聚左旋丙交酯納米纖維聯合骨髓間充質干細胞修復大鼠脊髓損傷的效果

高 鋒，張曉峰，段艷偉，嚴懷寧，潘永飛，葉 榮

脊髓損傷對于當前臨床治療來說是個難點，在既往的臨床治療過程中，特別是所謂“金標準”的自體神經移植，往往會帶來諸如供體神經缺少、供區部位損傷及修復效果不理想等并發癥[1]。隨著組織工程研究的進一步深入，發現了諸如聚羥基丁酸(polyglycolic acid, PGA)，聚左旋丙交酯(poly(L-lactic acid), PLLA)等這類高分子材料不僅可以模擬細胞外基質，還可以為細胞的黏附和生長提供良好的環境[2]。在既往的研究中發現，PLLA在體外可促進干細胞的增殖分化，體外對脊髓損傷亦有一定的修復作用。在本研究中，筆者制備了PLLA支架，進一步研究了其體外對細胞的作用及體內脊髓損傷修復的作用。

1 材料與方法

1.1 PLLA納米纖維膜制備 制備PLLA纖維的溶液配制如下：PLLA和PEO以質量比9∶1混合溶于TFE中，終濃度為2 wt %。將制備好的靜電紡絲溶液置于注射器中，注射器一端連接6#不銹鋼針頭(內徑為0.5 mm)，另一端與注射泵相連，泵的推進速度為5 ml/h。鋁箔作為納米纖維的接收端，在針頭和收集端的距離為20 cm，并施加12 kV的高壓直流電，其中針頭接正極，收集端接負極。制備的所有纖維都放入真空干燥箱中60 ℃ 24 h去除有機溶劑殘留[3]。

1.2 骨髓間充質干細胞的提取 取SD大鼠1只(出生4周左右，雌雄不限，體重150 g左右，江蘇省動物實驗中心)，以2%戊二醛腹腔注射麻醉后，75%乙醇浸泡3 min后，從大鼠股骨下端抽取骨髓，將骨髓與含10%FBS的MEM全培養液以1∶8的體積比例混勻，接種于50 ml培養瓶，于標準培養條件下(5%CO2、37 ℃)培養，2 d后首次換液，以后每3～4 d換1次液。待培養至第12～14 d，細胞覆蓋瓶底面積80%左右，用0.1%胰蛋白酶和0.02%的EDTA于標準培養條件下消化5 min，按照1∶3的比例傳代培養，以后待細胞基本長滿，按上述方法消化傳代，從而純化并擴增BMSCs[4]。

1.3 干細胞培養及活性檢測 將制備得到的PLLA納米纖維支架材料切割為圓形，直徑略小于48孔板的孔徑，以75%乙醇消毒5 min，然后用0.01 mol/L的PBS洗3遍。將P3 BMSCs(Bone mesenchymal stem cells)制備成5×106/ml的細胞懸液，接種PLLA納米纖維膜上，利用虹吸原理使BMSCs均勻分布。在培養1、4、7 d后，用細胞計數試劑盒CCK-8(Dojindo，日本)進行檢測，CCK-8溶液以1∶10稀釋于α-MEM培養液中混勻，每個樣品加入220 μl稀釋液后于5% CO2培養箱中37 ℃孵育3 h，然后每孔取100 μl液體轉移到96孔板中，在微孔板讀板儀(Symergy HT，Bio-tek，美國)上讀取450 nm波長處吸光值。樣品中剩余含CCK-8的培養液棄去，加入新鮮培養液繼續培養，可連續測數天的吸光值。實驗重復3次，每次每樣品設置6個重復。對照組為未在纖維膜上培養的干細胞。

1.4 干細胞向神經方向的分化檢測 接種細胞1 d，待細胞與材料融合后，將樣品從培養箱中取出，吸除培養液，每孔中加入200 μl事先配制好的RA誘導液(碧云天，中國)，乙醇擦拭，放入培養箱中。24 h后在倒置顯微鏡下觀察對照組細胞形態變化，每隔3 d換1次液。于加入RA誘導液后第3、6天，從實驗組、對照組進行Nestin、MAP-2抗體(Sigma公司，美國)的免疫熒光染色，觀察神經元樣細胞的生成情況。實驗重復3次，每次每樣品設置6個重復。

將所需材料從培養板中取出，放入新的培養板中，用PBS沖洗1次去除殘留的溶液。每片材料加入事先配制好的固定液1(2%tritonX-100，0.5%甲醛-PBS溶液)200 μl浸泡5 min，PBS沖洗1次，加入固定液2(4%甲醛-PBS溶液)200 μl浸泡20 min。PBS沖洗3遍去除殘留溶液，每孔200 μl加入1%BSA-PBS，置于37 ℃恒溫箱中封閉1 h。取出后每孔加入200 ul一抗兔抗大鼠Nestin-IgG，MAP2-IgG(用1%BSA稀釋200倍)置于4 ℃冰箱中過夜。取出樣品，用PBS漂洗，每孔加入200 μl加入ALexa-Fluor 488標記的羊抗兔二抗(用1%BSA稀釋200倍)，在避光條件下置于37 ℃恒溫箱中孵育1 h。染細胞核，取出樣品，PBS漂洗后每孔加入50 μl加入Hoechst 33342(Sigma公司，美國)，室溫下避光孵育30 mins。最后用PBS漂洗后封片置于光共聚焦顯微鏡下觀察(北愛爾蘭Andor公司)。

1.5 大鼠脊髓損傷模型的建立 成年SD大鼠48只，體重200～250 g，雌雄不限，隨機分為4組，聯合組12只，纖維膜植組12只，干細胞組12只，空白組12只。大鼠以2%戊巴比妥鈉(Sigma公司，美國)(2 ml/kg)腹腔麻醉后，俯臥位固定于手術臺上，取后正中切口，逐層顯露T8-10椎板，行全椎板切除，暴露出硬脊膜，采用改良的Allen重物打擊法[5]，在硬脊膜表面放置一直徑約3.0 mm的圓形墊片，用重10 g的銅制重物沿玻璃導管從25 mm高處垂直自由下落擊打在墊片上，造成脊髓損傷。打擊后大鼠出現擺尾反射，雙下肢及軀體回縮樣撲動，麻醉清醒后雙下肢弛緩性癱瘓為造模成功。PLLA聯合干細胞移植組在造模后在損傷部位周圍，植入有干細胞黏附的PLLA納米纖維膜，PLLA納米纖維移植組在損傷部位周圍，植入PLLA納米纖維膜，骨髓間充質干細胞移植組在損傷部位周圍，植入5 μl的干細胞懸液，密度約105/μl，空白組損傷部位周圍，植入5 μl的培養液。逐層縫合切口。術后予以大鼠5萬U青霉素肌注預防感染，每日1次，連續3 d，注意保暖，分籠飼養，每天2次行膀胱按摩協助排尿直至建立反射性排尿。

1.6 運動功能評分 于術后2、4、8周對大鼠進行BBB功能評分[6]，由非本組實驗人員但是熟悉評分標準者完成。

2 結 果

2.1 干細胞的培養和活性檢測 無論是否在PLLA納米纖維膜上的干細胞，在細胞接種后4～6 h，可見有圓形、透亮的細胞貼壁；培養第2～4天可見細胞形態變為長梭形、成纖維細胞樣或多角形，呈放射狀，形成小集落。當傳到第3代時，細胞形態較均一，多為長梭形或紡錘狀。CCK-8檢測發現在培養后的第1天及第4天，干細胞的增殖兩組之間的比較無明顯差異，而第7天的時候在PLLA膜上的干細胞增殖是要好于單純培養的干細胞的(圖1)。

圖1 BMSCs細胞活性檢測圖

BMSCs在普通培養皿中以及在PLLA納米纖維膜上培養1、4、7 d后的CCK-8細胞活性檢測，從圖中，我們可見在培養后的第1、4天兩組之間的細胞活性比較未見明顯差異(P>0.05)，培養7 d后，在PLLA納米纖維膜上的BMSCs增殖情況要好于普通培養皿中的BMSCs(P<0.05)

2.2 干細胞向神經方向分化的檢測 將P3 BMSCs接種至材料上，加入RA誘導后，于24 h后在倒置顯微鏡下觀察，可見部分細胞胞體開始回縮變小，邊緣不規整，突起逐漸伸出，呈不規則或圓形，周邊折光性強。第6天時，鏡下出現兩種形態的細胞，一種細胞體積較小，胞體兩側大多伸長出幾個短小和一個較長的突起；另一種細胞體積較大，胞體周圍長出很多放射狀的突起。未在材料上培養的干細胞，加入RA誘導后，細胞胞體亦開始出現回縮，以及突起伸出，第6天時亦可以觀察到兩種形態的細胞，但是數量上較材料組要少(圖2)。

圖2 干細胞向神經細胞方向分化第6天觀察圖(標尺：100 μm)

A.在材料上干細胞向神經細胞方向的分化，可見較多的細胞有神經樣細胞的形態；B.在普通培養皿中干細胞向神經細胞方向的分化，可見神經樣細胞較少

將P3 BMSCs接種至材料上，加入RA誘導后，3 d后進行免疫組化觀察，可見Nestin染色陽性而MAP-2染色陰性，6 d后觀察發現Nestin染色陰性而MAP-2染色陽性，對照組染色與材料組染色情況相似，3 d時可見Nestin染色陽性而MAP-2染色陰性，6 d后觀察發現Nestin染色陰性而MAP-2染色陽性，但是無論Nestin染色還是MAP-2染色均少于材料組(圖3)。

2.3 大鼠術后運動功能評分 BBB評分詳見表1，術后2周，各組之間比較未見明顯差異，術后4周，PLLA納米纖維+干細胞組、PLLA納米纖維組與干細胞組之間未見明顯差異，均優于空白對照組，術后8周，PLLA納米纖維+干細胞組優于PLLA納米纖維組及干細胞組，PLLA納米纖維+干細胞組、PLLA納米纖維組與干細胞組，均優于空白對照組。

組別術后2周術后4周術后8周PLLA納米纖維+干細胞組7.28±2.1512.68±2.4616.46±2.32PLLA納米纖維組6.59±2.2811.26±2.3812.70±2.66①干細胞組6.47±2.4310.91±2.1712.37±2.35①空白組6.02±2.237.23±2.07②8.29±2.25②

注：與PLLA納米纖維+干細胞組比較，①P<0.05；與另外三組比較，②P<0.05

圖3 干細胞向神經方向分化的免疫組化圖

A.在PLLA納米纖維膜上的干細胞經RA誘導3 d后的Nestin染色; B.在PLLA納米纖維膜上的干細胞經RA誘導3 d后的MAP-2染色;C.干細胞經RA誘導3 d后的Nestin染色;D.干細胞經RA誘導3 d后的MAP-2染色;E.在PLLA納米纖維膜上的干細胞經RA誘導6 d后的Nestin染色;F.在PLLA納米纖維膜上的干細胞經RA誘導6 d后的MAP-2染色;G.干細胞經RA誘導6 d后的Nestin染色;H.干細胞經RA誘導6 d后的MAP-2染色(標尺：100 μm)

3 討 論

利用組織工程技術修復受損的脊髓，是近年來發展起來的一項重要的治療策略。生物材料可以連接受損脊髓的遠近端，可以誘導再生的軸突從近端長向遠端[7, 8]。理想的支架材料應該具備易于細胞黏附、生物相容性好等特點。PLLA具有優異的生物材料性能，在生物材料領域中被廣泛應用[9]。PLLA是一種無毒、可生物降解的高分子生物材料.并且具有良好的生物相容性，其降解最終產物為CO2和H2O，中間產物乳酸也是人體正常的糖代謝產物，目前已在多種組織工程領域中應用[10]。應用靜電紡絲技術將PLLA制作成納米纖維支架材料，具有高孔隙率及高比表面積，有利于細胞生存所需的營養物質的轉運，可容納更多的細胞生存。在脊髓損傷的治療中，生物支架的主要作用是引導細胞的遷移、增殖、分化及凋亡，且能通過防止瘢痕形成及聚集生長因子而促進神經再生[11]。Matsumoto等[12]研究發現，PLLA合成膜在脊髓組織中有很好的生物相容性和快速的降解率，Li和Shi[13]報道，多孔隙的PLLA導管表面積增加，不但可用于周圍神經損傷的修復，對于脊髓損傷也有潛在的應用價值。納米纖維支架具有較高的比表面積，Ma和Zhang[14]首次利用液一液相分離技術成功地制備出了PLLA三維納米纖維支架，纖維直徑為50～500 nm，這種納米纖維支架在促進神經元軸突生長，選擇性地增加蛋白質吸附，促進成骨細胞分化和礦化方面具有積極的意義。筆者在實驗中亦發現在體外實驗中，在PLLA納米纖維材料上的干細胞比在普通培養皿中培養的干細胞有更好的黏附和增殖能力。

有實驗發現，神經干細胞與PLLA支架材料復合培養后，神經干細胞在材料表面生長良好且黏附緊密，Hoechst染色顯示細胞形態正常，未見明顯的凋亡和壞死[15]。神經干細胞在PLLA材料培養14 d后，神經元染色顯示細胞分化良好，且神經軸突沿納米纖維方向生長。類似地，在本研究中，筆者發現體外誘導干細胞分化為神經樣細胞的研究中，PLLA膜上的干細胞確實體現了比普通培養皿中的干細胞有更好更快的分化能力。

種子細胞和支架材料在組織工程中是兩個重要的要素。因此，種子細胞的選擇亦是關鍵問題。BMSCs是骨髓中的一種具有自我增殖、多向分化潛能的細胞，可分化為成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、神經細胞和肌細胞。BMSCs來源豐富并且在體外易于分離，提純和擴增，既避免了自體的免疫排斥反應，又不會引起社會倫理道德問題，同時它也是基因治療的理想受體細胞。BMSCs移植后可定向、定位分化為各類功能細胞，替代補充缺失細胞的結構和功能，釋放神經遞質、產生神經營養因子等，促進神經組織再生和抑制神經變性[16]，在特定的條件下能分化為神經元和神經膠質細胞[17]。研究顯示，神經損傷后 BMSC 移植可上調相關細胞因子的表達，促進神經細胞的再生以及神經細胞的修復從而發揮保護作用，將 BMSC 移植腦缺血再灌注后，BMSCs可促進少突膠質細胞增殖，以及激活 JAK2/STAT3 信號通道以及激活 MAPK 信號通道從而發揮神經保護作用[18]。筆者發現，本研究BMSCs移植在脊髓損傷處對于大鼠脊髓損傷恢復是有一定幫助作用的。但是亦有研究發現，BMSCs移植和分化效率很低，并且體內不一定能向神經細胞分化，另外其存活率也很低，修復效果并不理想[19]。細胞移植與組織工程技術相結合，主要是各種生物支架材料的應用，不僅可以直接填充脊髓損傷的缺損，而且還可以為BMSCs的遷移和貼附生長分化提供良好的微環境[20]。故本研究中，筆者將BMSCs種植于PLLA支架材料上，移植修復大鼠脊髓損傷，具有良好的修復效果。筆者在此研究中只是初步應用BMSCs復合支架材料對大鼠脊髓損傷進行了修復研究，而對于BMSCs種植在PLLA支架材料上，移植進入大鼠脊髓損傷處的生物學行為，以及修復機制等，尚需進一步的研究。

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