17例病毒性肺炎老年患者的臨床特點及甲型H1N1流感病毒分子特征

葛以躍 譚焰 陳晨 吳濤 朱小娟 趙康辰 王麗 谷偉 崔侖標

210009南京,衛生部腸道病原微生物重點實驗室江蘇省疾病預防控制中心(葛以躍、吳濤、朱小娟、趙康辰、崔侖標)；210006南京醫科大學附屬南京醫院呼吸科(譚焰、陳晨、王麗、谷偉)

流感病毒分為甲、乙、丙3種類型,其中甲型流感病毒的宿主最為廣泛,其抗原變異率也最高,容易引起大流行。2009年初,一種新型甲型H1N1流感病毒(pandemic H1N1/09 virus)首先在墨西哥發現,而后在全球不斷蔓延[1],目前已成為季節性流感病毒的一部分,嚴重威脅著人類健康[2]。

老年人的各個器官生理功能逐步下降,如同時伴有慢性基礎性疾病,則更容易感染流感病毒,而且很容易發展為肺炎.研究表明,肺炎是流感患者病情加重和死亡的重要原因[3]。國家流感中心流感監測結果顯示,自2017年底至2018年初,我國流感發病率較往年同期明顯升高,以甲型H1N1流感和乙型流感的流行為主,伴隨著部分甲型H3N2流感的流行。與往年相比,乙型流感病毒的Yamagata型顯著增多,使得現有三價疫苗對該病毒亞型失去預防作用。對于此次流行的甲型H1N1流感病毒,尚未見病原學特征顯著改變的相關報道,進一步研究其病原分子特征對于疾病的預防和診治具有重要意義。本研究對南京市第一醫院呼吸科2018年1～3月份收治的,確診為甲型H1N1流感病毒性肺炎的老年患者的臨床資料和流感病毒病原學進行分析,探討老年人甲型H1N1流感病毒性肺炎的臨床特點及本流行季的病毒分子特征,為老年流感的防治提供依據,提高臨床診治效果。

1 材料與方法

1.1 研究對象在2018年1～3月份期間,收集在南京市第一醫院呼吸科住院的有流感樣癥狀的老年(≥60歲)肺炎患者40例,最終確診為甲型H1N1流感病毒感染者共17例。入選標準：(1)出現過流感樣癥狀；(2)病程中經胸部CT或胸片檢查證實肺炎存在；(3)患者痰標本或鼻咽拭子標本甲型H1N1流感病毒核酸檢測陽性。病例的臨床資料采用統一標準的數據采集表進行收集。本研究獲得南京第一醫院倫理委員會審查通過,標本采集獲得患者或家屬知情同意。

1.2 儀器與試劑全自動核酸提取儀及其配套試劑(EX-DNA/RNA病毒)購自西安天隆科技有限公司；實時熒光定量PCR儀(7900HT)購自美國Life Technologies公司；PrimeScrip RT reagent Kit(Perfect Real Time)、PrimeScript Reverse Transcriptase和 LA Taq購自日本 TaKaRa公司；Nextera XT Library Preparation Kit和MiSeq Reagent Kit v3(600 cycles)購自美國Illumina公司。

1.3 方法

1.3.1 標本采集與病毒核酸檢測：采集目標患者的痰標本或鼻咽拭子標本,-80℃冰箱保存。參照全自動核酸提取儀和病毒核酸提取試劑盒使用說明書提取病毒總核酸。采用One Step PrimeScrip RTPCR Kit通過Real-time RT-PCR法[4-5]檢測甲型流感病毒及其亞型(季節性H3N2和甲型H1N1流感病毒)。同時采用Real-time PCR/RT-PCR法對每一份樣本的28種常見呼吸道病原進行檢測,觀察是否存在合并感染。

1.3.2 病毒全基因組擴增和高通量測序：采用Primescript Reverse Transcriptase和甲型流感病毒8節段通用逆轉錄引物進行反轉錄反應,制備的cDNA進一步采用LA Taq和一對甲型流感病毒通用引物擴增流感病毒全基因組,純化并回收PCR產物。采用Qubit 2.0熒光劑對PCR產物進行定量,而后作為模板制備測序文庫,具體操作按Nextera XT Library Preparation Kit說明書進行。將制備好的文庫加入MiSeq測序樣品孔,按2×300 bp進行末端配對測序。

1.4 測序數據分析測序產生的fastq原始數據采用生物信息學綜合分析工具CLC Genomic Workbench 7.5.1進行處理和分析。從全球流感共享數據庫(GISAID)下載甲型H1N1流感病毒參考序列,采用MEGA 6.0軟件對病毒進化進行分析,通過鄰接法(Neighbor-joining)構建系統發生樹,重復抽樣1 000次(Bootstrap=1 000)對進化樹進行驗證。同時通過對氨基酸序列比對進一步分析病毒的抗原位點、毒力位點和耐藥位點的變異情況。

1.5 統計學方法計量資料采用±s表示,計數資料采用構成比來表示,計量資料采用t檢驗,計數資料采用χ2檢驗或Fisher精確概率法,檢驗水準為0.05。

2 結果

2.1 老年甲型H1N1流感病毒性肺炎患者的一般資料在有流感樣癥狀的40例老年(≥60歲)肺炎患者中,通過病毒核酸檢測,最終確診為甲型H1N1流感病毒感染的共有17例。如表1所示：在17例甲型H1N1流感患者中,7例存在合并感染,比例達41.2%,其中合并單純皰疹病毒感染2例,合并鼻病毒、流感嗜血桿菌、肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌和EB病毒感染的各1例?；颊咂骄挲g為73.8±10.8歲,9例≥75歲(52.9%),其中男性占總例數的57.9%。重癥與危重癥病例的比例為0.89∶1。所有患者至少合并1種基礎性疾病,慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary diseases,COPD)、高血壓和腦血管病是最為常見的基礎病,合并比例分別為52.9%、52.9%和35.3%。存在1種以上基礎病的患者比例達70.1%,存在重要基礎性疾病(冠心病、充血性心力衰竭、慢性腎功能不全、惡性腫瘤、肝硬化和免疫抑制)的比例為41.2%。在本組老年人群中,流感疫苗的接種率為0%。

表1 患者一般資料和基礎性疾病合并情況Tab.1 General information and the existence of underlying diseases of the patients

2.2 老年甲型H1N1流感病毒性肺炎患者的臨床特征和實驗室檢查在甲型H1N1流感病毒性肺炎的老年患者中,呼吸系統癥狀和發熱是最為主要的臨床表現。88.2%的患者存在發熱,最高體溫為38.38±0.84℃,其中高熱(≥39℃)患者所占比例為41.2%?？人?、咽痛、呼吸困難的比例分別為100%、11.8%和76.5%。23.5%的患者同時伴有消化道癥狀?；颊叩陌准毎嫈禐?6.25±2.77)×109/L,以正常和降低為主。47.1%的患者伴有低鈉血癥,其中2例(11.8%)屬于重度(＜125 mmol/L)。部分患者伴有肝功能異常,谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶和總膽紅素異常的比例分別為11.8%、17.6%和11.8%。94.1%的患者均伴有乳酸脫氫酶的增高。胸部影像表現為雙肺病變的比例為76.5%,其中危重癥患者雙肺病變的比例高于重癥患者,但差異無統計學意義(P＞0.05)。詳細結果見表2。

2.3 氨基酸位點分析

2.3.1 抗原位點和宿主特異性位點：與疫苗株相比,所測毒株HA蛋白10處氨基酸變異中有9處發生在HA1上,其中3處發生在抗原位點上(Ca、Cb和Sa各1個),分別為H138Y、S74R和S164T,具體變異情況見表3。受體結合位點(Receptor-binding site,RBS)是流感病毒宿主特異性的一個重要決定因素,本研究所有毒株的HA蛋白未發生RBS的氨基酸變異。除了RBS外,PB2中的一些位點在宿主特異性中也發揮重要作用,通過比較發現,所測毒株PB2蛋白的宿主特異性位點均與疫苗株相同,為590S、591R、627E、701D 和714S。

2.3.2 潛在糖基化位點：疫苗株A/Michigan/45/2015的HA蛋白有9個潛在糖基化位點(10NNST、11NST、23NVT、87NGT、162NQS、276NTT、287NTS、481NGT和540NGS),除了A/Nanjing/2018031/2018的潛在糖基化位點與疫苗株完全相同外,其余8株病毒HA蛋白的162位均為162NQT,但同樣為N-糖基化位點的保守序列模式,所以未發生潛在糖基化位點數量上的增減。

2.3.3 毒力位點和耐藥位點：與疫苗株相同,所有毒株的HA裂解位點均為為PSIQSR↓GLFGA,只含有一個堿性氨基酸,為非高致病力特征。除了HA裂解位點外,流感病毒的毒力位點分布于多個節段上。通過分析發現,所測毒株的相關毒力位點特征為：222D(HA,H1 numbering)、139T(M1)、215 A(M1)、42S(NS1)、92D(NS1)、36 A(PA)、353 K(PA)、99H(PB1)、368I(PB1)、89 V(PB2)和 357H(PB2),與疫苗株保持一致,未發生毒力改變。在耐藥方面,A/Nanjing/2018029/2018毒株的NA發生了H275Y(N1 numbering)變異,提示可能對流感病毒神經氨酸酶抑制劑類藥物耐藥。

表2 老年甲型H1N1流感病毒性肺炎患者的臨床癥狀和實驗室檢查Tab.2 Clinical features and laboratory examination of the influenza A(H1N1)viral pneumonia in the elderly

表3 甲型H1N1病毒HA蛋白氨基酸位點變異情況Tab.3 Variation of HA amino acid sites of the influenza A(H1N1)viruses

2.4 甲型H1N1流感病毒HA基因進化分析在17例甲型H1N1流感標本中,共有9例測序獲得了病毒全基因組序列,所有毒株的8個基因節段平均測序深度為140×～47098×。HA基因進化分析結果表明,與疫苗株A/Michigan/45/2015相似,本研究所有毒株的HA基因均屬于甲型H1N1病毒6B組6B.1亞組,以S84 N、S162 N和I216T氨基酸替換為特征。此外,本研究所有毒株還發生了S74R和I295 V氨基酸變異。除了A/Nanjing/2018031/2018之外,所有毒株還發生了S164T變異。各毒株之間的HA核苷酸同源性為98.1% ～100%,氨基酸同源性為97.7%～100%。所測毒株HA核苷酸與疫苗株的同源性為97.8% ～98.9%,氨基酸同源性為97.5%～99.6%。HA基因進化分析情況詳見圖1。

注：▲本次測序毒株；●WHO推薦疫苗株圖1 甲型H1N1流感病毒HA基因系統發生樹Note： ▲Strains sequenced in this study；●WHO recommended vaccine strainsFig.1 Phylogenetic tree of the HA gene of influenza A(H1N1)viruses

3 討論

流感病毒是引起老年肺炎的主要病毒之一,研究表明,對于甲型H1N1流感而言,老年病例的病死率顯著高于其他年齡段[6]。因此,了解老年甲型H1N1流感病毒性肺炎的臨床特點,進一步分析其在南京地區老年人中的分子特征,對于臨床診斷、疾病預防、針對性用藥以及避免濫用抗生素均具有重要意義。

劉曉偉等[7]分析了86例以青壯年為主的甲型H1Nl流感病毒性肺炎患者的臨床資料,只有15.1%的患者存在基礎疾病。本研究發現,所有入選的老年患者至少合并有1種基礎性疾病,存在1種或以上嚴重基礎性疾病的患者比例達41.2%。高齡和基礎病的存在直接影響到甲型流感的嚴重程度和預后,增加了臨床治療的難度[8]?！吨袊宰枞苑渭膊≡\治指南(2013年修訂版)》指出,使用流感疫苗可以減少COPD患者的嚴重程度和死亡率,說明COPD患者很容易發生流感感染并導致死亡,在本研究中,老年流感肺炎患者的COPD合并比例高達52.9%,然而流感疫苗的接種率卻為0%,所以,老年COPD患者更應該定期接種流感疫苗以預防感染。通過對臨床表現分析發現,發熱和呼吸系統癥狀最為突出,與已有報道一致[8]。23.5%的患者伴有消化道癥狀,低于美國所報道的比例[9],但高于國內報道的比例[10]。在實驗室檢查方面,超過90%的患者出現乳酸脫氫酶增高,可能與肺臟和心肌的損害有關。胸部影像表現以雙肺病變為主,與以往報道一致[11],危重癥患者雙肺病變的比例高于重癥患者,然而差異無統計學意義。本研究的樣本量較小,部分結論還需要進行大樣本研究進一步證實。

二代測序技術在流感病毒的鑒定及全基因組序列分析方面具有其獨特的優勢[12],與WHO推薦疫苗株A/Michigan/45/2015相同,本研究所測病毒的HA基因均屬于甲型H1N1病毒的6B組6B.1亞組?？乖稽c的變異直接影響到流感病毒的抗原漂移,與疫苗株相比,本研究所測病毒的HA蛋白發生了10處氨基酸變異,有3處發生在抗原位點上,分別為Ca抗原的H138Y變異、Cb抗原的S74R變異和Sa抗原的S164T變異,這些變異是否會影響到疫苗株的保護效果還有待進一步研究。糖基化位點的主要作用是穩定HA結構,防止HA水解的同時還可以阻礙抗體的識別,本研究中雖然大部分病毒發生了162NQS到162NQT的改變,但糖基化位點的數量并未發生增減。由于甲型H1N1病毒對烷胺類抗病毒藥物普遍耐藥,所以病毒是否發生對NA抑制劑的耐藥尤為重要,A/Nanjing/2018029/2018毒株發生了H275Y變異,提示可能對流感病毒NA抑制劑類藥物耐藥從而影響治療效果,臨床資料顯示,在治療過程中,該患者的最高體溫達40度,在所有患者中最高,乳酸脫氫酶的水平達1 000 U/L,C反應蛋白達122 mg/L,而且發生了呼吸衰竭,為危重癥病例,推測可能與NA抑制劑的治療效果不佳有一定關系。

雖然目前甲型H1N1流感未發生再次大流行,但是對于老年人特別是未接種流感疫苗者,很容易發生流感并發展為肺炎,預后較差。老年甲型H1N1流感病毒性肺炎患者多合并基礎疾病,容易產生合并感染,臨床工作者在診治過程中需要密切關注這些特點。隨著群體免疫壓力和抗病毒藥物壓力的選擇,甲型H1N1病毒可能在今后出現新的變異導致其抗原性和耐藥性發生變化,需要對病毒的分子特征持續監測,為疾病預防和臨床抗病毒治療提供依據。

利益沖突無