抑制Akt／PKB信號通路促進缺氧誘導的人牙周膜成纖維細胞凋亡

劉惠莉

牙周炎是一類高發性的口腔炎癥疾病，嚴重危害人類口腔健康，并與全身健康和諸多疾病有著密切的關系，在全球有著極高的發病率［1］。

近年來研究發現牙周炎主要是厭氧菌的混合感染，缺氧環境更有利于厭氧型致病菌的生長和繁殖，因此缺氧環境會加重牙周炎病變過程，影響牙周組織的防御和修復，并直接誘導牙周組織細胞的凋亡［2］。牙周膜成纖維細胞（hPDLFs）是牙周組織內的主要組成成分，其生物活性與牙周炎的發生密切相關［3］。

缺氧誘導的hPDLFs凋亡與牙周炎密切相關［4］。缺氧誘導因子-1（HIF-1）由α和 β兩個亞基組成，HIF-1α蛋白在細胞核中表達，常氧條件下迅速降解。在缺氧的條件下，HIF-1α含量則顯著提高，與含缺氧反應元件的下游基因結合，激活缺氧應答基因調控系統的缺氧應答反應［5］。

本文主要研究在缺氧條件下，抑制Akt／PKB信號通路對hPDLFs凋亡的影響，為進一步闡明牙周炎的發病機制提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料與儀器

hPDLFs（BioWhittaker公司，美國）；DMEM培養基（Gibco公司，美國）；厭氧產氣袋AnaeroPack（三菱公司，日本）；FITC-Annexin V、Propidium Iodide（BD Biosciences Pharmingen公司，美國）；Lipofectamine 2000轉染試劑盒、si-Akt、si-control（Introvigen公司，美國）；Fast SYBR Green mastermix kit（Applied Biosystems公司，美國）；HIF-α單抗、pAktser473單抗、t-Akt單抗、βactin抗體及酶標二抗（CST公司，美國）；流式細胞儀（BD公司，FACSCalibur，美國）；PCR儀 （ABI公司，9700，美國）。其他常用試劑購自上海生工公司。

1.2 細胞培養

從液氮中快速取出hPDLFs，復蘇后，用含有4 ml DMEM培養基的25 cm2的培養瓶在37℃、5%CO2培養箱中培養，24 h后更換培養基繼續培養。

1.3 細胞缺氧處理

將hPDLFs接種入培養瓶，放入厭氧產氣袋AnaeroPack，產生CO2，減少氧氣含量至1%左右，扎口密封，放入細胞二氧化碳培養箱培養48 h。

1.4 細胞轉染

取hPDLFs以7.5×104／孔的密度接種于6孔板中，5%CO2、37℃的培養箱中進行培養4 h。采用Lipofectamine 2000轉染試劑盒轉染，分別將si-Akt和si-control轉染至細胞中，轉染48 h后，收集細胞用于后續實驗。

1.5 流式細胞儀檢測細胞凋亡

取穩定轉染和缺氧48 h處理的hPDLFs，培養48 h后收集并消化細胞，接種在6孔板中，PBS洗滌3次，使用500μl binding buffer重懸細胞，調整細胞濃度為1×105／孔，各孔加入5μl Annexin V-FITC和5μl PI混勻，室溫避光放置10 min，流式細胞儀檢測細胞的凋亡率。

1.6 qRT-PCR

取穩定轉染和缺氧48 h處理的hPDLFs常規培養，用TRIzol試劑提取細胞中的總RNA。以提取的RNA為模板，反轉錄成cDNA。加入熒光染料SYBR Green，在ABI 7900 qRT-PCR系統，以U6 snRNA為相對定量的內參進行HIF-1α蛋白mRNA的擴增。

1.7 Western blot檢測蛋白表達

取穩定轉染和缺氧48 h處理的hPDLFs，培養48 h后消化收集，加入RIPA裂解液提取總蛋白，進行12%的SDS-PAGE電泳，將分離的蛋白轉膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h后，將單抗HIF-α、p-Akt、t-Akt、Bcl-2、Bax在4℃條件下孵育過夜，加入二抗（辣根過氧化物酶標記），室溫孵育1 h，ECL顯影檢測蛋白表達。

1.8 MTT法檢測細胞增殖

取穩定轉染和缺氧48 h處理的hPDLFs進行消化收集，以1×105／孔的密度接種于96孔板中，37℃、5%CO2條件下分別培養12、24、48、72 h后，加入10 μl MTT溶液，孵育4 h后，棄掉培養液，每孔加入150μl DMSO蕩搖勻后，酶標儀檢測490 nm的吸光值。

1.9 統計分析

2 結 果

2.1 缺氧抑制hPDLFs的增殖

在12、24、48、72 h時，缺氧組的細胞增殖率明顯低于常氧組（P＜0.05）（圖 1）。

圖1 缺氧抑制hPDLFs增殖Fig 1 Proliferation inhibition of hPDLFs by hypoxia

2.2 缺氧促進hPDLFs凋亡

與常氧組相比，缺氧組的hPDLFs的凋亡率明顯提高（圖2A、2B）。缺氧組的Bax蛋白表達量明顯提高，Bcl-2蛋白表達量明顯降低，Bax／Bcl-2的比值明顯提高（圖2C）。說明缺氧顯著促進hPDLFs凋亡。

2.3 缺氧促進HIF-1α蛋白的表達

缺氧組的HIF-1α表達量明顯高于常氧組（圖3A），而HIF-1α的mRNA表達沒有明顯的變化（圖3B）。結果說明缺氧顯著促進HIF-1α的蛋白表達。

2.4 缺氧抑制Akt／PKB信號通路

與常氧組相比，pAktser473的表達量明顯降低，而總Akt的表達量沒有明顯變化（P＜0.05），說明缺氧明顯抑制了Akt／PKB信號通路（圖4）。

2.5 抑制 Akt／PKB信號通路促進缺氧條件下HIF-1α的蛋白表達

在缺氧條件下，si-Akt明顯降低了pAktser473的表達，而總Akt的表達量沒有明顯變化，si-Akt抑制了Akt／PKB信號通路（圖 5）；在缺氧條件下，si-Akt組的HIF-1α蛋白表達明顯高于si-control組，說明si-Akt顯著抑制Akt／PKB信號通路，且明顯提高了缺氧條件下HIF-1α蛋白的表達（圖5）。

2.6 抑制Akt／PKB信號通路增強缺氧對的hPDLFs增殖的抑制

將si-Akt和 si-control轉染 hPDLFs以研究 Akt／PKB信號通路抑制對hPDLFs增殖的影響。結果顯示，在缺氧條件下，si-Akt組的hPDLFs增殖抑制率明顯高于si-control組，且在24、48、72 h時有統計學差異（圖6）。說明抑制Akt／PKB信號通路促進缺氧對hPDLFs增殖的抑制。

圖2 缺氧誘導hPDLFs的凋亡Fig 2 Apoptosis of hPDLFs induced by hypoxia

圖3 缺氧提高hPDLFs HIF-1α蛋白的表達Fig 3 HIF-1αexpression in hPDLFs

圖4 缺氧抑制Akt／PKB信號通路Fig 4 Inhibition of Akt／PKB signaling pathway by hypoxia

2.7 抑制 Akt／PKB信號通路促進缺氧誘導的 hPDLFs的凋亡

在缺氧條件下，與 si-control對照組相比，si-Akt組的 hPDLFs凋亡率 明顯提高（P＜0.05）（圖 7A）。Westernblot結果表明，與si-control組相比，si-Akt組的Bcl-2蛋白表達量明顯減少，Bax蛋白表達量明顯增加，Bax／Bcl-2的比值明顯提高（圖 7B）。說明抑制Akt／PKB信號通路顯著促進缺氧誘導hPDLFs的凋亡。

圖5 抑制Akt／PKB信號通路促進缺氧誘導的HIF-1α蛋白表達Fig 5 Promotion of HIF-1αexpression by the inhibition of Akt／PKB signaling pathway hypoxic-induced reduction of HIF-1αlevel

圖6 抑制Akt／PKB信號通路增強缺氧誘導的hPDLFs增殖抑制Fig 6 Increase of the inhibition of hypoxia induced proliferation of hPDLFs by inhibition of Akt／PKB signaling pathway

3 討 論

圖7 抑制Akt／PKB信號通路促進缺氧誘導的hPDLFs的凋亡Fig 7 Increase of hypoxia-induced apoptosis of hPDLFs by the inhibition of Akt／PKB signaling pathway

細胞凋亡是在正常生理或病理狀態下機體細胞發生的一種自發的、程序化的死亡過程，是細胞缺氧誘導細胞損傷的主要形式。細胞在缺氧條件下，細胞核中HIF-1α蛋白顯著增加，引發一系列細胞缺氧反應［6］。本研究發現hPDLFs在缺氧條件下的凋亡率明顯高于常氧條件下的凋亡率，說明缺氧促進了hPDLFs的凋亡，且缺氧條件下的HIF-1α蛋白表達量明顯增加，HIF-1α mRNA沒有明顯的變化，常氧條件下幾乎無HIF-1α的表達。研究表明缺氧對HIF-1αmRNA水平沒有影響，但可以顯著影響蛋白水平變化，可能是對轉錄后水平的調控。在缺氧的條件下，細胞核中HIF-1α蛋白顯著增加，同時HIF-1β亞基從胞漿轉移入細胞核中，與細胞核中的HIF-1α形成異二聚體。HIF-1異二聚體與含缺氧反應元件的下游基因結合，激活缺氧應答基因調控系統的缺氧應答反應，引發一系列細胞缺氧反應［7］。

Akt／PKB參與了多個細胞過程。SARS冠狀病毒膜蛋白通過激活caspase-8和caspase-9并抑制PDK1與Akt／PKB信號通路的相互作用誘導細胞凋亡［8］。環氧化酶抑制劑SC236通過下調Akt的表達和上調Cyt-C的表達誘導胃癌細胞的凋亡［9］。Baran等［10］發現Akt／PKB信號通路可以作為介導小鼠胚胎細胞抗凋亡信號的主要靶標。在本研究中，實驗結果證明缺氧顯著促進hPDLFs的凋亡，抑制細胞增殖，抑制Akt／PKB信號通路，并且抑制Akt／PKB信號通路顯著促進缺氧誘導的hPDLFs的凋亡，增強缺氧誘導的hPDLFs增殖抑制，提高HIF-1α蛋白的表達，為牙周炎發病機制的進一步研究提供了理論依據。

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