HPLC法同時測定煙葉中6種多酚類物質

張啟發 聶瓊 鄒序生 謝瑞 劉云鶴

摘 要：本文建立了一種可同時測定烤煙葉片中綠原酸、咖啡酸、蘆丁、莨菪亭、槲皮素和山奈酚的高效液相色譜（HPLC）檢測方法，并分析了不同煙草雜種F1及其親本中上述多酚的含量。采用甲醇：水=7∶3為提取液，超聲提取30 min，色譜柱為Agilent 5 TC-C18 （250 mm × 4.6 mm，5 μm） ；2%冰乙酸水溶液-甲醇為流動相，梯度洗脫，流速1 ml/min；柱溫30℃；進樣體積10 μl。結果顯示：6種多酚類物質分離效果良好，加樣回收率范圍在95.53%～100.622%（RSD為0.95%～2.285%），穩定性RSD（n=3）為0.13%～1.73%。綠原酸、咖啡酸、蘆丁、莨菪亭、槲皮素和山奈酚的線性范圍在10～600 μg/ml之間，各多酚類物質線性方程相關系數在0.99996～0.99999之間。各材料的綠原酸和蘆丁含量較高，為多酚類物質主要成分，其他多酚物質含量則比較低。雜種F1相對其親本材料在某種多酚含量中表現出一定優勢，VA116 × GDH88綠原酸含量遠遠高于其兩個親本材料，VA116 × TN90蘆丁含量也超越其雙親，而綠原酸含量則低于其親本VA116，Florida301 × GDH94蘆丁含量超越雙親，綠原酸含量則低于其親本GDH94。

關鍵詞：烤煙；HPLC；多酚；綠原酸；蘆丁

中圖分類號：S572

文獻標識碼：A

文章編號：1008-0457（2018）03-0021-06 國際DOI編碼：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2018.03.004

Simultaneous Determination of Six Polyphenols in Flue-cured Tobacco Leaves by HPLC Method

ZHANG Qifa1，2，NIE Qiong1，2*，ZOU Xushen1，2，XIE Rui1，2，LIU Yunhe1，2

（1. College of Agriculture， Guizhou University， Guiyang 550025， Guizhou， China；2. Guizhou Provincial Key Laboratory of Tobacco Quality，Tobacco Research Center of Guizhou University， Guiyang 550025， Guizhou， China）

Abstract：A high performance liquid chromatographic （HPLC） method was developed for the simultaneous determination of chlorogenic acid， caffeic acid， rutin， palatalin， quercetin， and kaempferol in flue-cured tobacco leaves. The content of these six polyphenols were analysed in the hybrid F1 and its parents for different tobaccos. The extraction solution of pure methanol：pure water =7：3 was used. Ultrasonic extraction was performed for 30min. Column T was Agilent 5 TC-C18 （250mmx4.6mm， 5 mm）. Two per cent of aqueous glacial acetic acid-methanol was used as the mobile phase. Gradient elution with the flow rate of 1ml/min was applied. Column temperature was at 30 C and injection volume was 10 L. The results showed that the six polyphenols had good separation effect. The rate of recovery ranged from 95.53% to 100.622% （RSD was 0.95% to 2.285%）， and the stability RSD （n=3） was 0.13% ～ 1.73%. Chlorogenic acid， caffeic acid， rutin， palatalin， quercetin and kaempferol was in the range of 10～600 g/ml. The correlation coefficients of the linear equation of polyphenols varied from 0.99996 to 0.99999. The content of chlorogenic acid and rutin in each material was relatively high， which was the main component of polyphenols. The content of other polyphenols is relatively low. Hybrid F1 had some advantages relative to its parent materials in certain polyphenol contents. For example， the content of chlorogenic acid of VA116 X GDH88 in hybrid F1 was much higher than that of its two parent materials； the content of rutin of VA116 X TN90 also surpassed the parents； while the content of chlorogenic acid was lower than that of its parent VA116； the content of rutin of Florda301 X GDH94 was also beyond that of the parents， while the content of chlorogenic acid was lower than that of its parent GDH94.

Key words：Tobacco polyphenols；HPLC；chlorogenic acid；rutin；method validation

煙草（Nicotiana tabacum L.）是一種以吸食為主要目的的特殊經濟作物，其香味基本上決定了它的利用價值或可用性[1]。多酚類化合物是煙草的重要潛香物質，烤煙中多酚含量可達7%；蕓香苷、綠原酸和莨菪亭是煙葉中最豐富的多酚，不僅對煙葉顏色有直接作用，而且對煙氣質量和香氣有間接作用，可賦予煙氣清甜香、烤香[2]。 一般認為，烤煙中多酚類物質的含量與煙葉品質、芳香吃味是一致的。多酚類物質含量越高，煙草制品等級也就越高[3]。多酚類物質主要存在于葉片中，莖和根部有少量積累[4]。莊亞東等[5]對煙草多酚類化合物研究發現：多酚化合物對煙株的生長發育、抗病蟲害、抗逆性有很大影響。韓景峰等[6]研究發現：鮮煙葉中多酚與煙葉的易烤性也有很大關系。因此，測定分析煙草中多酚類物質的含量，可為優質煙草品種的篩選、選育提供數據支撐。

HPLC法分析煙草中的多酚物質，具有分離高效，測定準確的優點。目前已有HPLC法鑒定煙葉中綠原酸、蘆丁、莨菪亭等多酚物質的相關報道[6-7] ，但還沒有同時測定煙葉中綠原酸、咖啡酸、蘆丁、莨菪亭、槲皮素和山奈酚的相關報道。超聲提取法是通過空化作用、熱效應、機械作用使植物組織內部的溫度瞬時升高，加速目標成分的溶出[8-9]。超聲提取法具有效率高，不用加熱，可大大縮短提取時間，不會導致多酚類物質的分解等優點而得到廣泛推廣應用[8，10]。因此，本文擬采用Agilent 5 TC-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱，優化樣品提取法，建立適用于煙草樣品中綠原酸、咖啡酸、蘆丁、莨菪亭、槲皮素等多種多酚物質同時分析的方法，并在此基礎上分析幾個煙草品種（系）及其雜種F1的多酚類物質，以期為篩選高多酚含量的煙草品種（系）和了解多酚物質性狀雜種優勢現象提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試材料 引進品種VA116、Florida301和TN90，貴州大學自育烤煙品系GDH94和GDH88，雜種F1：GDH88×VA116，VA116 ×TN90，Florda301 × GDH94，上述材料烤后C2F煙葉。

1.1.2 試劑與儀器

試劑：綠原酸、咖啡酸、蕓香苷、莨菪亭、槲皮素標準品均購自上海金穗生物科技有限公司；色譜純甲醇、分析純甲醇、乙酸購自貴州賽蘭博科技有限公司；水為娃哈哈純凈水。

儀器：Agilent 1260高效液相色譜儀； Agilent5 TC-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱；臺式超聲清洗器PS-20；賽多利斯萬分之一電子天平。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件的優化

色譜條件參照夏雅俊[10]建立的HPLC 法同時測定油橄欖葉中的 5 種多酚類化合物含量條件。流動相A為娃哈哈純凈水（加入2%的冰乙酸），流動相B為色譜純甲醇；流動相梯度為：0 min A∶B=80∶20；25 min A∶B=50∶50；35 min A∶B=0∶100；45 min A∶B=0∶100；流速：1 ml/min；柱溫：30℃；進樣體積：10 μl；檢測波長100～600 nm。

1.2.2 標準溶液的配制

分別稱取4.8 mg綠原酸、4.9 mg蕓香苷、4.8 mg咖啡酸、5.0 mg莨菪亭、4.8 mg山奈酚標準對照品，用70%的甲醇溶液溶解，定容至100 ml，分別配制成48 μg/ml綠原酸、49 μg/ml蕓香苷、48 μg/ml咖啡酸、50 μg/ml莨菪亭及48 μg/ml山奈酚標樣溶液母液，備用。分別移取標樣母液1、2、3、5、10 ml，以70%的甲醇稀釋配成不同濃度的系列標樣溶液，經0.45 μm的濾膜過濾待用。

1.2.3 線性關系和檢測限考察

將1.2.2所配置一系列不同濃度的綠原酸、咖啡酸、蘆丁、莨菪亭、槲皮素和山奈酚標準溶液用1.2.1的色譜條件進樣分析，進樣量為10 μl，進樣次數為2。以峰面積為縱坐標，以質量濃度為橫坐標，繪制標準曲線進行線性分析，得到各物質的回歸方程和相關系數。通過稀釋混合標準溶液測定每種多酚物質的檢出限（信噪比S/N=3）和定量限（信噪比S/N=10），線性范圍參照《JJG-705-2002-液相色譜儀檢定規程》[12]中的方法進行確定。

1.2.4 穩定性考察

取一定質量濃度的6種多酚類物質標準溶液和供試樣品于溫室放置，分別在0、2、4、6、8、10、24、48 h，按照相同的色譜條件進樣分析，計算相對標準偏差。

1.2.5 樣品提取條件的優化

以GDH94旺長期中部殺青葉片為材料，采用單因素實驗優化煙葉中粗多酚的最佳提取條件。取煙草葉片粉末1 g，于100 ml容量瓶中，分別用娃哈哈純凈水配制純甲醇、95%甲醇、90%甲醇、85%甲醇、80%甲醇、75%甲醇、70%甲醇65%甲醇和60%甲醇作為提取試劑，超聲波清洗器超聲提取30 min，冷卻后溶液經0.45 μm的濾膜過濾進樣測定。然后以量最高的提取液提取樣品，進行超聲時間的優化，超聲時間分別為10、15、20、25、30、35和40 min。

1.2.6 提取回收率和精密度考察

稱取兩份相同GDH94材料5 g，其中一份加入一定量的標準品，將兩樣品在相同條件下按照1.2.1的色譜條件進行HPLC分析，進樣3次重復試驗，通過標曲方程算出各樣品濃度，計算出各種多酚類物質的回收率和相對標準偏差（RSD）。

1.2.7 數據采集

在選定分析條件下，采用外標法導出數據進行定量分析。分別采集六種多酚類物質的光譜圖和色譜圖，及不同比例提取試劑和不同超聲時間所檢測出的各種多酚類含量進行對比分析。

1.2.8 樣品測定 分別稱取VA116，GDH88，GDH94，Florda301，TN90，GDH88×VA116，VA116×TN90，Florida301×GDH94的C2F煙葉粉末1.000 g于100 ml容量瓶中，定容。利用優化的方法進行樣品測定分析。

2 結果與分析

2.1 6種多酚光譜圖及色譜圖分析

利用單個標準品按照1.2.1的色譜條件進樣，采集光譜信息同時記錄保留時間。由圖1可以看出：綠原酸、咖啡酸、蘆丁、莨菪亭、槲皮素及咖啡酸的紫外吸收集中在200～350 nm之間，且各多酚物質的光譜圖特征各有不同。由圖2 a可見，以流動相：水（2%的冰乙酸）-甲醇；流動相梯度：0 min A∶B=80∶20，25 min A∶B=50∶50，35 min A∶B=0∶100，45 min A∶B=0∶100；流速：1 ml/min；柱溫：30℃；進樣體積：10 μl的運行體系可以很好的將6種多酚物質給區分開來。與單個標品的保留時間比對，獲得各酚類物質的保留時間分別為：綠原酸9.702 min；咖啡酸12.151 min；莨菪亭16.511 min；蘆丁23.030 min；槲皮素30.763 min；山奈酚32.807 min。根據不同保留時間和光譜圖特征，經過標準品和供試樣品進行光譜圖比對可以確定供試樣品的各個峰所代表的物質（圖2b）。

2.2 不同比例提取試劑的影響

由圖3可以看出，煙葉中多酚類物質以綠原酸和蘆丁含量最高，咖啡酸和山奈酚含量最低。甲醇濃度明顯影響多酚類物質的提取效率。95%甲醇提取的綠原酸量比以100%純甲醇的提取量顯著增加，其中綠原酸提取量增加了153%，蘆丁提取量增加了46.67%，莨菪亭的提取量增加了188.53%，6種多酚總提取量增加了93.58%。甲醇∶水=70∶30時，煙葉中多酚類物質提取率最高；隨著甲醇濃度的降低，提取效果沒有明顯增加，甚至略有下降。

2.3 不同超聲時間對烤煙多酚含量提取的影響

如圖4所示，超聲萃取時間與提取效果存在一定的關系，隨著超聲萃取時間延長，提取量有所增加，超聲時間30 min時，提取量已基本穩定，超聲時間為30 min時，綠原酸提取量比超聲時間為10 min時增加了6.01%，蘆丁提取量增加了5.80%；莨菪亭提取量增加了0.27%，總含量較超聲時間為10 min時增加了5.5%。繼續延長超聲時間，各多酚物質提取量增加不再明顯，采用30 min為超聲提取時間。

2.4 線性關系和檢測限考察

將1.2.2所配制一系列不同濃度的綠原酸、咖啡酸、蘆丁、莨菪亭、槲皮素和山奈酚混合標準品溶液用1.2.1的色譜條件進樣分析，繪制標準曲線，得到各物質的回歸方程和相關系數（表 1）。通過稀釋混合標準溶液測定每種多酚物質的檢出限（信噪比S/N=3）和定量限（信噪比S/N=10），線性范圍參照《JJG-705-2002-液相色譜儀檢定規程》[11]中的方法進行確定。結果表明綠原酸、咖啡酸、蘆丁、莨菪亭、槲皮素及山奈酚6個物質的標準曲線相關系數R均大于0.9999；檢測限分別為2.51、0.20、5.62、1.19、0.15、0.12 μg/ml，定量限分別為8.38、0.69、16.32、3.64、0.56、0.42 μg/ml，顯示該方法具有較高的靈敏度，可對多酚類物質含量較低的樣品進行分析。

2.5 提取回收率與精密度實驗

稱取兩份相同材料，按照1.2.3的方法進行回收率和精密度試驗結果如由表2所示。由表2可知，6種多酚類物質的加標回收率為95.53%～100.622%，RSD為0.95%～2.285%（n=5），說明所建立的方法重復性好，準確度高。

2.6 穩定性實驗

取1.2.5中70%提取超聲時間為30 min的供試樣品適量，分別在室溫下放置0、2、4、6、8、16、24、48 h，按1.2.1色譜條件測定，記錄峰面積。計算RSD，結果供試樣品綠原酸、咖啡酸、蘆丁、莨菪亭、槲皮素、山奈酚RSD分別為1.43%、0.89%、1.65%、1.11%、0.55%、0.79%（n=5），表明供試品室溫放置48 h內基本定性。

2.7 供試材料多酚類物質含量檢測

表3結果顯示不同材料中不同多酚物質含量不同，各材料的綠原酸和蘆丁含量較高，其他多酚物質含量較低；其中GDH88×VA116中多酚類物質總含量最高，達14.51mg/g，綠原酸含量（11.74mg/g）也顯著高于其他材料。TN90的多酚類物質總含量、綠原酸和蘆丁的含量都最低。各雜交種相對其親本材料在某種多酚含量中都有一定優勢，如GDH88×VA116在綠原酸含量上遠遠高于其兩個親本；VA116 × TN90在蘆丁含量上也超越其雙親，而綠原酸含量則低于其親本VA116；Florda301 × GDH94在蘆丁含量上也超越了雙親，在綠原酸含量上則低于其親本GDH94。

3 結論與討論

本文通過對提取試劑、超聲時間的優化，建立了同時檢測煙草多酚類物質綠原酸、咖啡酸、蘆丁、莨菪亭、槲皮素及山奈酚的高效液相色譜法：流動相A為娃哈哈純凈水（加入2%的冰乙酸），流動相B為色譜純甲醇；流動相梯度為：0 min A∶B=80∶20；25 min A∶B=50∶50；35 min A∶B=0∶100；45 min A∶B=0∶100；流速：1 ml/min；柱溫：30℃；進樣體積：10 μl；檢測波長100～600 nm。提取試劑選擇70%的甲醇，超聲時間為30 min。

驗證表明：應用該方法檢測的標準曲線相關性非常好，相關系數為0.99996～0.99999，回收率95.53%～100.622%的范圍，說明方法準確可信；變異系數低于2%，說明方法重現性好；穩定性試驗RSD在0.55%～1.43%之間，說明所采用提取方法提取的6種多酚類物質比較穩定。所優化的方法可以用于高效液相色譜法檢測煙草葉片中多酚類物質含量。

利用所建立的方法檢測了3個雜種F1及其親本材料的多酚類物質含量，結果表明綠原酸和蘆丁是煙葉多酚物質的主要成分，咖啡酸、莨菪亭、槲皮素和山奈酚的含量較低。不同樣品之間的綠原酸含量差異較大，在0.25～11.74之間。同一品系不同時期的綠原酸含量也不同，在優化提取試劑時，采用的是GDH94 旺長期的殺青葉片為材料，此時的綠原酸及蘆丁的含量都顯著低于成熟期烤后煙葉的含量。雜交種相對其親本材料在某種多酚含量中都有一定優勢；GDH88×VA116在綠原酸含量上遠遠高于其兩個親本材料；VA116 × TN90在蘆丁含量上也超越其雙親，而綠原酸含量則低于其親本VA116；Florda301 × GDH94在蘆丁含量上也超越了雙親，在綠原酸含量上則低于其親本GDH94。

綠原酸是抗菌、抗病毒、抗低血壓以及治療肥胖的有效藥理成分之一[12-13]。蘆丁也具有抗氧化、消除自由基、保護心腦血管等作用[14]。在醫藥、化工和食品等領域都具有光明的應用前景。從雜交種的雜種優勢表現來看，綠原酸和蘆丁都存在較為明顯的超親優勢現象，這可能是雜交種中控制苯丙素生物合成途徑和黃酮類生物合成途徑的單個基因表達或多個基因互作調控引起的。因此，可從基因層面進一步研究、利用雜種優勢培育高含量的綠原酸和蘆丁的煙草雜交種，拓展煙草的綜合利用價值。

參 考 文 獻：

[1] 王 彪，李天福，王樹會.煙葉香吃味指標的因子分析[J].云南農業大學學報，2006，21（1）：125-126.

[2] 朱大恒，韓錦峰，李彩霞.烤煙發酵過程中品質及香吃味的形成[J].河南農業科學，1997，（3）：5-7.

[3] 朱小茜，徐曉燕，黃義德，等.多酚類物質對煙草品質的影響[J].安徽農業科學，2005，33（8）：1910-1911.

[4] 孟冬玲，李小蘭，周 曉.國內主要煙葉產區不同部位的多酚含量分析[J].大眾科技，2011，（12）：87-88.

[5] 莊亞東，張 映，王 芳，等.卷煙中多酚類物質的分析[J].煙草科技，2004，（1）：23-26.

[6] 韓景峰，林學梧，黃海棠，等.煙葉成熟過程中一些生理變化的研究[J]. 華北農學報，1991（6）：63-67.

[7] 沈丹紅，路 鑫，常玉瑋，等.高效液相色譜-紫外/質譜檢測法聯合測定新鮮煙葉中的25種酚類物質[J].色譜，2014，32（1）：40-46.

[8] 史春云，袁凱龍，肖衛強，等.超高效液相色譜法快速檢測煙葉中8 種多酚類化合物.西南農業學報，2015，28（3）：1322-1326.

[9] 何 敏，舒 剛，楊 樂，等.葛根芩連注射劑中3種有效成分的HPLC法測定及其優化[J].河南農業科學，2014，43（6）：152-156.

[10] 夏雅俊，孫小明，張 佳，等.HPLC 法同時測定油橄欖葉中的 5 種多酚類化合物含量[J].分析試驗室.2014，33（7）：766-770.

[11] JJG 705-2002.液相色譜儀檢定規程[S].國家標準物質研究中心：國家質量監督檢驗檢疫總局，2002：8.

[12] Cho A S，Jeon S M，Kim M J，et al.Chlorogenic acid exhibits anti-obesity property and improves lipid metabolism in high-fat diet-induced-obese mice[J].Food and Chemical Toxicology，2010，48 （3）：937-943.

[13] Dos Santos M D，Almeida M C，Lopes N P，et al.Evaluation of the anti-inflammatory，analgesic and antipyretic activities of the natural polyphenol chlorogenic acid[J].Biological and Pharmaceutical Bulletin，2006，9 （11）：2236–2240.

[14] 臧志和，曹麗萍，鐘 鈴.蘆丁藥理作用及制劑的研究進展[J].醫藥導報，2007（07）：758-760.