，滴加HIF-1α一抗（稀釋倍數1∶200），4 ℃孵育過夜，PBS洗滌3次后滴加二抗，37 ℃孵育60 min，PBS洗滌3次，DAB顯色1～2 min復染、透明后封片，避光自然干燥。

在光鏡（目鏡×10，物鏡×20）下，觀察大鼠皮質神經細胞，以胞質或胞核內出現棕黃色顆粒的細胞為陽性細胞，隨機選6個不同的視野進行拍照，計數每個視野中1 mm×1 mm面積中陽性細胞數，取其平均值。

2.6 酶聯免疫吸附法測定大鼠血清中CAT，SOD及MDA水平

給藥4周后進行大鼠眼眶取血，3 000 r·min-1離心15 min后取血清于離心管中，20 ℃冰箱保存，備用。按照ELISA試劑盒操作檢測SOD，CAT和MDA。

2.7 統計學方法

采用SPSS 17.0統計軟件進行數據分析，結果以±s表示。Morris水迷宮實驗中逃避潛伏期數據采用重復測量方差分析進行統計，其他數據均采用單因素方差分析（One-way ANOVA） 進行統計。經方差齊性檢驗，若方差齊性，組間多重比較采用最小差值法（LSD）；若方差不齊，將采用 Dunnett T3 法進行多重比較。P<0.05為具有顯著性差異，P<0.01為具有極顯著性差異。

3 結果

3.1 β-細辛醚對AD大鼠學習記憶能力的影響

在完成側腦室注射Aβ1-42聯合2-VO造模1周后，AD模型組的逃避潛伏期較假手術組顯著延長（P<0.05）；給藥4周后，β-細辛醚低、中、高劑量組、鹽酸多奈哌齊組和銀杏葉提取物組與模型組相比，逃避潛伏期顯著縮短（P<0.05），見表1。

空間探索實驗結果顯示，造模1周后，AD模型組的穿越平臺次數顯著少于假手術組（P<0.01），而給藥4周后，β-細辛醚低、中、高劑量組、鹽酸多奈哌齊組和銀杏葉提取物組的穿越平臺次數顯著高于AD模型組（P<0.05），見表1。

3.2 β-細辛醚對AD大鼠局部腦血流量的影響

進行2-VO手術24 h后，AD模型組大鼠的局部腦血流量較假手術組顯著降低（P<0.01），給藥4周后，β-細辛醚中、高劑量組、鹽酸多奈哌齊組和銀杏葉提取物組的大鼠局部腦血流量均顯著提高（P<0.05，P<0.01），見圖1。

3.3 β-細辛醚對AD大鼠腦組織病理學改變的影響

HE染色圖顯示，假手術組的神經元排列規則、緊密、輪廓清晰結構完整；AD模型組的神經元則排列紊亂、密度減小，有明顯的神經元缺失、殘留空泡；經β-細辛醚中、高劑量、鹽酸多奈哌齊和銀杏葉提取物給藥4周后，可見給藥組較AD模型組病理狀態減輕，神經元增多、排列整齊、胞漿清楚，見圖2。

大鼠神經元CA1區神經元經剛果紅染色后，淀粉樣物質呈紅色，細胞核呈藍色，假手術組大鼠未發現明顯病理變化，而模型組的CA1區出現紅色淀粉樣物質沉淀，排列紊亂，神經元細胞變性。β-細辛醚 中、高劑量、鹽酸多奈哌齊和銀杏葉提取物給藥4周后，上述病理狀態均有所改善，見圖3。

3.4 β-細辛醚對AD大鼠血清CAT，SOD，MDA的影響

側腦室注射Aβ1-42聯合2-VO后的大鼠，其血清 CAT和SOD水平較假手術組顯著下降（P<0.01），給予不同劑量的β-細辛醚、鹽酸多奈哌齊和銀杏葉提取物后，血清CAT水平均顯著上升（P<0.05，P<0.01）；同時30 mg·kg-1的β-細辛醚組、鹽酸多奈哌齊組和銀杏葉提取物組也能顯著提高血清SOD水平（P<0.05，P<0.01），見圖4。

大鼠經側腦室注射Aβ1-42聯合2-VO后，血清MDA水平較假手術組顯著上升（P<0.01），給予中、高劑量β-細辛醚、鹽酸多奈哌齊和銀杏葉提取物后，血清MDA水平較模型組顯著下降（P<0.05），見圖5。

3.5 β-細辛醚對AD大鼠皮質HIF-1α的影響

假手術組的大鼠皮質僅少數細胞表達HIF-1α，AD模型組的HIF-1α陽性細胞數顯著增加（P<0.01），給予不同劑量的β-細辛醚、鹽酸多奈哌齊和銀杏葉提取物后，HIF-1α陽性細胞數較AD模型組 顯著減少（P<0.01），見圖6，7。

4 討論

目前用于研究AD的動物模型主要有腦內注射Aβ模型、自由基氧化損傷模型、轉基因動物模型等[16]，但這些模型作用因素單一僅部分模擬了AD的病理特征[17]，并沒有全面地體現人類AD行為學特征和病理學改變。同時，大量研究表明，無論在動物模型還是AD病人中均顯示腦缺血可能是AD的病因和初始觸發因素[18-21]。于是本研究結合β淀粉樣蛋白級聯假說和腦缺血，采用側腦室注射Aβ1-42聯合2-VO建立AD模型。課題組前期研究顯示，側腦室注射Aβ1-42聯合2-VO手術4周后能顯著降低大鼠空間學習記憶能力，使海馬區Aβ沉積、Tau蛋白磷酸化水平顯著增加，海馬皮層神經元丟失明顯，較全面地體現出AD特征，從而為本文提供了基礎。endprint

β-細辛醚為石菖蒲的主要有效成分，具有廣泛的藥理作用，尤其在改善學習記憶功能及治療AD方面的報道日漸增多。其能促進慢性鉛中毒大鼠的空間記憶障礙恢復和突觸形成[22]，緩解大鼠星形膠質細胞的氧化應激損傷[23]，抑制AD模型大鼠海馬神經元凋亡[24-25]，此外，本課題組在前期研究中也發現β-細辛醚能有效緩解大鼠大腦中動脈閉塞引起的局部腦缺血[11]，對Aβ1-42誘導星形膠質細胞活化所致的PC12 細胞損傷也具有保護作用[12]，提示β-細辛醚在防治AD方面具有巨大的潛力。

在本研究中，側腦室注射Aβ1-42聯合2-VO手術后表現出顯著的學習記憶能力下降、局部腦血流量降低現象。β-細辛醚給藥4周后，大鼠的逃避潛伏期縮短，穿越平臺次數增多；局部腦血流量增多，腦缺血癥狀得到緩解；病理狀態較AD模型組減輕，神經元增多、排列整齊、胞漿清楚，說明β-細辛醚能有效緩解該AD模型的癥狀，改善Aβ沉積和腦低灌注，這與文獻[26]的研究結果一致。

同時，β-細辛醚給藥4周后AD大鼠血清的CAT和SOD水平顯著升高，血清MDA水平顯著降低。MDA為脂質過氧化反應的代謝終產物之一，為脂質過氧化的標記物，其在體內的過量累積將引起細胞損傷，損害神經元的正常功能，引起認知障礙[27]，而SOD和CAT作為機體主要的抗氧化酶，能夠去除有害過氧化物，從而防止神經細胞損傷[28]，多項研究顯示，機體抗氧化能力的提高能夠使體內MDA水平下降，從而緩解AD進程[29-30]，說明β-細辛醚能夠通過提高抗氧化酶水平，減輕體內過氧化物對機體的損傷來緩解AD。

缺氧誘導因子-1（hypoxia inducible transcription factor-1， HIF-1）為參與調節氧穩態失衡的核心調節因子，由α和β亞基組成異源二聚體結構，其中α亞基對氧敏感，并受其調控。在缺氧狀態下，機體產生大量活性氧[31-32]，而活性氧能夠通過多種方式促進體內HIF-1α累積。Lamberti等發現低氧狀態下產生的活性氧能夠通過“ROS-ERK1/2-HIF-1α軸”促進HIF-1α的表達[33]，同時活性氧還能夠抑制介導HIF-1α降解的脯氨酰羥化酶的活性，降低HIF-1α亞基羥基化，從而加強HIF-1α穩定性，使其在體內含量增加[34-35]，大量研究表明，腦缺血后HIF-1α含量增加，其能通過促進細胞的凋亡和壞死，參與缺氧誘導的細胞死亡[35-37]。值得注意的是，高水平的SOD能夠有效抑制HIF-1α在體內的累積[38-39]，這與本研究結果一致，提示β-細辛醚可能是通過提高機體抗氧化能力，降低體內的活性氧類物質，從而降低HIF-1α水平，減輕HIF-1α對機體的損害，最終達到緩解AD的目的。

綜上所述，β-細辛醚有效緩解了Aβ1-42聯合2-VO建立的AD大鼠模型的病理癥狀，其作用機制可能是β-細辛醚通過提高機體抗氧化能力，降低體內的活性氧類物質，從而降低HIF-1α水平，減輕了過氧化物及HIF-1α對神經細胞的損傷，最終達到緩解AD的目的。

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[責任編輯 張寧寧]endprint