拉曼光譜技術在仿制藥一致性評價研究中的應用

許曉輝，邱國玉，初 明，王小喬，朱天虹，李晨曦， 閆 君，趙 波

(1蘭州市食品藥品檢驗所,甘肅蘭州730050；2北京大學醫學部基礎醫學院,北京100191)

0 引言

仿制藥與原研藥只是主藥成分的分子結構相同,而仿制藥與原研藥中輔料、處方工藝等不同,由此兩者存在療效差異,因此,仿制藥需開展一致性評價研究。仿制藥一致性評價,是《國家藥品安全“十二五”規劃》中的一項藥品質量要求,旨在提高仿制藥質量,要求仿制藥質量和療效方面要與原研藥品保持一致,達到在臨床上可替代原研藥的療效,其一致性評價具體要求是仿制藥與原研藥雜質譜一致、穩定性一致、體內外溶出規律等一致。為了提高我國仿制藥質量,推進仿制藥事業發展,2016年2月,國務院正式發布了《關于推進仿制藥質量和療效一致性評價的意見》,部署了企業開展仿制藥質量和療效一致性評價工作,明確要求各藥品生產企業在2018年底之前完成2007年10月1日前批準的國家基本藥物目錄中化學藥品仿制藥口服固體制劑共289個品種的一致性評價。而拉曼光譜技術作為一種綠色的定性定量分析方法,《中國藥典》2010年版已將其收錄入附錄。目前,對于應用拉曼光譜技術對仿制藥進行研究主要集中在原料藥/輔料結構、晶型、粒度、組分分析、處方工藝等方面。

1 拉曼光譜技術概述

拉曼散射現象最早由印度科學家拉曼發現,它是基于拉曼散射原理的分子振動光譜,是研究化合物分子受到光照射后所產生的散射光、入射光的能級差與化合物振動頻率、轉動頻率相互關系的分析方法,通過測量拉曼散射光中特定譜成分的相對強弱,可以獲得被測分子或者體系的相關信息。拉曼散射實際上就是非彈性散射,分為斯托克斯散射和反斯托克斯散射兩種,斯托克斯散射為光經過散射后頻率減小,反斯托克斯散射為光經過散射后頻率增大。斯托克斯散射和反斯托克斯散射的強度遠小于瑞利散射,這也是在之前的實驗中未被發現的原因。這其中斯托克斯散射要強于反斯托克斯散射,拉曼散射主要由斯托克斯散射構成。待測分子本身具有特定的不同的振動模式,因此入射光在經過待測分子后會發生不同程度的改變,通過對這些波長的改變進行測定,我們可以得到對特定分子唯一的拉曼光譜,從而對待測物質進行定性的研究。

目前研究分子振動的主要方法有紅外光譜和拉曼光譜。與紅外光譜相比,拉曼光譜在很多領域具有其特有的優勢。比如拉曼光譜是一種無損檢測技術,對樣品狀態幾乎沒有要求,不需要樣品預處理,樣品可通過光纖探頭或者通過玻璃、石英直接測量；其次,水分子對拉曼散射幾乎沒有吸收,可用作水溶液中分子的檢測,是一種理想工具用來研究水溶液中的化學化合物；同時,拉曼信號不受入射光激光波長的影響,只取決于待測分子的振動轉動能級；再者,拉曼光譜可以一次同時覆蓋4000～50波數區間,可對有機物化合物進行定性定量分析,所得譜圖具有清晰尖銳的譜峰,比較適合通過差異分析來進行定性研究、定量研究以及數據庫搜索［1－3］。另外,高度可極化的官能團是拉曼信號的主要來源,非對稱的、具有高偶極矩的基團不能產生強的拉曼散射,而大多數藥物分子都具有可極化的官能團,因此有著很好的拉曼散射效應。拉曼光譜能夠反映多晶型藥物分子的結構信息,拉曼光譜的展寬小、分辨率高、峰形尖銳,可降低大分子輔料的干擾而實現對原輔料制劑的直接分析,同時,拉曼光譜對結構變化非常靈敏,細微的分子間作用力的改變也能在譜圖中體現。圖1為拉曼光譜儀的基本結構,主要包括光源、濾光系統、光波處理系統、樣品裝置和檢測器［4］。

2 拉曼光譜在仿制藥一致性評價研究中的應用

2.1 藥物制劑中主藥晶型研究 仿制藥研究首先要找到原研制劑的處方、工藝、質量標準等,若實在找不到,可通過反向工程進行研究,既對原研藥進行逆向分析,從而得出定性配方、原料藥的晶型、輔料的含量及制備工藝等要素,因此原輔料的物理性質研究是處方前研究的重要內容,而晶型又影響著原輔料的理化性質,直接影響藥物的溶解性、生物利用度與療效。而原研藥公司為了使自己研發的藥品具有更長時間的市場獨享權而對藥物分子的晶型都申請專利,這樣可以延長藥物的專利保護。對仿制藥公司來說,為了確保仿制藥和原研藥具有生物等效性,也需要對原料藥的晶型進行研究,以確保原料藥和制劑的質量能夠替代原研藥,正因為如此美國藥監局在ANDA申報中也對仿制藥多晶型控制有明確的指南。另外,仿制藥公司只有開發出藥物的新晶型才能夠打破原研藥公司對晶型的專利保護,提早將仿制藥推向市場,因此,晶型篩選是突破原研專利最有效的方式之一,更夠直接或間接帶來巨大的經濟效益。如果能找到在生物利用度、穩定性以及生產工藝等方面具有優越性的藥物新晶型,通過晶型篩選可以發現有利于發揮藥效作用的藥物優勢晶型,改善藥物的溶出和生物利用度,減小藥物毒性或根據晶型特點確定制劑工藝等,還可以申請晶型專利保護仿制藥制劑處方工藝研究。另一方面,有些藥物晶型很不穩定,需要考慮晶型的穩定性,嚴格控制操作過程和環境條件確保晶型不發生改變。而制劑中晶型檢測主要通過X射線粉末衍射和拉曼光譜進行檢測分析,通過對制劑中檢測到的活性成分(API)的X射線粉末衍射圖譜與參照圖譜對比,分析活性成分特征峰來判斷制劑中晶型歸屬,但是通常受到輔料干擾較大,比較難區分化學原料藥晶型之間的特征峰。另外,對于活性成分為無定形的藥物且制劑中同樣含有無定形輔料或者半水合物的情況下,X射線粉末衍射就比較局限了。而拉曼光譜法適用于制劑中低含量活性成分晶型檢測,其光斑直徑小,且通常情況下活性成分拉曼信號要強于輔料信號,因此,可以很大程度上的避免輔料的干擾。應用拉曼光譜技術,可以研究原研藥與仿制藥的拉曼光譜圖,通過拉曼光譜信號可以確定原研藥與仿制藥中化學原料藥晶型不一致,這將可能提示仿制藥與原研藥生物不等效。因此,拉曼技術為原研藥制劑中晶型分析,尤其是對無定形化學原料藥和低含量劑型等復雜條件下的晶型分析提供了解決之道,是一致性評價工作中的一大利器。近年來,計算機輔助預測藥物晶型在開發仿制藥新晶型方面有了較大應用進展,基于商業程序Polymorph Predictor,在固體藥物結構明知的前提下,通過計算點陣能量最小化方法探索藥物結構能量上可能存在的晶體結構和分子排列規律,并將它們按能量大小排列,計算出不同能量條件下最可能生成的晶型,但該方法目前在研究藥物晶型中的成功率還較低。另一方面,拉曼光譜技術也被應用到固體藥物制劑分散體結晶動力學研究,如有研究者采用實時拉曼光譜法對卡維地洛的溶劑介導多態轉變和冷卻結晶進行了研究,論證了在線拉曼光譜技術在原位藥物結晶分析中的優勢［5］,也有研究者應用拉曼光譜研究了不同活性藥物成分/聚乙二醇(API/PEG)固體分散體的結晶動力學,與純原料藥相比,苯佐卡因/聚乙二醇(BZC/PEG)(20/80 wt%)固體分散體中的苯佐卡因結晶速率明顯降低,而PEG基體對氟哌啶醇(HLP)的結晶行為沒有影響［6］,當然這些拉曼光譜在這些領域的探索,都可以應用到仿制藥一致性評價研究中。石云峰等人［7］采用激光共聚焦顯微拉曼光譜儀測定西尼地平片兩種可能的α、β晶型(已經X-衍射鑒定)、原研藥、國內仿制藥的拉曼圖譜,確定國內仿制藥和原研藥的晶型情況,結果顯示結果國內A、B 2家企業產品為α晶型,原研藥和國內C企業產品為無定型,國內仿制藥和原研藥晶型存在一定差異,其結果見圖2。

2.2 藥物制劑中粒度分析 在仿制藥一致性評價研究過程中,粒度是API、輔料和制劑中間體的粉體學研究的重要技術指標。原輔料的粒度會影響藥物制劑的物理、化學、生物行為,決定藥物的含量均勻度、溶出速率,體內生物利用度。對于難溶性藥物制劑,粒度分布的控制非常關鍵。全球在售藥物中難溶性藥物占40%,而這一數字在在研藥物中高達90%。因此,如何提高難溶性藥物的溶解性是制劑工藝的重點和難點,也是仿制藥一致性評價研究中處方工藝研究的重要內容。目前,有多種粒度測量儀器,如激光衍射粒度分析儀、庫爾特計數儀、顆粒圖像處理儀器等,而拉曼光譜技術應用于藥物粒度分析是近年來發展起來的一個新研究領域,甚至可以將拉曼光譜與光學顯微鏡和光學捕獲耦合起來,實現顯微長度的測量,對于一些高空間分辨率的無熒光表征的有機樣品和復雜樣品,利用近紅外激發光源照射上述樣品,在該波長上能夠發出強烈的熒光,能夠分析熒光強度大于1064 nm 的粒子［8］。 趙海云等人［9］基于圖像導向的拉曼光譜技術,研究了國產仿制藥來氟米特片與參比制劑(SANOFI)的粒度,作者先用拉曼光譜光學成像系統測量來氟米特片崩解液中顆粒的粒徑和形狀參數,然后采用拉曼光譜區分崩解液中API顆粒和輔料顆粒,獲得API顆粒的粒度和粒形分布結果,并比較國產來氟米特片和參比制劑在崩解后的粒徑和粒形差異。結果顯示,國產仿制藥來氟米特片崩解液中來氟米特API粒徑D(v,50)為79.8μm,參比制劑崩解液中API粒徑D(v,50)為17.6μm,且國產來氟米特片崩解液中發現較多API顆粒與輔料呈包結大顆粒狀態,因此在開展來氟米特片仿制藥質量一致性評價時,應進一步優化處方、生產工藝。

2.3 藥物制劑中成分分析 在原研藥制劑中,如何準確判斷某些含量極低組分的存在性則成為逆向工程分析的關鍵點?；诶上?可通過多種數學運算轉換為樣品組分圖像從而得到圖譜結果。將在制劑上測得的所有拉曼圖譜與每個單獨組分的特征光譜相對比是鑒定制劑中各成分最簡單的方法,如果某組分至少有一個不與其他組分重疊的特征峰能夠被檢測到,就能判斷出該組分的存在,如下圖3研究結果所示,研究者首先用來氟米特原料藥和輔料純物質建立拉曼光譜數據庫,選擇掃描區域內的顆粒自動進行拉曼光譜分析,將所分析顆粒的拉曼譜圖與數據庫進行比對,從而確定原料藥與輔料的拉曼光譜峰［9］,但實際情況中這種現象很少出現。通常,由不同的API及輔料組成的制劑,并且,這些成分顆粒小,混合均勻,因此這種制劑的拉曼成像光譜是多種成分信號的重疊。通過多變量分析法可以有效區分不同成分的特征峰,例如主成分分析法(PCA),直接經典最小二乘法(DCLS)等,可以提取有效信息,從而進行分析。拉曼顯微光譜作為固體制劑無損分析手段已經應用于藥學領域,與傳統技術相比,拉曼顯微光譜的最大優勢在于它不破壞固體制劑的空間結構可以“無損性”地分析其化學成分,還能通過對被分析物不同橫截面的表征,分析不同規格、形狀樣品的內部信息,得到API及輔料在制劑不同區域的分布,這種“無損性”分析技術所帶來的“表面”分析信息是常規的破壞性溶液分析技術如薄層色譜、分子排阻色譜、高效液相色譜所無法實現或替代的。如共聚焦拉曼顯微鏡也可以對藥物進行化學成像,主要是對劑型中的活性成分和賦形物進行空間成像,在低濃度配方中,根據空間成像快速鑒別主藥和輔料［10］。對于包衣、多層次等復雜制劑,當不同廠家同一藥品中的API分布區域不同時,可能說明不同廠家同一藥品所采用的生產工藝不一樣,而分布狀態和制備工藝的差別也可能直接暗示著不同廠家所生產的制劑在溶出行為方面存在差異,生物等效性方面存在差異。拉曼光譜儀也可與其他儀器聯用用于仿制藥成分分析,如液相色譜-表面增強拉曼光譜聯用儀(LC-SERS),盡管目前僅限于等速洗脫。雖然一些有機分析物可用于LC和LC-MS分析,但是LC-SERS方法的一個主要優點是它適用于分析沒有紫外線吸收或不能夠電離碎裂的分析物［11］。

圖3 來氟米特原料藥與輔料的拉曼光譜

2.4 溶出度研究 溶出度試驗在評價仿制藥與原研藥生物等效性方面發揮著重要的作用,其是模擬固體口服制劑在胃腸道中崩解和溶出的理想體外試驗法,是評價和控制藥品固體口服制劑質量的重要指標。目前藥典中提供的傳統溶出度測定方法僅能有限地反映藥物在體內的動態溶出過程,常用的溶出度測定方法是紫外光譜法和液相色譜法［12］。由于拉曼光譜可用于測定水中的目標化合物,其已被應用到藥物溶出度測定領域,無損快捷的優點使拉曼光譜有望成為溶出度測定的可選方法之一,美國藥典中已收錄了拉曼光譜法測定林可霉素溶出度的方法［13］。

3 總結

目前,拉曼光譜及其與其他技術相結合越來越多應用到仿制藥一致性評價研究中,其表現出一定的優越性。研究表明,拉曼光譜技術在仿制藥一致性評價研究中,小分子藥物的拉曼光譜特征很明顯,拉曼峰分布較廣,對其進行光譜識別簡單易行；而大分子都表現出較弱的光譜特征峰,常常伴隨復雜的包絡,不僅導致了對其光譜識別的困難,也很難準確確定特征峰位置［14］。鑒于仿制藥一致性評價中,制劑成分的復雜性所得拉曼光譜數據的復雜性,因此將拉曼光譜分析方法、數據采集與其他新型分析方法、數據處理方法(如主成分分析法、多項式擬合和非線性最小二乘法等)相結合來解析研究對象是拉曼光譜技術待解決的問題［15］。