脾氣虛證大鼠尿液生物標記物的識別及其生物學意義

劉武平+李嬋藝+黃晶+廖婧竹+馬文杰+陳宏遠+芮雯

[摘要] 考察脾氣虛證大鼠尿液小分子代謝組成分，尋找脾氣虛證的標記物，闡明其與代謝通路之間的聯系。采用勞倦傷脾加限制飲食的方法構建大鼠脾氣虛證動物模型，分別進行D-木糖吸收實驗及血常規檢測。收集的尿液采用超高效液相色譜-飛行時間質譜聯用（UPLC-Q-TOF-MS）分析，尿液代謝指紋圖譜數據集進行主成分分析（PCA）和正交偏最小-判別分析（OPLS-DA）等統計學分析，篩選脾氣虛證的生物標記物。D-木糖和血常規測定結果表明脾氣虛證大鼠造模成功。正、負離子模式下的PCA，OPLS-DA得分圖顯著區分模型組和空白組。根據OPLS-DA分析的S-plot圖、VIP值、t檢驗及受試者特征曲線ROC下的面積（AUC），篩選并鑒定出苯丙氨酸、琥珀酸、烏頭酸、異檸檬酸、甜菜堿、犬尿酸、吲哚、肌酸、肌酸酐、乳清酸、黃嘌呤、黃嘌呤酸等24個脾氣虛證相關的生物標記物，主要涉及能量代謝、氨基酸代謝、色氨酸代謝、嘌呤代謝、嘧啶代謝。尿液代謝組學方法結合在線軟件包進行數據處理解析代謝通路，可為脾氣虛證及其他中醫證候的研究提供新的方法和思路。

[關鍵詞] 脾氣虛證； 代謝組學； 代謝指紋圖譜； 超高效液相色譜-飛行時間質譜聯用； 生物標記物

[Abstract] To identify biomarkers for spleen Qi deficiency by analyzing small molecule metabolites in urine， in order to expound the relationship between biomarkers and metabolic pathways. The spleen Qi deficiency model was established through dietary restriction and overstrain. All of the rats received D-xylose absorption experiment and blood routine test. Urine samples were collected in the next day. The urine samples were analyzed using UPLC-Q-TOF-MS to obtain the dataset of urine metabolic group. Principal component analysis （PCA）， orthogonal partialleast squares-discriminant analysis （OPLS-DA） and other multivariate statistical methods were employed to evaluate the quality of the dataset and screen out potential biomarkers of spleen Qi deficiency. The results of D-xylose absorption and blood routine demonstrated that the spleen Qi deficiency model was successfully established. In positive ion mode and negative ion mode， PCA and OPLS-DA score plots could clearly distinguish model group and blank group. According to S-plot of OPLS-DA， VIP value， t-test and area under receiver operating characteristic curve （ROC）， 24 biomarkers， including phenylalanine， succinic acid， aconitic acid， isocitrate acid， betaine， kynurenine， indole， creatine， creatinine， orotic acid， xanthine， and xanthurenic acid， were identified as associated with the spleen Qi deficiency， mainly involving energy metabolism， amino acid metabolism， tryptophan metabolism， purine metabolism and pyrimidine metabolism. Urine metabolomics method combined with online software package for data processing and analysis metabolic pathway can provide new methods and ideas for studies for spleen Qi deficiency and other traditional Chinese medicine symptoms.

[Key words] spleen Qi deficiency； metabolomics； metabolic fingerprint； UPLC-Q-TOF-MS； biomarker

代謝組學是測定生物體受病理生理刺激和基因修飾所產生的與時間相關的多元代謝產物的一門新學科[1]。通過分析生物體液和組織中內源性代謝物，可以尋找代謝物變化與整體生物學狀況的關系。近年來，代謝組學發展迅速，已經在植物學、毒理學、臨床診斷、藥物研發、營養科學等研究領域都得到了廣泛的應用[2]。代謝組學技術對于建立中醫病癥和機制的關系發揮重要的作用。endprint

脾氣虛證是臨床常見的中醫病癥之一，是因脾氣不足，運化失職所表現的虛弱證候[3]。脾氣虛證導致水谷精微運化不良、水液停滯而引起體內各種物質代謝紊亂，出現腹脹食少，大便溏薄，肢體倦怠，神疲乏力，氣短懶言，形體消瘦等癥狀[4]。目前，脾氣虛證的診斷多采用血清胃泌素、尿D-木糖排泄率、動物體征等指標，而這些指標難以系統闡述脾氣虛證的本質。脾氣虛證標記物的研究多為找出差異代謝物，而對于代謝物與脾氣虛證的本質的相關性卻報導較少。徐熒等[5]應用代謝組學探討脾氣虛大鼠血清小分子的變化，得到了一些與能量代謝相關的脾氣虛證的標記物。戰麗彬等[6]分析血漿小分子代謝組成分，發現了3個脾氣虛證代謝綜合癥的生物標記物。尿液是代謝組學研究重要的樣本之一，其含有多種內源性的小分子代謝物，能夠很好的反應機體的變化。尿液具有非損傷性、樣品量大優點，且尿液中蛋白含量低，前處理簡單。相比血清，尿液中共軛化合物的數量高于血清[7]。因此，本實驗從尿液代謝物入手，采用UPLC-Q-TOF-MS技術進行尿液代謝組學分析，通過R語言相關包進行多元統計分析篩選脾氣虛證標記物，并尋找與脾氣虛證相關的代謝通路，闡明代謝標記物與脾氣虛本質的聯系。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 UPLC-Q-TOF-MS 分析儀（美國Waters公司），Masslynx V4.1軟件 （美國Waters公司），FRESCO17低溫高速離心機（Thermo公司），紫外分光光度計（美國Beckman公司），DL-360A超聲波清洗器（上海之信儀器有限公司），甲醇、乙腈（色譜純，德國Merck公司），甲酸（色譜純，德國CNW科技公司），亮氨酸-腦啡肽對照品（Sigma公司），超純水（屈臣氏）。

1.2 動物實驗和樣品收集 雄性SD大鼠22只，體質量（200±20） g，購自廣東藥科大學動物實驗中心，健康證號44005900001668。脾氣虛模型的構建按先前的研究方法進行[8]。過程如下：所有動物適應性喂養1周，供試動物分為2組，空白組（K）11只，模型組（M）11只?？瞻捉M常規方法飼養，模型組單日游泳加禁食，雙日限制飲食（75 g·kg-1）的方式造模15 d，第16天進行大鼠血常規檢查和D-木糖吸收實驗。血常規檢測送于廣東藥科大學附屬第一醫院。第17天收集各大鼠的24 h尿液，保存于-80 ℃冰箱中備用。

尿液樣品室溫解凍。200 μL尿液加入300 μL的乙腈，渦旋2 min，4 ℃，13 000 r·min-1離心15 min，吸取上清液加入進樣瓶，待UHPLC-MS分析。吸取10 μL的各組尿液混合制成質量控制（QC）樣品。

1.3 UPLC-Q-TOF/MS分析樣品 色譜條件：色譜柱Acquity UPLCTM HSS T3（2.1 mm×50 mm，1.7 μm，Waters公司）；預柱為Waters AQUITY UPLC HSS T3 Van Guard Pre-Column（2.1 mm×5 mm，1.8 μm，Waters公司）；進樣量5 μL；流速0.3 mL·min-1，柱溫25 ℃；進樣室溫8 ℃，流動相為乙腈（B）和0.1 %甲酸水（A）。梯度洗脫條件：0～3 min，5%～20% B；3～7 min，20% B；7～18 min，20%～50% B；18～19 min，50%～100% B，19～20 min，100% B；20～21 min，100%～5% B；21～23 min，5% B。

質譜條件：采用ESI離子源，在正離子、負離子模式下分別采集數據，數據采集范圍m/z 100～1 500。離子源參數：毛細管電壓3 kV，錐孔電壓30 V，離子源溫度100 ℃，脫溶劑溫度300 ℃，霧化氣（N2）流速50 L·h-1，脫溶劑氣（N2）流速 500 L·h-1；碰撞能量（CE）10～40 eV。由于代謝物的濃度比較低，二級質譜的解離電壓設為10～20 V，以保證每個離子能夠得到碎片離子。Lock Mass為腦啡肽，實時校正的質量數：正離子模式[M+H]+為m/z 556.277 1，負離子模式[M-H]-為 m/z 554.261 5。流速為 0.02 mL·min-1，電噴霧的頻率為10 s。所有上訴的參數設置均采用Masslynx軟件控制，并進行數據的收集。

進樣程序：實驗首先進QC樣品5次以平衡色譜柱和系統，然后分析樣品。每5個樣品插入1個QC樣品，所有樣品隨機進樣，同批次進行，消除進樣次序和批次對分析結果的影響。正、負離子模式均采用上述進樣方式。

1.4 數據處理 數據處理所用到的相關軟件為：Masslynx軟件，MSconvent軟件，R語言（3.2.3版本），R相關軟件包（xcms[9]，ropls[10]，metabolomics，pROC，pheatmap）。具體過程：液質數據文件（.Raw）通過MSconvent軟件轉換為（.cdf）文件，轉換后的數據通過xcms包進行峰識別，峰匹配，峰校正，峰積分，最終得到一個保留時間、質荷比和峰強度的三維數據矩陣。xcms包所用函數分別為xcmsSet，retcor，group，fillPeaks，這些函數的相關參數設定為fwhm=10，bw=10，sn=5，mzrange=100～1 500。用metabolomics包中的Normalise函數對數據矩陣進行歸一化，函數參數method設定為sum。ropls包中的opls函數對數據矩陣進行PCA分析和OPLS-DA分析，PCA分析中opls函數的參數設定為scale="center"（中心化處理），其余參數用默認參數；OPLS-DA分析opls函數參數設定為scale="center"、predI=1（預測的主成分個數）、permI=1 000（置換檢驗次數）、crossvalI=10（十折交叉驗證）。十折交叉驗證的R2Y和Q2Y和置換檢驗對OPLS-DA模型進行質量評判。OPLS-DA分析的樣品診斷圖剔除組內差異大的樣本。剔除差異樣本后的數據進行OPLS-DA分析，通過OPLS-DA模型中變量的VIP值（VIP>1）、S-plot圖（Pcorr [1]>0.1，P[1]>0.05），篩選潛在標記物。metabolomics包中的TwoGroup函數對標記物進行獨立樣本的t-檢驗，刪除在空白組和模型組沒有顯著性的標記物（P<0.05）。pROC包中的ROC函數對標記物進行ROC曲線分析[11]，根據曲線下的面積大于0.7篩選具有診斷效果的標記物[12]。endprint

篩選出來的標記物的m/z輸入Masslynx軟件，計算出可能的加和離子和分子式，匹配HMDB，KEGG，MMCD，METLIN數據庫，找出誤差<10的代謝物和相關的MS/MS信息。對比二級信息確定最終的代謝物，這些代謝物即為脾氣虛證的標記物。Pheatmap包的pheatmap函數對標記物進行熱圖和聚類分析，評估標記物對模型的分離效果。

2 結果

2.1 脾氣虛模型的確定 脾氣虛模型的確定可通過動物體征、D-木糖吸收、血常規的白細胞數（WBC），淋巴細胞數（LYMPH），血紅蛋白含量（HGB）及體質量變化等方面考察。在體征方面，模型組大鼠出現躬身、扎堆、溫順、便軟等現象；模型組大鼠游泳時間隨著造模時間降低；正常組無上述體征。血常規、D-木糖吸收及體質量變化見表1。結果顯示，模型組與正常組相比，模型組大鼠體質量顯著性降低（P<0.01）、D-木糖吸收顯著降低（P<0.01）、白細胞數和淋巴細胞數顯著下降（P<0.01），血紅蛋白含量顯著降低（P<0.05），與前期研究結果相符[8]。D-木糖吸收降低表明脾氣虛證大鼠存在脾胃功能異常；WBC和LYMPH的下降說明脾氣虛證大鼠免疫功能降低。以上結果表明脾氣虛模型可用于后續的實驗。

2.2 尿液代謝指紋圖譜分析 采用UPLC-Q-TOF- MS技術對大鼠尿液進行分離與數據的采集。正、負離子模式下的基峰離子色譜圖（BPI），見圖1。同一樣本的BPI圖在正、負離子模式下互補，尿液中的代謝物得到很好的分離，保留時間在23 min內。本方法適用于全面的，完整性的代謝組學分析，有利于獲取更多的代謝物信息。

2.3 分析方法考察與數據質量評估 隨機挑選6個尿液樣本，按1.2項下的尿液處理方法平行處理樣品，UPLC-Q-TOF-MS分析，考察分析方法的重現性。QC數據挑選部分m/z，分別計算保留時間和峰面積的RSD，考察分析方法的穩定性，見表2。在正、負離子模式下，穩定性和重復性的保留時間RSD均小于2.0%，峰面積RSD均小于8.0%。表明采用的分析方法穩定性和重復性良好，可用于后續的樣品分析。

正負離子模式下的液質數據經峰匹配、歸一化、中心化等處理分別得到2 435個變量和1 794個變量。OPLS-DA是一種有監督的分析，組內差異會降低模型的預測能力。對變量進行OPLS-DA分析，基于OPLS-DA模型的樣品診斷圖，剔除組內的差異樣本[13]。由正負離子模式下的樣品診斷圖可以看出K8至K11和M10，M11不在樣本的聚類范圍內，故剔除。對空白組、模型組及QC數據進行PCA分析，通過QC數據在PCA得分圖中的分布考察數據的可靠性。得分圖顯示正負離子模式下的QC樣品分布集中，表明數據可靠；同時，正負離子模式下，空白組和模型組在第一主成分下能夠區分，表明模型可靠，見圖2。

2.4 脾氣虛證生物標記物的確定 正負離子模式下的數據矩陣進行OPLS-DA分析，并對OPLS-DA模型進行十折交叉驗證及置換檢驗，避免模型的過度擬合，確保模型的可靠性[14]，見圖3。

OPLS-DA得分圖顯示正常組和模型組能顯著區分。通常R2Y用來估計所構建模型與Y數據的匹配程度，Q2Y則用來評判所構建模型的預測能力[15]。R2Y和Q2Y的值越接近1，模型預測能力越高。正、負離子OPLS-DA模型的相關參數也列于圖3。正、負離子下OPLS-DA模型的R2X均大于0.6，R2Y，Q2Y均大于0.8，結果表明模型具有較高的解釋能力和預測能力。正、負離子下經1 000次置換檢驗獲得的R2Y與Q2的值接近真實模型的概率均低于0.001，其大部分小于真實模型計算值[16]。上述結果表明，在正、負離子模式下，樣本的多變量數據模型符合參數標準，可應用于候選生物標志物的篩選?；贠PLS-DA模型的VIP大于1和S-plot圖（Pcorr[1]>0.1，P[1]>0.05）及獨立樣本t檢驗（P<0.05），一共篩選了34個潛在標記物，其中正負離子模式下相同的標記物有5個。標記物經ROC分析，24個標記物在ROC曲線下的面積（AUC）大于0.7，這些標記物即為脾氣虛證的標記物。標記物的鑒定主要通過二級碎片信息和數據庫 匹配。具體鑒定過程為：如m/z 206.045 2的母離子，根據數據庫匹配誤差<10的代謝物，推測可能為黃嘌呤酸，在同樣的色譜條件下對尿液中的m/z 206.045 2 進行MS/MS分析，得到206.045 2的碎片信息為188.027 0，178.035 6，162.083 5，149.021 8。結合網絡數據庫，碎片離子188.027 0認為是分子脫去1個H2O分子，178.035 6認為是分子脫去CH2O，162.083 5認為是分子脫去HCOOH，以上3 個碎片能夠匹配二級數據庫中的碎片信息。而碎片離子149.021 8可能是分子脫去CH3COOH分子和H2O分子后加入NH4+而得到的子離子，因為在二級網絡數據庫中m/z 206.045 2 存在132.043 9的碎片離子（[M+H]+），131.043 9和149.021 8相差的相對分子質量為18，所以可能為131.043 9分子加和了NH4+。所有標記物的二級信息見表3。

2.5 標記物的熱圖與聚類分析 將24個標記物的相對色譜峰強度數據導入R軟件，經scale轉化利用pheatmap包進行HCA聚類分析生成相應的熱圖，見圖4。圖中顏色變化可以清晰地看到，24個代謝物中吲哚、膽堿、高絲氨酸、苯丙氨酸、吲哚乳酸、琥珀酸、甜菜堿等11個標記物在模型組中顯著的升高，肌酸、肌酸酐、犬尿酸、黃嘌呤、黃嘌呤酸、乳清酸、血清素、檸檬酸等13個標記物顯著的降低；樣品的聚類結果表明空白樣品和模型樣品聚類明顯，說明這24個標記物能夠將模型組和正常組區分。

2.6 脾氣虛證生物標記物的生物學意義 24個脾氣虛證潛在標記物涉及的代謝通路主要為能量代謝、氨基酸代謝、嘌呤代謝及嘧啶代謝。參考KEGG數據庫的代謝通路圖，利用Cytoscape軟件制作脾氣虛證代謝標記物的代謝通路圖，見圖5。結果表明，色氨酸代謝是脾氣虛大鼠改變最為顯著的代謝通路，多達9個代謝物與此通路相關。由此可知，脾氣虛證出現各種癥狀與色胺酸代謝紊亂有很大的聯系。脾氣虛證大鼠通常會有食欲降低和扎堆的癥狀并且食量下降，推測是受色氨酸代謝的影響。實驗結果還表明吲哚、吲哚乳酸、3-甲基羥吲哚在脾氣虛模型組中的含量顯著的升高，而這些標記物均是色氨酸的代謝產物。其中犬尿酸、黃嘌呤酸、血清素等含量顯著的降低，其原因可能是色氨酸的犬尿酸代謝途徑和5-羥色胺代謝途徑被抑制。有研究表明，色氨酸的犬尿酸代謝途徑和5-羥色胺代謝途徑受免疫反應的影響，免疫功能的降低會影響吲哚2，3-雙加氧酶（IDO）的活性，從而抑制其代謝途徑[17]。而色氨酸在色氨酸酶的作用下能夠代謝為吲哚等相endprint

關代謝物[18]。有研究顯示，脾氣虛證大鼠因腸道菌群失調，腸黏膜通透性增加導致免疫能力降低[19]。因此，脾氣虛證大鼠尿液中的犬尿酸、黃嘌呤酸、血清素、吲哚乳酸、吲哚等含量的異常提示色氨酸代謝紊亂參與了脾氣虛證的病理進程。

烏頭酸、檸檬酸、琥珀酸是三羧酸循環中重要的中間產物，而三羧酸循環是糖酵解的主要通路，并且也是機體重要的能量供應渠道。在本研究中，烏頭酸，琥珀酸在脾氣虛模型組中的含量顯著升高，檸檬酸在脾氣虛模型組中含量顯著降低。這可能與三羧酸循環中的相關酶的活性降低有關或者細胞線粒體功能的失常所致。有研究表明脾氣虛證大鼠中的琥珀酸脫氫酶的活性降低，抑制機體的三羧酸循環，導致琥珀酸在體內的積累[20]。研究發現脾氣虛患者胃粘膜壁細胞單位面積內線粒體均數明顯減少，并出現腫脹、嵴斷裂、膜缺損等癥狀[21]。表明脾氣虛證顯著抑制了三羧酸循環從而降低了機體的能量供應，導致機體氣血生化不足，從而出現精神疲憊、乏力，扎堆等癥狀。

在甘氨酸和絲氨酸的代謝通路中膽堿、甜菜堿在模型中顯著的升高，肌酸和肌酸酐的含量下降。這可能與線粒體功能異常及肌球蛋白表達下降有關。膽堿和甜菜將是機體合成甘氨酸的原料，其代 謝主要是在肝和腎的線粒體內進行，僅有4%被吸收的甜菜堿經腎臟排出，脾氣虛大鼠尿中甜菜堿的含量升高，說明體內甘氨酸的合成受阻。在大量的運動情況下，肌酸分解形成肌酸酐，為機體提供能量。周昕欣等[22]在補中益氣湯治療脾氣虛證大鼠肌無力的機制研究中發現脾氣虛組大鼠磷酸化肌球蛋白輕鏈的表達顯著下降，導致肌肉收縮能力下降，出現大鼠肌無力。本研究發現脾氣虛證游泳時間下降，由此說明絲氨酸和甘氨酸相關代謝物可以作為脾氣虛證的標記物。本研究還發現，苯丙氨酸含量異常說明脾氣虛證顯著的影響了苯丙氨酸代謝。在脾氣虛模型中，當苯丙氨酸代謝部分被阻斷后，苯丙氨酸含量在尿中排出量可能會增加。相關文獻報導了脾氣虛證血清也有苯丙氨酸代謝物[23]。由此推測脾氣虛證可能涉及苯丙氨酸代謝途徑的異常。本實驗還篩選出了其他代謝通路（如?；撬岽x，嘌呤代謝、嘧啶代謝），這3個代謝通路是本次研究首次提及的，與脾氣虛證的關系仍需進一步的探究。

3 討論

本實驗共篩選鑒定出苯丙氨酸、琥珀酸、烏頭酸、檸檬酸、甜菜堿、犬尿酸、吲哚、肌酸、肌酸酐、乳清酸、黃嘌呤、黃嘌呤酸、膽堿等24個脾氣虛證大鼠生物標記物；涉及的相關代謝通路主要為能量代謝，氨基酸代謝，嘌呤代謝和嘧啶代謝等。尿液代謝組學研究方法結合在線軟件包數據處理解析代謝通路，可以為脾氣虛證及其他中醫證候的研究提供新的方法和思路。

[參考文獻]

[1] Nicholson J K， Lindon J C. Systems biology：metabonomics[J]. Nature， 2008， 455（7216）：1054.

[2] Lindon J C，Holmes E，Bollard M E，et al. Metabonomics technologies and their applications in physiological monitoring，drug safety assessment and disease diagnosis[J]. Biomarkers，2004，9（1）：1.

[3] Maciocia G， Ying Z Z. The practice of Chinese medicine[M]. Edinburgh： Churchill Livingstone， 1994.

[4] 陳小野. 脾氣虛證動物模型初步規范化的造模方法和思路[J]. 中國中醫基礎醫學雜志，2003，9（1）：3.

[5] 徐熒，賈連群，杜瑩，等. 應用代謝組學探討脾氣虛大鼠血清小分子代謝譜群特征變化[J]. 中國中醫基礎醫學雜志，2015（11）：1382.

[6] 戰麗彬，初艷，趙欣捷，等. 基于代謝組學的脾氣虛證本質研究[J]. 世界科學技術——中醫藥現代化，2011，13（4）：622.

[7] Fernández-Peralbo M A，Castro L D. Preparation of urine samples prior to targeted or untargeted metabolomics mass-spectrometry analysis[J]. Trends Anal Chem，2012，41（41）：75.

[8] 張彩云，肖滿珊，廖雙葉，等. 實驗性大鼠脾氣虛證模型的建立及指標檢測[J]. 廣東藥學院學報，2015（6）：808.

[9] Smith C A，Want E J，O′Maille G，et al. XCMS：processing mass spectrometry data for metabolite profiling using nonlinear peak alignment，matching，and identification[J]. Anal Chem，2006，78（3）：779.

[10] Thévenot E A. Ropls：PCA，PLS （-DA） and OPLS （-DA） for multivariate analysis and feature selection of omics data[EB/OL].[2017-06-14].https：//rdrr.io/bioc/ropls/f/inst/doc/ropls-vignetle.pdf.

[11] Robin X，Turck N，Hainard A，et al. pROC： an open-source package for R and S+ to analyze and compare ROC curves[J]. BMC Bioinfor，2011，12（1）：77.endprint

[12] Li Y， Wang L， Ju L， et al. A systematic strategy for screening and application of specific biomarkers in hepatotoxicity using metabolomics combined with ROC curves and SVMs[J]. Toxicol Sci，2016，150（2）：390.

[13] Rinaudo P，Thévenot E A. Biosigner：a new method for signature discovery from omics data[EB/OL].[2017-06-14]. https：//bioconductor.org/packages/release/bioc/vignettes/biosigner/inst/doc/biosigner-vignette.pdf.

[14] Luan H，Liu L F， Tang Z，et al. Comprehensive urinary metabolomic profiling and identification of potential noninvasive marker for idiopathic Parkinson′s disease[J]. Sci Rep，2015，5（1）：13888.

[15] Liang X，Chen X，Liang Q，et al. Metabonomic study of Chinese medicine Shuanglong formula as an effective treatment for myocardial infarction in rats[J]. J Proteome Res，2011，10（2）：790.

[16] Westerhuis J A，Hoefsloot H C J，Smit S，et al. Assessment of PLSDA cross validation[J]. Metabolomics，2008，4（1）：81.

[17] Schrcksnadel K，Wirleitner B，Winkler C，et al. Monitoring tryptophan metabolism in chronic immune activation[J]. Clin Chim Acta，2006，364（1）：82.

[18] Westerhuis J A，Fursy R，Bret L，et al. Indole can act as an extracellular signal to regulate biofilm formation of Escherichia coli and other indole-producing bacteria[J]. Can J Microbiol，2003，49（7）：443.

[19] 張偉戈，廖玉婷，孟捷. 腸黏膜通透性增高與IBD、IBS發病機制和脾氣虛關系探討[J]. 遼寧中醫藥大學學報，2017（1）：187.

[20] 成映霞，杜娟，楊曉軼，等. 脾氣虛大鼠小腸組織Ca2+/CaM信號通路關鍵分子的表達變化[J]. 中華中醫藥雜志，2015（10）：3624.

[21] 姜洪華，周福生，廖榮鑫，等. 不同病種的脾氣虛證患者吸收細胞線粒體超微結構的觀察[J]. 廣東醫學，2008，29（4）：548.

[22] 周昕欣，王彩霞. 補中益氣湯治療脾氣虛證大鼠肌無力的機制研究[J]. 中國實驗方劑學雜志，2015，21（3）：92.

[23] 賈連群，甄畢賢，徐熒，等. 應用液質聯用技術研究脾虛大鼠血清代謝物譜群特征[J]. 中國中西醫結合雜志，2016，36（3）：359.

[責任編輯 張燕]endprint