腸道M細胞攝取、轉運抗原機制及其臨床應用研究進展

張 悅，苑夢偉，劉開陽，張 靜，呂雅潔，李凌軒，劉 偉

(1河北醫科大學,2河北醫科大學免疫教研室,河北省重大疾病的免疫機制及干預重點實驗室,河北石家莊050017)

0 引言

在1972年,Owen首次利用掃描電鏡觀察到人淋巴濾泡表面有一種特殊的細胞,因其表面沒有致密的微絨毛,取而代之的是豐富的微褶皺,故稱之為微褶皺細胞(microfold cell,M cell),也有人稱之為膜性細胞(membranous cell,M cell),簡稱為M細胞。完全分化的M細胞的基底部細胞膜向頂部突起,細胞內凹形成特有的“袋形囊腔”［1］,呈口袋狀。M細胞具有攝取、轉運抗原的功能,且現階段大多數學者認為其不具備加工提呈功能。M細胞的轉運可分為三個階段,這是一個高效、快速的過程。M細胞對微粒的捕獲機制可基于其性質分為兩種,在本文予以詳述。針對M細胞的體內培養和原位培養的問題,學者們建立了多種體外模型輔助理解。凝集素在細胞識別和粘著反應中起重要作用,主要是促進細胞間的粘著。這一特性可以輔助M細胞對于抗原的攝取和轉運。對于凝集素和M細胞之間聯系的研究可以為疫苗的研究提供方向。研究表明,SIgA選擇性的捆綁和吸收的機制為帶有循環核苷酸序列(AAAUA)的小鼠GP2的特殊配體結合于表達在細胞表面的mGP2。而GP2可以作為位于M細胞上的細菌抗原的轉錄受體,參與對一些特定細菌的黏膜免疫應答,這為研發抗菌藥提供新思路。

本文將詳細論述M細胞與以下疾病的聯系?？肆_恩氏病是胃腸道炎癥性疾病,病變始于含有M細胞的淋巴樣濾泡相關上皮(follicle-associated epithelium,FAE)［2］。肉毒毒素與無毒成分一起組成祖毒素復合物(PTCs)。L-PTC與血凝素(hemagglutinin,HA)和GP2相互作用,通過M細胞傳遞到基底外側表面,這對食源性肉毒中毒的發病起著主導作用［3］。白色念珠菌通過M細胞進入腸細胞層有兩條途徑［4］。M細胞運輸的瘋牛病病原體是人類變異型克雅氏病發病的重要因素［5］。發炎結腸中M細胞有可能被誘導產生,則M細胞有可能成為臨床診斷結腸炎的表征之一［6］。

M細胞的特異機制具有為黏膜免疫系統提供藥物或疫苗的潛力,疫苗接種是M細胞免疫學最成功的應用之一,M細胞靶向疫苗可以誘導有效黏膜免疫、保護病毒性心肌炎以及增強黏膜SIgA反應。相比于其他疫苗來說,口服疫苗有許多優點,在本文章中我們對其進行了介紹。

1 M細胞的頂端形態

研究表明,M細胞的表面特征主要是微絨毛缺失,這在非特異性捕獲腸腔粒子中起主要作用。M細胞基底部細胞膜向頂部突起,細胞內凹形成特有的“袋形囊腔”,這一結構縮短了轉運囊泡內抗原由腸腔面到基底膜表面的距離。在各種各樣的實驗中,David等［7］觀察到獨特的M細胞表型的特點是被誘導后其頂端表面有一種黏膜“捕蠅紙”,它能夠捕捉任何類型的腔內顆粒。

M細胞在頂端表面表達大量的免疫監視受體,一系列分子經由這些受體將腔內抗原最終傳遞到黏膜下層淋巴組織［8］。因此,腔內抗原可通過識別被其利用的分子入侵M細胞［8］。例如GP2、PrPC(prion protein,細胞朊蛋白 )、C5aR(C5a receptor,C5a受體)和其他特定分子。上文提到的GP2在M細胞的頂端膜上高度表達,可以作為細菌抗原的轉錄受體,尤其是與大腸桿菌(Escherichia coli)和血清型傷寒桿菌(S.Typhmurium)結合［1］。GP2還與肉毒桿菌神經毒素的血凝素A1結合,增加了肉毒桿菌［9］的易感性［10］。目前已有證據表明,在M細胞頂端質膜腔側上高度表達的PrPC可以通過增強流產布魯氏菌(B.abortus)或其他外源性抗原的胞吞作用來促進粘膜免疫監測［11］。值得注意的是,尿素調節素在上皮細胞的M細胞中也有特異性表達并有可能作為一種微生物吸收受體,但還需要詳細的研究來證實這一觀點［12］。

2 M細胞攝取、轉運抗原

2.1 M細胞捕獲顆粒的兩種機制 可溶性蛋白抗原與抗原顆粒具有形態上的區別,例如蛋白質分子和細菌之間存在差別,所以它們必須以不同的方式被捕獲。M細胞可以通過兩種不同的機制來捕獲顆粒：基于相關配體的俘獲受體的捕獲與基于生物粒子的物理化學性質的捕獲。

已有報道稱可使用特定的“捕獲受體”進行M細胞的微生物捕獲,這種受體包括可以與FimH(一種細菌纖維蛋白)結合的受體GP2以及其它的重組蛋白,如重新分布的黏附蛋白beta 1整合素,免疫球蛋白A結合蛋白等［7］。雖然M細胞表面還表達了其他受體,但是并有被證實其為捕獲受體。在配體介導的M細胞攝取中,因為在特定尺寸范圍內的粒子發生最優吸收,所以粒子的大小和配體密度己知是影響因素。

在某些特定條件下,基于物理化學性質的捕獲的效率明顯高于基于配體的俘獲受體的效率［7］。M細胞的轉運會因暴露的抗原不同而發生改變,即M細胞的轉運機制與被轉運物的性質有關,如體積大小、表面pH值、表面電荷、疏水性、濃度以及是否存在M細胞特異性受體等。關于靜電電荷,帶正電荷的粒子與細胞的親和力更強,在M細胞頂端的薄黏液層的滯留時間也比帶負電荷或非電離的粒子更長［13］。

2.2 過程 微皺褶(M)細胞是黏膜免疫監視系統的一部分,參與啟動黏膜免疫應答這一重要步驟。它可通過吸附、胞飲和吞噬等方式攝取腸腔內的抗原性異物,并以囊泡的形式將其捕獲到的微粒呈遞給固有層的腸道相關淋巴組織(gut-associated lymphoid tissue,GALT)(包括淋巴細胞,巨噬細胞和樹突狀細胞等),繼而,卵泡相關上皮(Follicle-associated epithelium,FAE)下的subepidome(SED)區域內的未成熟樹突狀細胞(DCs)捕獲抗原?？乖瓎拥腄Cs經過成熟,遷移到GALT的T細胞區,將抗原呈遞到T細胞,導致抗原特異性B細胞的激活,并最終由固有層的漿細胞產生 IgA 抗體［14］。

M細胞的跨上皮細胞轉運是先通過腸腔,然后穿過上皮黏膜屏障和潛在的免疫細胞的過程,它可分為三個階段：腸腔內抗原首先被吸附于細胞頂端膜,然后通過內吞囊泡被轉運至胞內腔室,最后從基底膜經胞吐作用出胞,進行胞外運動。M細胞的細胞質層呈口袋形狀,較薄,可以快速完成胞吞－胞吐過程。一個完整的胞吞胞吐作用序列最少只需10 min左右［4］,所以M細胞介導轉運的機制是一個高效、快速的過程。此外,有最新的研究在對M細胞的轉錄組分析時發現M細胞大量表達細胞內分子,這些分子可能在通過細胞外通道［15］的過程中促進囊泡運輸或肌動蛋白重塑,對于它們的功能分析為M細胞特異性抗原轉運的分子機制開辟了新的研究方向［11］。

2.3 M細胞與凝集素 在M細胞攝取和轉運抗原的過程中,靶向作用于M細胞表面的特定受體,可能有助于增加抗原的吸收和呈遞,從而啟動免疫應答反應。凝集素不止有一個能夠同糖結合的位點,因此其能夠參與細胞的識別和粘著,將不同的細胞聯系起來。

荊豆凝集素1(Ulex Europaeus Aggulutin-1,UEA-1)可以被綁定到M細胞上,并作為M細胞的特異性標記物。但是由于凝集素是有毒的并且容易發生腸道降解,除此之外,其受體在人PP中未表達,甚至在所有小鼠的M細胞中也未表達,因此在疫苗接種中UEA-1的價值是有限的,但是穩定的無毒小分子凝集素可能具有口服疫苗靶向的潛力。在誘導抗原特異性黏膜SIgA反應中,使用UEA-1對M細胞的靶抗原進行識別是有效的,這一點已被證實。

除UEA-1外,最近還有研究發現,唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素(Siglecs)中的成員siglecl-f也是一種新型的腸道M細胞標志物,它表達于暴露在腸腔的M細胞膜表面。當抗siglecl-f抗體注射到與M細胞結合的小鼠小腸中后,顯示出通過siglecl-f靶向 M 細胞的潛力［16］。

2.4 M細胞與SIgA M細胞介導的抗原攝取有助于誘導抗原特異性分泌SIgA,因此M細胞上的攝取受體可能是有效誘導病原體特異性SIgA的粘膜免疫靶點［10］。M細胞在黏膜內可以通過誘導SIgA的分泌,在不降解內化抗原的情況下進行轉化,從而在抗原特異黏膜免疫應答中發揮重要作用［17］。帶有循環核苷酸序列(AAAUA)的小鼠GP-2的特殊配體結合于表達在細胞表面的MGP-2是SIgA選擇性捆綁吸收的機制。Spib-b可誘導GP2,它是有效攝取腔內細菌抗原并將其傳遞到PPs并產生隨后的腸道抗菌免疫反應的先決條件［13］。最近有報道稱,M細胞表面的Dectin-1結合SIgA-抗原復合物,然后此復合物通過與DCs上的DC-SIGN相互作用被DCs轉移并內化,從而誘導黏膜和全身免疫應答［18］。

3 M細胞的體外模型

在過去,對于M細胞的研究依賴于體內或原位培養的方法,如分離的組織環或外植體培養,但在人和大鼠中,M細胞僅占FAE的5%～10%。如今,為了更好的研究M細胞,學者們建立了多種M細胞的體外模型。其中沿用較廣的是Des Rieux等人建立的模型——體外M細胞/FAE模型。此模型中,腺癌類腸上皮細胞系Caco-2通過與PP(peyer patch,PP)或人類淋巴細胞系共培養分化成M細胞,模仿其活性。因此,M細胞體外模型在研究病原體與腸上皮相互作用以及確定跨M細胞轉位所需的分子機制方面顯示出巨大的潛力。

4 M細胞與疾病

4.1 克羅恩氏病 克羅恩氏病(CD)是胃腸道炎癥性疾病,好發于末端回腸和右半結腸。本病臨床表現有腹痛、腹瀉、腸梗阻,伴有發熱、營養障礙等。病程多遷延,反復發作,不易根治。CD的微小黏膜病變稱為aphtoid病變,aphtoid病變起始于含有M細胞的FAE。發生在FAE中的腔內抗原/微生物、上皮細胞和DCs之間的相互作用可能是引起CD的關鍵步驟。多年來,腸道通透性的增加被認為是CD的致病因素。而最近的研究表明,CD中的腸道屏障缺陷是依賴TNF-a的［2］。在炎癥性腸病(IBD)的結腸炎癥標本中發現CD結腸黏膜中DCs數量增加以及在CD相關黏膜炎癥淋巴組織中M-DC8(+)DCs和th1型T細胞的表達,都可能有助于CD中TNF-a的產生。此外,Rickert發現70%的乳糜瀉患者存在aphtoid病變［2］,而乳糜瀉中常見的屏障功能障礙可能與FAE中免疫抗原相互作用引發的信號有關［19－20］。

4.2 食源性肉毒中毒 肉毒毒素是一種由肉毒桿菌產生的金屬蛋白酶毒素,進入神經細胞后,它將抑制神經遞質釋放并導致麻痹。肉毒毒素與一種或多種無毒成分一起組成祖毒素復合物(progenitor toxin complexes,PTCs),L-PTC與HA和GP2相互作用,突破了M細胞的腸上皮屏障,最終導致食源性肉毒中毒的發生。與腸腔環境中的肉毒毒素有關的nap(NTNHA/HA的復合體)在穿過腸上皮細胞后會分離,L-PTC的所有成分都通過M細胞傳遞到基底外側表面,并被CD11c DCs捕獲。HA與GP2的交互以及L-PTC與M細胞的定位都需要對所有HA亞組分進行集成即依賴于完整的HA復合體。這些發現為開發新型的抗毒素療法和口腔生物制劑系統提供了基礎［6］。

4.3 白色念珠菌感染 白色念珠菌粘附在上皮細胞上隨后發生內化,這是淺表性和侵襲性念珠菌病致病過程中的的一個關鍵步驟。這一內化過程是由M細胞經肌動蛋白介導的內吞機制通過識別菌絲主導的,此后,白色念珠菌侵入共培養物(與Raji B細胞系的B淋巴細胞共同培養的Caco-2細胞稱為共培養,可獲得M細胞),并在M細胞中進行有效傳遞。除內吞作用外,白色念珠菌也能夠在與M細胞相互作用的早期階段利用菌毛通過主動穿透侵入M細胞。由此可見,通過M細胞,白色念珠菌能夠用兩條途徑侵入腸細胞層［21］。

4.4 人類變異型克雅氏病 人類克雅氏病(Creutzfeldt-Jakob Disease,CJD)是傳染性海綿狀腦病(Transmissible spongiform encephalopathy,TSE),屬于致命的神經退行性疾病。研究表明人類變異型克雅氏病(Variant creutzfeldt-jakob disease,vCJD)與瘋牛病(即牛的TSE)有關,vCJD是人類食用了受到瘋牛病病毒污染的食品之后引起的。PrPSc作為瘋牛病的病原體,經口腔傳播時,通過腸道上皮細胞后經M細胞迅速整合入派爾集合淋巴結的FAE中,表明M細胞參與了在人體中運輸瘋牛病的病原體的過程。此外存在于M細胞的囊泡中的醛縮酶A作為PrP結合蛋白可與PrPSc結合,且M細胞分化的牛腸上皮細胞系能夠在我們的體外模型中轉染PrPSc。這些都表明了M細胞在人類變異型克雅氏病的致病過程中發揮了關鍵作用［9］。

4.5 炎癥性腸病 在腸道炎癥方面,經研究發現慢性腸道炎癥產生的炎性細胞因子可誘生PP型M細胞［6］。證據在于腸道炎癥,如炎癥性腸病(inflammatory bowel disease,IBD),會產生炎癥性細胞因子,而目前的研究表明任意表型子集的M細胞的發育和功能都與炎性細胞因子的局部產生密切相關［6］,例如在研究結腸炎的右旋糖酐鈉和檸檬酸桿菌模型的過程中,結腸上皮炎癥最嚴重時都能誘導出大量的PP表型M細胞［6］。若將這一觀點加以有效利用,則被誘生的M細胞可能在感染或自身免疫失調方面為結腸炎癥提供臨床診斷。

5 M細胞的應用與發展

病原體可以利用M細胞作為感染入口,同樣,利用M細胞特異的機制可以為黏膜免疫系統提供藥物或疫苗,而疫苗接種是M細胞免疫學最成功的應用之一［4］。

5.1 M細胞靶向性疫苗 在這里我們介紹三種M細胞靶向性疫苗。目前制成了一種有效的抗GP2-sa黏膜疫苗,抗GP2-sa可以有效誘導黏膜SIgA反應,以抗GP2-sa為基礎的M細胞靶向疫苗是誘導有效黏膜免疫的一種新策略［22］；M細胞靶向性疫苗CS-FimH-pvP1經口服免疫小鼠后,對柯薩奇病毒誘導的病毒性心肌炎具有保護作用［4］,這將對人類病毒性心肌炎治療的研究提供很大幫助；在動物模型中由Claudin-4特異性靶向肽介導的M細胞靶向增強黏膜SIgA反應強于對非靶向黏膜抗原的反應,這有希望應用于黏膜疫苗接種［8］。

5.2 口服疫苗 許多M細胞靶向分子已被用于黏膜疫苗的開發［2］,經口服的疫苗具有許多優勢：降低傳統注射方式感染病菌的可能性并減少人的疼痛感［4］；使用口服黏膜疫苗建立保護性免疫可以避免一些最初的病原體感染；能夠促進聚集于腸道的M細胞對抗原的吸收以建立腸道的局部免疫從而有效抵抗腸道病原體的入侵?，F在口服疫苗已成功應用于動物,現在研制了一種以M細胞和樹突狀細胞為靶向,傳遞豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)尖刺蛋白核心中和表位(centrotein core neutralization epitope,COE)的抗PEDV感染的口服重組干酪乳桿菌疫苗［23］。因此未來我們可以把開發針對M細胞的口服疫苗作為疾病預防的重點之一。

6 結語

綜上所述,M細胞轉運抗原是啟動黏膜免疫應答最重要的第一步。而近年來,隨著對M細胞攝取和轉運抗原的深入研究,M細胞的臨床醫學價值漸漸顯現出來。M細胞與多種疾病的發生密切相關,例如文中已列舉的克羅恩氏病,食源性肉毒中毒和白色念珠菌感染。雖然部分疾病已通過針對M細胞的藥物或疫苗得到治療,但目前可用的M細胞靶向疫苗不主動向M細胞定向抗原,因此就需要我們進一步了解M細胞的機制以搜索特定的M細胞分子開發M細胞靶向策略,為疫苗的進一步研究提供幫助。