微骨粉酶解液反應制備肉味香精工藝優化

張崟，唐歡，張龍翼，黃偉民，李茜雅，夏虎，郭思亞

(成都大學肉類加工四川省重點實驗室，成都　610106)

畜禽及魚骨中含有大量的蛋白質、礦物元素等營養物質，是一種具有較高潛在利用價值的肉類加工副產物[1,2]。我國是肉類生產大國，僅2016年因畜禽肉類生產和消費而產生的畜禽骨多達1725～2588萬噸[3]。如此多的畜禽骨，如果不將其充分利用，不僅會造成資源的嚴重浪費，而且還會對環境保護帶來沉重負擔[4]。目前，在畜禽及魚骨的回收利用方面，主要的難題是難以使其中的營養物質充分溶出[5]。最近的研究結果表明：采用高壓輔助酶解有利于促進骨中營養物質的溶出[6]，這為畜禽骨的進一步利用奠定了堅實的基礎[7]。肉味香精是具有肉香味特征的多種香味物質的混合物，廣泛地應用于方便面、米線、膨化休閑食品及熟肉制品中[8]。近年來，隨著食品工業的蓬勃發展，肉味香精的需求量逐漸增大，國內外對肉味香精的研究也逐漸成為呈味物質開發的熱點[9]。

目前，已經有通過美拉德反應制備肉味香精的相關報道。胡勝梅[10]以豬肉酶解液、植物水解蛋白、辛香料等為原料制備了肉味香精。武彥文等[11]以豆粕粉等物質為原料，通過美拉德反應制備了肉味香精。李瓊等[12]以豬骨素等物質為原料制備了天然肉味香精。周曉茹等[13]以豬脂、氨基酸、糖類物質等為原料制備了肉味香精前提物質。齊景凱等[14]以牛骨蛋白質水解液、氨基酸、糖類物質等為原料制備了肉味香精。但近年來，采用微骨粉酶解液反應制備肉味香精的研究報道較少。為了進一步提高畜禽及魚骨中蛋白質的利用價值，為畜禽及魚骨在食品加工中的綜合利用提供了理論依據，本文探討了利用微骨粉酶解液反應制備肉味香精的工藝。

1　材料與方法

1.1　儀器與材料

1.1.1實驗設備

THZ-82型水浴恒溫振蕩器常德澳華儀器有限公司；LXJ-IIB型離心機上海安亭科學儀器廠；101型電熱鼓風干燥箱、SHB-Ⅲ型循環水式多用真空泵北京科偉永興儀器有限公司； LM-02AF22型高壓鍋珠海雙喜電器股份有限公司；IKA RV8型旋轉蒸發儀上海圣科儀器設備有限公司。

1.1.2實驗材料

木瓜蛋白酶(5×106U/g)北京奧博星生物技術有限責任公司；木糖成都市科龍化工試劑廠；葡萄糖、蔗糖成都金山化學試劑有限公司；風味蛋白酶萬達食品添加劑總店。

1.2　實驗方法

1.2.1微骨粉及其酶解液的制備

參考文獻[6]中的微骨粉制備方法制備微骨粉。稱取7.5 g微骨粉，加酶10%的風味蛋白酶、125 mL(3∶50)水，在59.6 ℃恒溫水浴振蕩鍋中酶解5.8 h。靜置至室溫，先用濾紙對酶解液進行過濾，再用真空泵抽濾。

1.2.2微骨粉酶解液的感官評價

邀請6位經過培訓的感官評價員，對酶解液的酸味、甜味、苦味、鮮味、醇厚感、焦糊味及肉香味進行感官評分。將美拉德反應液稀釋至100 mL，每位感官評價員每次取1 mL 滴入口中，進行風味評價，感官評價標準見表1。

表1　感官評價標準Table 1 Standard of sensory evaluation

1.2.3微骨粉酶解液反應單因素實驗

1.2.3.1微骨粉酶解液反應時間對實驗的影響

取微骨粉酶解液100 mL，按糖與游離氨基氮摩爾比(糖氨比)1∶1加入木糖，在120 ℃條件下進行熱反應。熱反應進行時間分別為50，60，70，80，90 min，將熱反應后的剩余溶液稀釋至100 mL，對酶解液的酸味、甜味、苦味、鮮味、醇厚感、焦糊味、肉香味進行評分。

1.2.3.2微骨粉酶解液反應糖氨比對實驗的影響

取微骨粉酶解液100 mL，按糖氨比0.8，0.9，1，1.1，1.2加入木糖，在120 ℃條件下進行70 min熱反應，將熱反應后的剩余溶液稀釋至100 mL，對酶解液的酸味、甜味、苦味、鮮味、醇厚感、焦糊味、肉香味進行評分。

1.2.3.3微骨粉酶解液反應溫度對實驗的影響

取微骨粉酶解液100 mL，按糖氨比1∶1加入木糖，分別在110，115，120，125，130 ℃條件下進行70 min熱反應，將熱反應后的剩余溶液稀釋至100 mL，對酶解液的酸味、甜味、苦味、鮮味、醇厚感、焦糊味、肉香味進行評分。

1.2.4優化實驗

在單因素實驗基礎上，以肉味值和醇厚感為響應值，選取微骨粉酶解液反應時間、糖氨比和反應溫度為影響因子，采用3因素5水平、5中心的中心旋轉設計響應面法，對微骨粉酶解液反應制備肉味香精工藝進行優化。各實驗因素及水平見表2。

表2　優化實驗因素及水平Table 2 Factors and levels of optimal experiments

1.2.5數據分析

利用Excel 2016對數據進行統計分析并繪圖。利用SAS 9.0進行響應面實驗方案設計，并對實驗結果進行擬合優化。

2　結果與討論

2.1　蒸發溫度及酶解液用量確定

2.1.1蒸發溫度

美拉德反應是制備肉類呈味物質的常用方法，常見的反應溫度為100～140 ℃。酶解液在美拉德反應過程中會有水分蒸發，選擇合適的蒸發溫度有利于確保美拉德反應的進行。為了確定酶解液的水分蒸發溫度，以水分殘留量為指標，對相同體積酶解液在不同溫度下的水分蒸發量進行比較，所得結果見圖1。

圖1　反應溫度對美拉德反應效果的影響Fig.1 Effect of reaction temperature on the result of Maillard reaction

由圖1可知，隨著蒸發溫度增加，酶解液的蒸發時間呈縮短趨勢。當反應溫度為120 ℃時，180 min可使酶解液的水分蒸發量趨于穩定；當反應溫度為130 ℃時，90 min可使酶解液的水分蒸發完；當反應溫度為140 ℃時，50 min可使酶解液水分蒸發完。

由于美拉德反應過程需要一定的時間[16]。酶解液中的水分過快蒸發，會縮短反應時間，導致呈味物質產生量不足，甚至會出現較重的焦糊味；酶解液中水分蒸發量過慢，容易導致整個反應過程時間長，不利于工業化應用。比較圖1中100，120，130，140 ℃的蒸發溫度下酶解液的水分殘留量可知，蒸發溫度為120 ℃時的水分蒸發速度較合適，可以為美拉德反應提供一定的時間。因此，在后續的實驗中，選擇酶解液蒸發溫度為120 ℃。

2.1.2酶解液用量

為了分析酶解液用量對水分蒸發速率的影響，取酶解液體積分別為100，200，300 mL，在120 ℃條件下，以反應液的水分殘留量為指標，對水分蒸發情況進行分析，所得結果見圖2。

圖2　酶解液用量對美拉德反應效果的影響Fig.2 Effect of enzymatic hydrolysate dosage on the result of Maillard reaction

由圖2可知，隨著酶解液用量增加，酶解液的蒸發速率呈減小趨勢。當反應時間為20 min時，100，200，300 mL酶解液的水分殘留量分別為65%，70%，75%；當反應時間為40 min時，100，200，300mL酶解液的水分殘留量分別為30%，40%，50%。

由于美拉德反應過程會受到水分活度的影響，水分含量較低時容易發生美拉德反應[17]。通過比較圖2中相同時間下不同體積酶解液的水分蒸發量可知，酶解液的用量增大會導致反應時間增長。比較圖2中100，200，300 mL酶解液的水分殘留量可知，酶解液體積為100 mL時，酶解液的水分蒸發速率較快。從控制反應速率和反應效率考慮，酶解液體積為100 mL較適合美拉德反應需要。因此，在后續的實驗中，酶解液用量取100 mL。

2.2　糖的種類對反應效果的影響

為了確定糖的種類對反應效果的影響，以反應液的不同風味為評價指標，對添加不同糖的酶解液，在不同反應時間下的感官品質進行比較，所得結果見圖3。

圖3　糖的種類對美拉德反應效果的影響Fig.3 Effect of sugar category on the result of Maillard reaction

由圖3可知，添加木糖的酶解液隨反應時間增加，肉香味呈先增長后降低的趨勢，在70 min時達到最大值3.5；添加葡萄糖的酶解液隨反應時間增加，肉香味呈先增長后降低的趨勢，在50 min時肉香味達到最大值2.5；添加蔗糖的酶解液隨反應時間增長，肉香味呈逐漸降低的趨勢。

糖類物質是美拉德反應呈味的關鍵物質之一，直接影響反應產物的性質及結構[18]。還原糖更易于發生美拉德反應，而且五碳糖的美拉德反應速率是六碳糖的10倍[19]。木糖是五碳糖，葡萄糖是六碳糖，蔗糖是非還原糖。這可能是導致圖3中添加木糖的酶解液反應產生肉香味的最大值較其他糖高的主要原因。此外，通過比較圖3中各種糖類物質反應后產生的焦糊味、苦味以及酸味、鮮味、甜味及醇厚感可知，添加木糖更有利于酶解液通過美拉德反應呈香。因此，在后續的實驗中選擇木糖為糖源。

2.3　酶解液與木糖美拉德反應工藝優化

在前期確定酶解液蒸發溫度、酶解液用量及糖種類的基礎上，為了進一步獲得更優的采用酶解液通過美拉德反應制備肉味香精工藝，在建立反應時間、木糖濃度及反應溫度對美拉德反應效果影響的基礎上，采用響應面法對酶解液與木糖的美拉德反應工藝進行優化。

2.3.1反應時間對美拉德反應呈味效果的影響

反應時間對酶解液美拉德反應呈味效果的影響見圖4。

圖4　反應時間對肉味香精風味的影響Fig.4 Effect of reaction time on the flavor of meat flavor

由圖4可知，隨著反應時間的增加，反應產物的肉香味呈現先增加而后降低的趨勢。當反應時間為70 min時，所得反應產物的肉香味高于其他反應時間。結合圖4中反應產物的酸味、焦糊味、醇厚感、苦味隨反應溫度的增加而增加，鮮味和甜味隨反應溫度的增加而降低的實驗結果，在優化實驗中，應以60 min和80 min分別作為反應時間的上限值和下限值。

美拉德反應是化學反應過程，而且是在高溫下進行的。隨著反應時間增加，在高溫下會有更多的游離氨基與糖分子中的羰基發生化學反應，進而在生成一些醛酮類呈味物質的同時，還會生成一些大分子化合物。這些大分子化合物會產生一些負面的呈味效果。這可能是圖4中，隨著反應時間增加，反應產物的肉香味呈現先增加后降低，苦味、焦糊味、醇厚感及酸味增加，而鮮味和甜味呈現下降趨勢的主要原因。

2.3.2木糖濃度對美拉德反應呈味效果的影響

木糖濃度對美拉德反應呈味效果的影響見圖5。

圖5　木糖濃度對肉味香精風味的影響Fig.5 Effects of xylose concentration on the flavor of meat flavor

為了便于評價糖濃度對美拉德反應效果的影響，用糖濃度與酶解液中游離氨基的摩爾比(糖氨比)表征糖濃度。糖氨比越高，木糖濃度越大。由圖5可知，隨著木糖濃度增加，產物的肉香味呈現先增加而后降低的趨勢。當糖氨比為1時，所得產物的肉香味高于其他糖氨比。產物的鮮味變化類似肉香味，產物的其他風味受木糖濃度的影響較小。因此，在優化實驗中，以0.9和1.1分別作為木糖濃度上限值和下限值。

美拉德反應中起關鍵呈味效果的因素是游離氨基氮與糖分子中的羰基。在控制糖氨比對反應產物呈味效果影響時，由于保持了相同的反應時間和反應溫度條件，所以影響反應產物呈味效果的關鍵因素只有木糖和酶解液中游離氨基氮的摩爾比。這可能是導致圖5中反應產物的肉味和鮮味隨糖濃度與酶解液中游離氨基的摩爾比呈現先增加而后降低，反應產物的其他風味物質的變化相對較弱的原因。

2.3.3反應溫度對美拉德反應呈味效果的影響

反應溫度對美拉德反應呈味效果的影響見圖6。

圖6　反應溫度對肉味香精風味的影響Fig.6 Effect of reaction temperature on the flavor of meat flavor

由圖6可知，隨著反應溫度升高，產物的肉香味呈現先增加而后降低的趨勢。當反應溫度為120 ℃時，所得產物的肉香味高于其他反應溫度；反應溫度為115 ℃和125 ℃時，所得產物的肉香味相似。反應產物的甜味、鮮味及醇厚感的變化趨勢同肉香味。結合反應產物的酸味、焦糊味及苦味隨反應時間增加而增加的結果，在優化試驗中，選擇116 ℃和123 ℃分別作為反應溫度的上限值和下限值。

溫度是影響美拉德反應產物呈味效果的重要因素之一，美拉德反應速度隨反應溫度的上升而加快[20]。在低溫條件下，美拉德反應緩慢，呈味物質生成量較少；而在高溫條件下，美拉德反應迅速，生成更多的大分子化合物。這可能是導致圖6中隨著反應溫度升高，產物的肉香味、甜味、鮮味及醇厚感呈現先增加而后降低，產物的酸味、焦糊味及苦味隨反應時間增加而增加的主要原因。

2.4　酶解液美拉德反應工藝優化

2.4.1實驗方案及優化結果

根據單因素實驗結果，選擇反應時間60 min和80 min、糖氨比0.9和1.1、反應溫度116 ℃和123 ℃分別作為優化限制，以反應產物的酸味、甜味、苦味、鮮味、醇厚感、焦糊味及肉香味為響應值，對微骨粉酶解液反應制備肉味香精工藝進行優化。優化實驗方案及實驗結果見表3。

表3　優化方案及結果Table 3 Optimization program and results

2.4.2擬合顯著性分析

對表3中所得實驗結果進行顯著性分析，所得分析結果見表4。

表4　擬合顯著性分析Table 4 Fitting significance analysis

注：表中X1代表反應時間，min；X2代表糖氨比；X3代表反應溫度，℃。

通過比較表4中各響應值的主模型和失擬項的P值發現，醇厚感的P主模型=0.0409<0.05，P失擬項=0.3739>0.05；肉香味的P主模型=0.0041<0.05，P失擬項=0.8379>0.05。結合醇厚感和肉香味的擬合相關系數R2分別為0.90,0.96可知，所得醇厚感和肉香味的擬合模型(式1、式2)具有較好的顯著性，能較好地反映反應時間、糖氨比和反應溫度與產物的醇厚感及肉香味之間的關系。因此，為了進一步驗證所得模型的可靠性，后期將重點對醇厚感和肉香味的擬合模型進行分析和驗證。

比較表4中各項對醇厚感及肉香味的P值可知，對于醇厚感，PX22=0.0083<0.01；對于肉香味，PX2=0.0007<0.05，PX1X2=0.0297<0.05，PX1X3=0.0313<0.05，PX22=0.001<0.01。由此可見，在一次項方面，糖氨比(X2)對產物的肉香味有顯著影響；在二次項方面，糖氨比(X2)對產物的肉香味和醇厚感均有顯著影響；在交互性方面，反應時間(X1)、糖氨比(X2)、反應溫度(X3)的交互性均對產物的肉香味有顯著影響。因此，糖氨比(X2)是影響產物的肉香味及醇厚感的關鍵因素，應重點控制；而反應時間(X1)和反應溫度(X3)對產物的肉香味有一定影響，可作為次要控制因素。

醇厚感=-383.281+1.259501X1+108.8251X2+4.849466X3-0.001042X12-0.463389X1X2-0.005664X1X3-41.6667X22+0.043329 X2X3-0.018707X32；

(式1)

肉香味=-209.503-0.72368X1+165.5646X2+2.647882X3-0.001528X12-0.400889X1X2+0.011274X1X3-46.52778X22-0.431112X2X3-0.012472X32。

(式2)

注：式中X1代表反應時間，min；X2代表糖氨比；X3代表反應溫度，℃。

2.4.3擬合模型可靠性驗證

為了進一步驗證所得醇厚感擬合模型(式1)和肉香味擬合模型(式2)的可靠性，以確保優化結果的可靠性，隨機取6組工藝進行實驗驗證。對式(1)計算的醇厚感與實際測定的醇厚感，式(2)計算的肉香味與實際測定的肉香味進行比較，所得結果見表5。

表5　擬合模型可靠性驗證Table 5 Fitting model reliability verification

由表5可知，醇厚感和肉香味的相對誤差均小于15%。由此可知，所得擬合模型具有一定可靠性，可用于微骨粉酶解液反應制備肉味香精最優工藝的優化。

2.4.4工藝優化

根據反應產物的醇厚感及肉香味的擬合模型，以產物的主體肉香味及醇厚感為共同最大優化目標，對微骨粉酶解液反應制備肉味香精的最優工藝進行優化，所得最優工藝為反應時間84 min、糖氨比0.859、反應溫度124.4 ℃。此時對應產物的肉香味及醇厚感值分別為6.05和3.67。以反應時間、糖氨比和反應溫度的最優工藝參數為基準，所得各因素對醇厚感及肉香味的響應面見圖7。

圖7　微骨粉酶解液反應制備肉味香精響應面圖Fig.7 Response surface of meat flavor prepared by microbone meal enzymolysis hydrolysate

為了進一步驗證所得最優工藝的可靠性，以反應時間84 min、糖氨比0.859、反應溫度124.4 ℃為工藝條件制備反應產物，并對產物的肉香味及醇厚感進行測定，所得肉香味為(5.92±0.49)分、醇厚感為(3.5±0.5)分。肉香味及醇厚感的實測值與預測值之間的相對誤差分別為2.20%和4.63%，均小于5%，預測結果與實際測定結果較吻合。因此，最終確定反應時間84 min、糖氨比0.859、反應溫度124.4 ℃為微骨粉酶解液制備肉味香精的最優工藝條件。

3　結論

通過分析微骨粉酶解液的蒸發溫度、酶解液用量及糖種類對美拉德反應產物呈味效果的影響，發現采用木糖、酶解液用量100 mL、蒸發溫度120 ℃的反應條件更有利于促進酶解液呈味。在此基礎上，對反應溫度、糖氨比及反應時間進行單因素實驗，確定了各因素的優化限值，通過響應面法設計酶解液與木糖的優化實驗方案并對實驗結果進行擬合分析，發現產物的醇厚感、肉香味與各因素建立的擬合模型具有較好的可靠性。在實驗驗證擬合模型可靠性基礎上，以肉香味和醇厚感值最大為優化目標，對反應工藝進行優化，得出反應時間84 min、糖氨比0.859、反應溫度124.4 ℃時，反應產物的肉香味及醇厚感值最高，分別為6.05，3.67。進一步實測確認最優工藝參數，所得產物的實測肉香味及醇厚感值與預測值相對誤差均小于5%。因此，最終確定微骨粉酶解液通過美拉德反應制備肉味香精的最優工藝條件為反應時間84 min、糖氨比0.85、反應溫度124 ℃。

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