上海市2011—2017年風疹病毒基因特征分析

楊玉穎 王靜 唐偉 朱貞 李云逸 王嘉瑜 李崇山 劉暢

200025上海交通大學醫學院免疫學與微生物學系(楊玉穎、劉暢)；200336上海市疾病預防控制中心病原生物檢定所(楊玉穎、王靜、唐偉、李云逸、王嘉瑜、李崇山)；102206北京,中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所(朱貞)

風疹(rubella)是一種常見的發熱出疹性疾病,其病因為風疹病毒(rubella virus,RV)感染。RV是披膜病毒科風疹病毒屬的唯一成員,雖然RV只有一個血清型,卻有多個基因型。世界衛生組織(world health organization,WHO)推薦使用E1蛋白編碼區739個核苷酸(nucleotide,nt)(nt8731～9469),作為進行RV分子流行病學研究的區域[1]。根據該739nt片段核苷酸最小差異為8% ～10%的原則,RV在遺傳進化樹上分為2個分支(Clade 1和Clade 2)。目前在2個分支內共劃分為13個基因型,其中 12 個為正式基因型(1B、1C、1D、1E、1F、1G、1H、1I、1J、2A、2B、2C),另外一個為臨時基因型(1a)[2]。

此前有報道2B基因型RV于2011年在上海流行[3]。為研究2B基因型RV是否依然在本市存在流行及其基因特征,完善上海市風疹分子流行病學監測基線數據,選擇2011—2017年上海市報告疑似麻疹/風疹病例中經實驗室診斷排除麻疹,確定為風疹病例所對應咽拭子標本進行RV分離和鑒定,并對病毒E1基因擴增測序進行基因特征分析。

1 材料與方法

1.1 標本采集與運送所有病例信息均來自中國疾病預防控制信息系統(China Information System for Disease Control and Prevention,CISDCP)和麻疹監測信息報告管理系統(Measles Surveillance System,MSS)。本研究中所用的所有病例標本均采集自符合《上海市麻疹風疹監測方案》中所規定病例定義的疑似麻疹或風疹病例,由上海市轄區范圍內各醫院或各區疾病控制中心采集、運送。2014年起由各麻疹風疹網絡實驗室進行核酸檢測,檢測結果陽性者再送上海市疾病預防控制中心進行麻疹病毒分離。同時采集血清標本由各麻疹風疹網絡實驗室進行IgM抗體檢測。上海市疾病預防控制中心定期對結果進行復核。

1.2 病毒分離、核酸提取及RV鑒定按照《中國麻疹/風疹網絡實驗室標準操作規程(2015版)》操作,實驗所用Vero/SLAM細胞由中國疾病控制中心國家麻疹/風疹實驗室提供。使用 QIAamp Viral RNA Mini Kit(Qiagen,德國)從第3代病毒培養物中提取病毒RNA,具體操作參照試劑盒說明書。選擇引物RV11-RV12鑒定RV[4-5],使用PrimeScript One Step RT-PCR kit(Takara,中國)擴增片段185 bp。擴增產物進行毛細管電泳,陽性標本進行后續實驗。

1.3 E1基因的擴增與測定從GenBank中下載RV基因組全序列,并據此設計E1基因引物：正義鏈為 F1：5′-TCGTCCTGCTGGTCCCGTGG-3′,F2：5′-CCCCACCGACACCGTGATGA-3′,F3： 5′-GTGGGTC ACGCCTGTCATAG-3′；反義鏈為 R1：5′-GTTGTCCGT GCGGCGTGTTG-3′,R2：5′-GCGGTGACGAACTTCC CAGG-3′,以及文獻引物 RUB3：5′-TTTT TTTTTTT TTTTTTTCTATACAGCAACAGGTGC-3′[6]。 使用 Sup erscriptⅢ Platinum Taq High Fidelity kit(Invitrogen,美國)擴增病毒E1基因的全序列(nt8136～9780)：55℃逆轉錄30 min,94℃變性2 min,94℃ 10 s、55℃15 s、68℃ 1min,40個循環后,68℃延伸5 min。擴增產物經毛細管電泳鑒定,陽性產物送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.4 生物信息學分析使用Sequencher 5.4.6軟件(GeneCode,美國)拼接序列,使用Mega 6.0軟件[7]進行序列比對,采用鄰接法(neighbor-joining method,NJ)構建基因親緣性關系樹,進化樹進行了1 000次重復構建；使用BioEdit Sequence Alignment Editor 7.0.9.0軟件[8]分析核苷酸和氨基酸(amino acid,aa)序列同源性及變異情況。

2 結果

2.1 2011—2017年上海市風疹監測流行病學信息2011—2017年上海市風疹報告發病率為0.01～3.57/10萬,2012年發病率最高,2016—2017年發病率持續下降。全市各區均有病例報告,報告病例數以浦東新區、嘉定區、松江區和閔行區最多。年齡分布以15～39歲青少年和成年人最多。全年均有病例發生,4～6月份發病數最多,其中2015年以1～5月份病例數最多。

2.2 RV的分離鑒定與基因型的確定2011—2017年符合條件咽拭子標本共計684份,病毒分離物經RV11-RV12引物對擴增鑒定,共分離到395株RV,全部為散發病例,且標本均采集自出疹前后5 d內。395株RV分離株均為14歲以上青少年或成年人,無兒童病例,具體信息見表1。經上述3對引物擴增后,共獲得377株RV分離株739nt片段核苷酸序列,基于該片段與WHO各基因型參考株序列構建系統進化樹(圖1)[3]。結果發現,377株RV分離株中109株為1E基因型,且這些分離株與來自中國的參考株(RVi/Shandong.CHN/0.02/)親緣性關系更近(bootstrap值為98)；268株為2B基因 型,其中 RVi/Shanghai.CHN/16.14/6、RVi/Shanghai.CHN/15.16/4、RVi/Shanghai.CHN/19.16/2、RVi/Shanghai.CHN/20.16/和 RVi/Shanghai.CHN/21.16/等5株分離株在2B基因型中成一個獨立小分支。具體基因型鑒定情況見表2。

表1 上海市2011—2017年RV分離株信息匯總Tab.1 Information about RV isolates during 2011-2017 in Shanghai

2.3 核苷酸序列差異及變異位點分析所有1E基因型分離株之間核苷酸序列相差0～22個核苷酸(0% ～3.0%)；與該基因型2株WHO參考株(RVi/Shandong.CHN/0.02/和RVi/Kuala Lumpur.MYS/0.01/)之間的核苷酸序列相差8～29個核苷酸(1.1%～4.0%)。與該基因型中國參考株(RVi/Shandong.CHN/0.02/)相比,所有1E基因型分離株E1基因 739nt片段中共有 4個位點(nt8737、nt8836、nt9160和nt9316)存在完全一致的突變,以上位點突變后的堿基與馬來西亞參考株(RVi/Kuala Lumpur.MYS/0.01/)一致。除RVi/Shanghai.CHN/30.12/2外,其他108株1E基因型分離株在nt9244位點發生T→C的無義突變(圖2)。所有2B基因型RV分離株之間核苷酸序列相差0～48個核苷酸(0% ～6.5%)；與該基因型3株WHO參考株(RVi/Anhui.CHN/0.00/2、RVi/Washington. USA/16.00/和 RVi/TelAviv. ISR/0.68/)之間相差12～48個核苷酸(1.7% ～6.5%),且與美國華盛頓州的WHO參考株(RVi/Washington.USA/16.00/)差異最小。與上述WHO參考株(RVi/Anhui.CHN/0.00/2)相比,所有2B基因型分離株E1基因739nt片段中在 nt9092(Adenine→Guanine,A→G),以及5株成獨立小分支的2B基因型分離株在nt9371(G→A)和nt9387(Thymine→Cytosine,T→C)位點均發生突變,導致所編碼氨基酸的變化(圖2)；此外,與3株WHO參考株相比,所有2B基因型分離株在nt8737位點,以及除5株成獨立小分支外的其他2B基因型分離株在 nt8740、nt8749、nt8770、nt8 977 和 nt9 112 等位點均發生無義突變。

表2 上海市2011—2017年RV分離株基因型鑒定Tab.3 Genotype identification of RV isolates during 2011-2017 in Shanghai

圖1 2011—2017年上海市部分RV分離株與WHO各基因型參考株基于E1基因739nt(nt8731～nt9469)構建的系統進化樹Fig.1 The phylogenetic tree of part of rubella strains isolated during 2011-2017 in Shanghai compared to the WHO reference strains for each genotype based on the 739 nucleotides(nt8731～nt9469)of E1 gene

2.4 氨基酸序列差異及變異位點分析所有1E基因型分離株之間相差0～4個氨基酸殘基(0% ～1.7%),與該基因型2株 WHO參考株(RVi/Shandong.CHN/0.02/和RVi/Kuala Lumpur.MYS/0.01/)之間的氨基酸序列相差0～4個氨基酸殘基(0% ～1.7%)；所有2B基因型RV分離株之間氨基酸序列相差0～5個氨基酸殘基(0% ～2.1%),與該基因型3株WHO參考株(RVi/Anhui.CHN/0.00/2、 RVi/Washington. USA/16.00/和 RVi/TelAviv.ISR/0.68/)之間的氨基酸序列相差0～4個氨基酸殘基(0% ～1.7%),且與美國華盛頓州的WHO參考株(RVi/Washington.USA/16.00/)差異最小。

圖2 2011——2017年上海市部分RV分離株與WHO參考株基于E1基因739nt(nt8731～9469)變異位點分析Fig.2 The nucleotide mutation analysis of part of rubella strains isolated during 2011-2017 in Shanghai compared to the WHO reference strains based on the 739 nucleotides(nt8731～9469)of E1 gene

本研究所有377株RV分離株中發現的核苷酸突變大多為無義突變,并不引起所編碼氨基酸的變化,只有少數幾個位點存在氨基酸突變(圖3)。所有RV分離株在E1蛋白aa279位點均為纈氨酸(Valine,Val279),與1E和2B基因型WHO參考株相比,僅和2B基因型WHO參考株(RVi/Anhui.CHN/0.00/2)不同,該參考株此位點為異亮氨酸(Isoleucine,Ile279),此位點為E1蛋白的抗原表位。除了RVi/Shanghai.CHN/26.11/2之外的所有中國1E基因型RV在aa338位點發生相同突變,由亮氨酸(Leucine,Leu338)突變為苯丙氨酸(Phenylalanine,Phe338),而2B基因型分離株以及其他基因型WHO參考株均未發生改變。同時發現5株成獨立分支的2B基因型分離株在aa372位點發生Val372→Ile372突變,在aa377位點發生 Val377→丙氨酸(Alanine,Ala377)的突變。

圖3 2011—2017年上海市部分RV分離株與WHO參考株基于E1蛋白(aa159～404)氨基酸變異位點分析Fig.3 The amino acid mutation analysis of part of rubella strains isolated during 2011-2017 in Shanghai compared to the WHO reference strains based on the E1 protein(aa159～404)

3 討論

根據WHO所推薦的RV基因分型標準,確定以El蛋白編碼區的739個核苷酸(nt8731～9469,aal59～404)作為靶序列進行基因型劃分和分子流行病學研究[1]。

本研究對上海市2011—2017年報告疑似麻疹風疹病例中分離到的RV進行分子流行病學分析。除2017年外,其余年份均分離到RV。377株RV分離株全部屬于1E基因型或2B基因型,所有1E基因型分離株與來自中國的WHO參考株(RVi/Shandong.CHN/0.02/)親緣性關系更近。李崇山等[3]報道1E基因型是2001—2011年本市RV優勢流行基因型,本研究中1E基因型仍是2011—2013年上海市RV優勢流行基因型,但在2014年則被2B基因型取代,自2015年起未再監測到1E基因型。上述研究發現上海市1E基因型分離株分為兩個進化分支(Cluster A和Cluster B)[3],其中Cluster A中分離株數量較多,且包括2001—2011年多個年份的分離株,但在本次研究中所有1E基因型分離株均屬于Cluster A。朱貞等[10]對2001—2015年中國大陸流行的1E基因型RV分子流行病學研究發現類似的進化結果。上海地區2B基因型RV在2011年首次被發現[3],本次研究再次監測到2B基因型RV在上海的流行,且2012—2016年期間持續存在,并替代1E基因型成為2014—2016年上海市RV優勢流行基因型。

從系統發生樹上發現,5株分離株(RVi/Shanghai.CHN/16.14/6、 RVi/Shanghai.CHN/15.16/4、 RVi/Shanghai.CHN/19.16/2、RVi/Shanghai.CHN/20.16/和RVi/Shanghai.CHN/21.16/)在2B基因型中成一個獨立小分支,并且在aa372和aa377位點發生突變,這兩個位點的突變為這5株分離株獨有,其他分離株和WHO參考株中未發現該突變。研究發現在2015年貴州省的一起風疹暴發中有2株2B基因型RV在aa377位點發生相同突變[9]。經核苷酸序列同源性分析發現,所有268株2B基因型分離株與從美國華盛頓州2000年分離到的WHO參考株(RVi/Washington.USA/16.00)最為接近。除上述5株分離株外的263株2B基因型分離株與上海市之前分離自2011年的3株2B基因型(SH11009、SH11052和SH11106)之間的核苷酸序列同源性達98%以上。經與其他國家或地區的RV比對發現,分離自2011年的4株及2013年的1株RV與中國香港的1株RV(GenBank No.：FJ656218)核苷酸同源性為100%,提示存在跨區域傳播的可能。

本次研究同時發現除1株(RVi/Shanghai.CHN/26.11/2)外的所有中國1E基因型RV E1蛋白aa338位點發生相同突變(Leu338→Phe338),朱貞等人[10]在對我國2003—2007年RV基因特征分析中首次發現中國1E基因型RV在這一位點的獨有突變,之后在浙江省[11]、吉林省[12]等地RV分離株基因特征分析中都相繼發現了相同的突變。但李崇山等人[4]的研究中,上海地區2001年分離到的7株1E基因型RV中有5株未發生這一突變,aa338位點仍為 Leu338,與 WHO 1E基因型(RVi/Kuala Lumpur.MYS/0.01/)及2B基因型參考株相同,說明這一突變可能于2001年前后還未在所有1E基因型RV中發生。由于我市2010年之前的RV樣品量少,故未能擴大檢測范圍確定這一突變的具體時間。通過1E基因型RV比對發現,俄羅斯(2006年)、中國(2007年臺灣,2012年香港)、美國(2008年)以及日本(2010—2011年)的RV分離株中都存在這一位點的突變,其中部分毒株已被證實由中國大陸輸入[13-14]。

截止2015年,除WHO非洲區和東地中海區之外的其他4個區域都確立了消除或控制風疹和CRS的目標,WHO美洲區在2015年宣布阻斷本土RV的傳播,率先實現了消除風疹和CRS的目標。目前,上海市風疹病毒學監測還不夠全面,有待進一步加強監測的力度,為追溯RV的傳染源和傳播鏈以及制定切實有效的風疹疫苗免疫策略提供科學依據。

利益沖突無