過表達SIRT1對高糖誘導RVECs細胞的影響及對VEGF和PEDF表達的影響

周垂仁，黃衛，江玲，龍碧

(1.重慶市璧山區人民醫院眼科；2.重慶市璧山區人民醫院內分泌科,重慶 402760)

糖尿病視網膜病變(diabetic retinopathy，DR)是十分常見的糖尿病并發癥，也是導致成人失明的主要原因之一[1]。病程5年以上2型糖尿病(type 2 diabetes，T2DM)患者合并DR的發生率為24%～40%，病程10年以上T2DM患者合并DR的發生率高達 53%～84%[2-3]。所以，對于DR的防治及其發病機制的研究具有十分重要的意義。有關DR的具體發病機制尚不十分明確，一般認為是多種因素共同作用的結果。近年來，有關沉默信息調節因子-1(silent information regulator-1，SIRT1)與糖尿病及其并發癥的相關研究，越來越受到眾多學者的重視[4-6]。本實驗通過觀察過表達SIRT1對高糖誘導的人視網膜血管內皮細胞(retinal vascular endothelial cells，RVECs)增殖、凋亡，及其對血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和色素上皮衍生因子(pigment epithelium derived factor,PEDF)表達的影響，從而為DR的臨床防治提供一定的實驗依據，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

RVECs細胞(中國科學院上海細胞庫)；培養液，胎牛血清，胰蛋白酶(美國Gibco公司)；慢病毒載體包裝系統包含pCDH-CMV-MCS-EF1-coHGFP、pRsv-REV、pMDlg-pRRE、pMD2G質粒(美國System Biosciences公司)；人SIRT1基因片段(美國Santa Cruz Biotech公司)；逆轉錄和實時熒光定量PCR試劑盒(美國ABI Applied Biosystems公司)；兔抗人SIRT1、兔抗人VEGF、兔抗人PEDF，羊抗兔二抗，BAD顯色試劑盒(美國Santa Cruz公司)；原位末端標記法(TdT-mediated dUTP nick-end labeling，TUNEL)細胞凋亡檢測試劑盒(瑞士羅氏公司)；EcoRⅠ和AgeⅠ內切酶，DNA回收和連接試劑盒(日本TaKaRa公司)；Opti-DMEM培養基，Lipofectamine 2000，TRIzol總RNA提取試劑盒(美國Invitrogen公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 SIRT1過表達慢病毒載體的構建 根據Gen Bank人SIRT1基因信息，委托上海吉瑪公司設計合成針對SIRT1基因的DNA寡核苷酸鏈。正向5’-CCGGGCGGGAATCCAAAGGATAATTCTCGAGAATTATCCTTTGGATTCCCGCTTTTG-3’，反向5’-AATTCAAAAAGCGGGAATCCAAAGGATAATTCTCGAGAATTATCCTTTGGATTCCCGC-3’(內含EcoRⅠ和AgeⅠ酶切位點)，以人SIRT1基因為模板進行PCR擴增，產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳，DNA凝膠回收試劑盒回收、純化。采用EcoRⅠ和AgeⅠ雙酶切PCR產物和pCDH-CMV-MCS-EF1-coHGFP質粒，經T4 DNA連接酶連接后轉化DH5α大腸桿菌，經氨芐青霉素瓊脂培養基篩選陽性克隆，測序。pCHD-SIRT1、pRsv-REV、pMDlg-pRRE和pMD2G共轉染HEK293T細胞，收集細胞上清液經0.45 μm過濾器過濾，獲得SIRT1過表達慢病毒，經測定病毒滴度(MOI)=50。

1.2.2 實驗分組及處理 RVECs細胞株接種于10%胎牛血清的人內皮細胞培養液，37 ℃、5% CO2培養箱培養。生長至80%融合時，0.25%胰蛋白酶消化、傳代。取對數期細胞用于后續實驗，分為3組：(1)正常對照組(NG組)：正常培養RVECs細胞，不經任何處理；(2)高糖組(HG組)：在含33 mmol/L葡萄糖的培養液中培養；(3)SIRT1過表達慢病毒組(SIRT1組)：用MOI=50的SIRT1過表達慢病毒轉染細胞，并在含33 mmol/L葡萄糖的培養液中培養。轉染6 h后棄去更換正常培養液繼續培養，48 h后于熒光顯微鏡下觀察細胞綠色熒光蛋白(GFP)表達，收集細胞用于后續實驗。

1.2.3 實時熒光定量PCR檢測基因表達 TRIzol法提取細胞總RNA，逆轉錄合成cDNA，以cDNA為模板進行PCR擴增。SIRT1 上游：5’-GACTTCAGGTCAAGGGAT-3’，下游：5’-CGTGTCTATGTTCTGGGTA-3’。 VEGF上游：5’-AAACTGTCAGCTCGGTCAGA-3’，下游：5’-TCAGGGGCCGATTAAAGCTC-3’。PEDF上游：5’-CGATGAGATCAGCATTCTCC-3’，下游：5’-ATTCTGGGTCACTTTCAGGG-3’。GAPDH上游：5’-GGAGCCAAACGGGTCATCATCTC-3'，下游：5’-ATGCCTGCTTCACCACCACCTTG-3’。擴增條件：94 ℃/3 min，94 ℃/1 min，61 ℃/30 s，72 ℃/30 s，共35個循環，72 ℃/7 min。采用2-△△Ct計算目的基因相對含量(RQ)，RQ=2-△△Ct。

1.2.4 蛋白印跡法檢測蛋白表達 RIPA裂解液裂解細胞，離心獲取細胞總蛋白，二喹啉甲酸法測定蛋白濃度。等量總蛋白上樣，聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，轉至聚偏氟乙烯膜。磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution，PBS)漂洗，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入兔抗人一抗工作液(抗SIRT1、抗VEGF、抗PEDF，1∶500)，4 ℃孵育過夜。PBS漂洗，加入羊抗兔二抗工作液(1∶500)，37 ℃孵育1 h。PBS漂洗，BAD顯色，Bio-rad系統分析，目的蛋白表達量=目的蛋白光密度值/內參光密度值。

1.2.5 噻唑藍比色法檢測細胞增殖 RVECs細胞株接種于96孔板，具體分組及處理同1.2.2所述，同時設置空白對照組只加培養液。轉染48 h后，每孔加入20 μL噻唑藍(5 mg/mL)。孵育4 h，每孔加入150 μL二甲基亞砜。振搖15 min，充分溶解結晶，酶標儀測定OD (570)值。假設NG組細胞增值率為100%，計算SIRT1組和HG組細胞增殖率=(SIRT1組或HG組OD值-空白對照組OD值)/(NG組OD值-空白對照組OD值)×100%。

1.2.6 TUNEL檢測細胞凋亡 RVECs細胞株接種于放置蓋玻片的6孔板中，具體分組及處理同1.2.2。轉染48 h后，收集各組蓋玻片，二甲苯浸洗2次，梯度酒精浸洗1次，PBS漂洗2次。加入Proteinase K工作液，37 ℃下孵育30 min。PBS漂洗2次，加入50 μL的TUNEL反應混合液，封膜，暗濕盒中37℃下孵育30 min。PBS漂洗3次，加50 μL 的converter-POD工作液，封膜，暗濕盒中37 ℃下孵育30 min。PBS漂洗3次，加入100 μL的DAB顯色劑，25 ℃下孵育10 min。PBS漂洗3次，蘇木素，自來水沖洗，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。光學顯微鏡400倍光鏡下，取7個陽性視野，每個視野計數200個細胞，計算凋亡細胞占總細胞百分比作為凋亡率。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 SIRT1、VEGF和PEDF基因表達比較

經單因素方差分析，NG組、HG組和SIRT1組細胞SIRT1、VEGF和PEDF基因表達水平存在顯著性差異(F=11.279，P=0.002；F=10.815，P=0.002；F=19.601，P<0.001)。經LSD-t檢驗，HG組細胞SIRT1基因表達水平低于NG組(t=3.623，P<0.001)，而VEGF和PEDF基因表達水平高于NG組(t=4.339、6.037，P<0.001)；SIRT組SIRT1基因表達水平較HG組顯著增加(t=3.754，P<0.001)，而VEGF和PEDF基因表達水平顯著降低(t=4.445、5.893，P<0.001)。見表1。

表1 各組細胞SIRT1、VEGF和PEDF基因表達水平比較

注：所有實驗均重復5次，*P<0.001，與HG組比較；#P<0.001，與NG組比較。

2.2 SIRT1、VEGF和PEDF蛋白表達比較

經方差分析，NG組、HG組和SIRT1組細胞SIRT1、VEGF和PEDF蛋白表達水平均存在顯著性差異(F=16.327、27.433、19.981，P<0.001)。經LSD-t檢驗，HG組SIRT1蛋白表達水平較NG組顯著降低(t=11.766，P<0.001)，而VEGF和PEDF蛋白表達水平顯著增加(t=6.797、5.296，P<0.001)；SIRT組SIRT1蛋白表達水平較HG組顯著增加(t=12.475，P<0.001)，而VEGF和PEDF蛋白表達水平顯著降低(t=5.674、6.012，P<0.001)。見表2和圖1。

表2 各組細胞SIRT1、VEGF和PEDF蛋白表達水平比較

注：所有實驗均重復5次，*P<0.001，與NG組比較；#P<0.001，與HG組比較。

2.3 過表達SIRT1對RVECs細胞增殖和凋亡的影響

經方差分析，NG組、HG組和SIRT1組細胞增殖率、凋亡率均存在顯著性差異(F=57.152、7.718，P<0.001)。經LSD-t檢驗，HG組細胞增殖率較NG組顯著增加(t=7.302，P<0.001)，而凋亡率顯著降低(t=4.014，P<0.001)；SIRT1組細胞增殖率較HG組顯著降低(t=6.543，P<0.001)，而細胞凋亡率顯著增加(t=4.783，P<0.001)。見表3和圖2。

表3 過表達SIRT1對RVECs細胞增殖和凋亡的影響

注：所有實驗均重復5次，*P<0.001，與NG組比較；#P<0.001，與HG組比較。

2.4 SIRT1與VEGF和PEDF的相關性分析

經Pearson相關性分析顯示，SIRT1表達水平與VEGF和PEDF呈負相關(r=-0.814，P=0.005；r=-0.593，P=0.029)。

3 討論

SIRT1是一種組蛋白脫乙?；鞍酌?，通過其脫乙?；饔枚鴧⑴c體內眾多蛋白酶和轉錄因子的活性調節[7-8]。Mortuza等[4]研究發現，高糖可誘導視網膜血管內皮細胞中miR-195的表達，并通過與SIRT1的3’端非編碼區(3’-UTR)結合而抑制SIRT1表達。Li等[5]研究證實，糖尿病腎病模型大鼠SIRT1表達顯著降低。Hou等[6]學者認為，SIRT1通過促進能量代謝平衡重建、調節細胞氧化還原狀態、抗細胞凋亡、抑制炎癥和改善腎纖維化等方面發揮腎臟保護作用，延緩糖尿病腎病的進展。以上結果說明SIRT1在糖尿病及其并發癥的發病過程中發揮重要作用。然而有關SIRT1在DR發生、發展中的作用研究，鮮有報道。本實驗結果發現：HG組細胞增殖率較NG組顯著增加，凋亡率顯著降低；SIRT1組細胞增殖率較HG組顯著降低，凋亡率顯著增加。實驗結果提示：高糖環境能夠誘導體外培養RVECs細胞增殖和降低其凋亡，而過表達SIRT1能夠逆轉高糖誘導的RVECs細胞增殖，促進其凋亡。

DR的主要病理特征表現為視網膜血管內皮細胞增生及新生血管形成等。VEGF和PEDF被認為是調節內皮細胞增生及新生血管形成的關鍵細胞因子，二者表達的失衡是引起DR 發生、發展的中心環節[9-11]。正常情況下，眼部組織VEGF呈低表達，從而維持眼部血管的完整性。如果VEGF過度表達，則會促進血管內皮細胞增殖和新生血管形成，并增加血管通透性，引起血-視網膜屏障損傷[12-14]。目前，臨床上采用VEGF抗體治療DR患者黃斑水腫和新生血管，已取得令人滿意的療效[15]。PEDF可拮抗VEGF表達阻斷新生血管形成，能上調抗凋亡基因Bcl-2表達阻止神經元細胞凋亡，被認為是維持新生血管穩態的必要條件[16-17]。Matsuyama等[18]學者報道顯示DR患者血清PEDF表達顯著高于健康人群。本實驗結果發現：HG組細胞VEGF和PEDF表達均顯著高于NG組，而SIRT1組細胞VEGF和PEDF表達較HG組顯著降低。實驗結果提示：高糖環境能夠誘導體外培養RVECs細胞VEGF和PEDF表達增加，而過表達SIRT1能夠逆這一現象。

國內外有關SIRT與VEGF的研究較少。邵瀅等[19]研究發現，miR-217通過與SIRT1的3’-UTR結合而抑制SIRT1表達，從而上調HIF-1α表達。Kang等[20]研究發現，高糖可誘導HIF-1α激活，繼而刺激其下游VEGF表達增加，誘導新生血管形成。說明SIRT與VEGF之間存在某種關系，本實驗結果顯示SIRT1表達與VEGF呈負相關。有關SIRT1與PEDF的研究尚未見文獻報道。在本實驗中也觀察到HG組PEDF表達增加，且過表達SIRT1可逆轉高糖引起的PEDF表達增加。我們推測可能是由于高糖誘導VEGF表達增加，而引起PEDF代償性表達增加。

綜上所述，高糖環境能夠誘導RVECs細胞增殖、減少凋亡，并上調細胞VEGF和PEDF表達。過表達SIRT1能夠抑制高糖誘導的RVECs細胞增殖、促進凋亡，并且下調VEGF和PEDF表達。