NADPH氧化酶在阿霉素心臟毒性的表達及意義

王震，王夢龍，劉劍芳，葉晶，徐瑤，姜慧敏，葉迪，萬軍

阿霉素（ADR）是一種廣譜抗腫瘤藥物，屬蒽環類抗生素，臨床上廣泛用于治療各種惡性腫瘤[1]。多項研究證實，心肌細胞對阿霉素有極強的親和力，阿霉素極易在心肌細胞蓄積，產生氧化應激損傷，導致嚴重的心臟毒性反應[2]。阿霉素心臟毒性作用早期表現非特異性的心電圖改變，如心律不齊，T波低平、ST-T改變和QT間期延長等，晚期則表現為頑固性的充血性心力衰竭。阿霉素心臟毒性具有累積效應，通常發生在積累量大于500 mg/m2[3]。然而，最近研究表明仍有21%的患者在積累量低于300 mg/m2時出現治療相關的心臟毒性[4]。因此，闡明阿霉素心臟毒性的具體機制，尋找有效的防治藥物，對改善患者預后具有重要意義。

氧化應激是指機體內在各種理化因素的刺激下，活性氧類（ROS）和活性氮類（RNS）大量蓄積，導致嚴重的組織細胞損傷過程。NADPH氧化酶（Nox）是心肌組織ROS和RNS的主要來源之一[5]。目前研究證實，Nox參與調控多種心血管疾病，包括心力衰竭、動脈粥樣硬化、心肌缺血再灌注損傷、高血壓病和心肌病等[6]。Matsushima等[7]證實在心肌缺血再灌注損傷模型中，Nox2和Nox4表達顯著上調，同時伴隨ROS水平升高，提示Nox在調控心肌缺血再灌注損傷的過程中發揮重要作用。然而，尚無研究闡明Nox介導的氧化應激與阿霉素心臟毒性的聯系。因此，本實驗構建小鼠阿霉素急性心臟毒性模型，探討Nox在阿霉素心臟毒性模型中的表達及其內在機制，旨在為防治阿霉素心臟毒性提供新的思路和理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物模型建立 40只8～10周齡SPF級野生型C57BL/6J雄性小鼠，由武漢大學動物實驗中心提供，體重為24±2 g，飼養于武漢大學心血管病研究所動物房。待小鼠適應環境1周后分組，隨機分為對照組和模型組，每組各20只。其中，模型組一次性腹腔注射20 mg/kg的阿霉素，對照組注射等量生理鹽水。2組小鼠均于第5 d處死，稱量并記錄小鼠體重、心臟質量和脛骨長度，計算心重脛骨長度比。

1.2 實驗儀器、藥品和試劑 組織研磨儀（MM400，Retsch），超聲裂解儀（XL-2000，Misonix ），全自動酶標儀（Synergy H4，BioTek），電轉儀（XCell SureLock?，Invitrogen），實時熒光定量PCR檢測儀（Cycler 480，Roche），電泳儀（DYY-6C，北京六一），離心機（1-14ED，Sigma），電泳槽及轉膜槽（DYCP-31DN，北京六一），雙色紅外激光成像系統（Oddesy，LICOR），脫水機（JJ-12J，武漢俊杰），包埋機（JB-P5，武漢俊杰），病理切片機（RM2016，上海徠卡），組織攤片機（KD-P，浙江科迪），烤箱（DGX-9003B，上海?，敚?，倒置熒光顯微鏡（NIKON ECLIPSE TI-SR，日本尼康），TRIzol（10296010，Thermo Fisher Scientific），逆轉錄試劑盒（04897030001，Roche），Anti-GAPDH、anti-Nox2和anti-Nox4抗體購自美國Santa Cruz公司，TUNEL試劑盒購自Roche公司。阿霉素注射劑購自浙江海正藥業股份有限公司。1.3 熒光TUNEL檢測 每組都各取10個心臟用4%多聚甲醛固定、脫水機內梯度酒精脫水，包埋后將蠟塊固定在石蠟切片機上切片，然后將切片攤平后置于烤箱內烘干，待脫蠟至水后微波修復。切片稍甩干后滴加破膜工作液破膜，將TUNEL試劑盒中的試劑1（TdT）和試劑2（dUTP）按2:29混合后加到切片上孵育2 h，待DAPI復染細胞核后用抗熒光淬滅封片劑封片，最后將切片置于倒置熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.4 心肌組織mRNA表達檢測 于-80℃冰箱取出樣本，放入研磨儀中研磨，每管加入1 ml TRIzol，用力搖晃后靜置10 min。加入200 ul三氯甲烷后放入4℃離心機，12 000 r離心15 min。離心后吸取上層清液，加入500 ul異丙醇并12 000 r離心10 min以沉淀RNA。離心后可見絮狀沉淀位于管壁和管底，用微量移液器去掉上清溶液，用1 ml 75%乙醇漂洗3次。漂洗后吸盡75%乙醇，室溫干燥10 min，然后加入12 ul DEPE水溶解RNA，同時放入55℃水浴鍋中10 min，以促進RNA的溶解。待RNA完全溶解后，用紫外分光光度計測定RNA濃度，計算RNA提取量。待RNA反轉錄為cDNA后，構建PCR反應體系，以GAPDH作為內參，采用2-△△Ct法進行定量分析。利用Primer-BLAST在線設計引物，特異性引物序列由北京擎科新業生物技術有限公司合成，Nox2和Nox4的特異性引物序列見表1。

1.5 心肌組織Nox2和Nox4蛋白表達水平檢測 取30～40 mg心肌組織，按照100 mg/1 ml加入RIPA裂解液，研磨后用超聲裂解儀裂解樣本。裂解后將標本放入4℃離心機，12 000 r離心15 min，然后吸取上清液并記錄上清液體積。待組織樣本定量后，72℃水浴10 min使蛋白變性，放入-80℃備用。將配制好的10%SDS凝膠放進電泳槽，按40 ug/樣品上樣電泳。電泳結束后取出凝膠，將凝膠平鋪在特制的夾板上，將PVDF膜覆蓋其上后轉膜，轉膜完成后用封閉液封閉1 h。封閉結束后加入適量一抗，4℃孵育過夜，然后二抗孵育1 h，利用雙色紅外熒光成像系統掃膜，以GAPDH為內參分析和計算Nox2和Nox4蛋白表達水平。

1.6 統計學方法 采用SPSS 18.0軟件進行統計學處理。計量數據以均數±標準差表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，非正態分布數據采用非參數檢驗。 P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 小鼠各項指標比較 相較于對照組，模型組小鼠體重（20.18±1.01）g vs.（24.63±1.32）g、心臟重量（99.3±3.21）mg vs.（120.95±3.87）mg和心重脛骨長度比（5.52±0.16）mg/mm vs.（6.71±0.21）mg/mm均明顯減?。≒＜0.05）（圖1）。

2.2 熒光TUNEL結果 相較于對照組，模型組小鼠心肌細胞凋亡指數明顯增加（15.23±0.52）%vs.（2.03±0.15）%, 差異具有統計學意義（P＜0.05）（圖2）。

表1 Nox2和Nox4特異性引物序列

2.3 Nox2和Nox4 mRNA和蛋白質的表達 與對照組相比，模型組小鼠心肌Nox2和Nox4 mRNA和蛋白質表達升高（P＜0.05），表明在阿霉素誘導的心臟毒性模型，Nox表達增加（圖3～5）。

圖1 2組小鼠體重、心重和心重脛骨長度比情況

圖2 2組小鼠心肌細胞凋亡指數

圖3 Nox2和Nox4 mRNA在心肌組織的表達（與對照組比較，*P＜0.05）

圖4 Nox2和Nox4蛋白電泳圖

圖5 Nox2和Nox4蛋白在心肌組織的表達情況（與對照組比較，*P＜0.05）

3 討論

阿霉素的心臟毒性一直是基礎和臨床研究的熱點課題，但其具體機制至今仍未完全闡明。目前的主流觀點認為阿霉素的心臟毒性是多種因素共同作用的結果，包括氧化應激損傷、鈣超載、鐵代謝失衡、線粒體損傷、細胞凋亡等。阿霉素誘導的ROS主要有二種途徑：一是阿霉素的蒽環結構直接與胞內Fe3+結合，形成Fe3+-蒽環復合體，導致大量羥自由基的產生；二是阿霉素的蒽環在多種還原酶的作用下被還原為半酰自由基，通過與氧結合產生大量的ROS[8,9]。機體內的ROS主要包括超氧陰離子（O2-）、羥自由基（·OH）、過氧化氫（H2O2）和次氯酸（HOCl）等，ROS通過破壞細胞膜結構的完整性和改變膜蛋白的功能，增加細胞膜的通透性，導致核酸和蛋白質合成受阻，進而引起細胞凋亡。此外，ROS在線粒體大量堆積，干擾線粒體有氧呼吸電子傳遞鏈、三羧酸循環和脂肪酸氧化等過程，抑制三磷酸腺苷合成和分解，導致能量代謝障礙[10,11]。目前，ROS在阿霉素心臟毒性中的重要作用日益受到重視，多種抗ROS物質已被證明對阿霉素心臟毒性具有保護作用。

Nox是一類跨膜蛋白家族，包括Nox1、Nox2、Nox3、Nox4、Nox5、雙功能氧化酶1和雙功能氧化酶2等。 Nox主要由胞膜亞基（gp91phox和p22phox）和胞漿亞基（p67phox、p47phox、p40phox和Rac2GTP酶）兩部分組成。其中，gp91phox是Nox主要的功能亞單位，而p22phox通過與Nox的激活因子結合，胞內調節作用[12]。心肌細胞主要表達Nox2和Nox4，其中，Nox2主要催化產生O2-，而Nox4主要產生大量H2O2[13]。Nox是細胞內ROS產生的主要來源之一，參與調控細胞增殖、凋亡及基因轉錄等。多項研究表明，Nox在心力衰竭、動脈粥樣硬化、心肌缺血再灌注損傷、高血壓病和心肌病等多種心血管疾病的發生發展過程起著重要的作用,但仍存在較大爭議。最近的研究發現，在血管緊張素Ⅱ誘導的高血壓模型，Nox2的表達升高，敲除Nox2可減輕血管緊張素Ⅱ誘導的升壓效應，而過表達Nox2則加重血管緊張素Ⅱ誘導高血壓[14]。Zhao等[15]也證實，過表達Nox4加劇血管緊張素Ⅱ誘導的心肌肥厚和間質纖維化，而使用Nox4抑制劑可通過改善氧化應激和ROS生成，減輕心肌重構和纖維化。本課題組前期研究結果表明，心力衰竭患者心肌氧化應激水平升高，心肌組織Nox4表達上調，且通過激活絲裂原活化蛋白激酶通路參與心肌纖維化過程，而Nox2的表達無統計學意義，提示針對Nox4的干預可能改善心力衰竭和心肌纖維化[16]。

本研究首先通過大劑量注射阿霉素誘導心臟毒性反應，模型組小鼠心重、體重和心重脛骨長度比均明顯下降，心肌細胞凋亡加重，表明心臟功能嚴重受損。同時，模型組小鼠心肌組織中Nox2和Nox4 mRNA和蛋白質水平均明顯上調，推測阿霉素可能通過上調心肌組織Nox和氧化應激水平，加重心肌細胞凋亡，從而導致嚴重的心肌損傷?？傊?，本研究結果提示Nox通路參與阿霉素心臟毒性的損傷過程，而對Nox通路的干預有可能成為蒽環類抗癌藥相關心臟毒性防治的有效靶點。

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