紅細胞微粒與深靜脈血栓形成關系的研究進展

張喆婷 徐新 張社兵

隨著科技發展，人們對細胞微粒（microparticles，MPs）的認識不斷提高。雖然MPs的產生過程未被闡明，但普遍認為MPs是血液中細胞活化和凋亡過程中通過細胞的胞吐作用產生的一種直徑為0.1～1.0 μm的小囊泡。大量的基礎和臨床研究表明，血栓性疾病與凝血因子、血小板、血管內皮細胞、組織因子有關。近幾年的研究發現，MPs也在其中發揮重要作用，其中紅細胞微粒（erythrocyte-derived microparticles，ErMPs）具有調節炎癥反應[1,2]及激活凝血系統[3,4]的作用。Wu等[5]報道，血栓性疾病患者血液中ErMPs水平明顯升高。由此可見，探究ErMPs是否可成為一種預測深靜脈血栓形成等血栓性疾病進展及預后的新標志物顯得十分有意義。本文就微粒結構、紅細胞微粒產生、促凝活性以及與深靜脈血栓形成關聯性進行闡述，以期為后續深入研究提供基礎。

1 深靜脈血栓形成（DVT）概述

深靜脈血栓形成（deep venous thrombosis，DVT）是指血液在深靜脈內非正常凝結，屬于一種靜脈回流障礙性疾病，在臨床較為常見。其發病率占周圍血管疾病的40%。DVT的并發癥多為肺栓塞、股白腫或股青腫及慢性靜脈功能不全綜合征等。無論是深靜脈血栓本身還是其并發癥，均可影響患者的工作及生活質量甚至導致死亡。并且據報道，約30%的靜脈血栓患者經抗凝治療后5年間仍存在一定的復發可能性[6]。流行病學調查報道，美國靜脈血栓每年新發病例超過100萬例；在國內尚缺乏DVT發病率確切的統計數據，但是其發病率有逐年上升趨勢。目前由于患者對DVT意識不足、診斷缺乏早期精確指標、抗凝治療周期長及INR值監測頻繁等眾多因素，故患者依從性差，疾病的診治及預后并不理想。因此，尋找一種能早期精準診斷DVT的生物學標志物顯得尤為重要。

2 MPs概述

MPs是在各種刺激因素下（如血流切應力、補體攻擊、氧化應激及凋亡前刺激等）真核細胞活化或凋亡時的產物，可循環于人類外周血中。相關研究發現，MPs含有豐富的母細胞的表面蛋白、脂質和胞質成分，如表面受體、細胞因子、磷脂、信使核糖核酸（mRNA）和小分子核苷酸（microRNA）。Rank等[7]的研究提及，MPs的生命半周期平均為5.8 h。從MPs分類而言，根據細胞來源，MPs分為血小板源性的MPs（PMPs）、白細胞源性的MPs（LMPs）、紅細胞源性微粒（ErMPs）、巨噬細胞源性MPs、內皮細胞源性MPs（EMPs）及癌細胞源性MPs等多個類型。不同源性MPs表達不同的促凝物質，其促凝方式也存在一定差異。

隨著MPs的臨床應用研究越來越多，MPs的檢測技術也不斷增多，應用最廣泛的為流式細胞儀（FACS）。同時運用免疫熒光技術還可以精確地檢測到細胞微粒的數目和來源。

Nomura等[8]的研究證實，不同起源細胞的MPs具有不同的表面標記物，如PMPs可表達CD41a、CD62P及Annexin V等，EMPs可表達CD31、CD144及Annexin V等。而Grisendi等[9]則發現，ErMPs的表面標志物為CD235a（+）及Annexin V等。故根據MPs大小和表面標記物，可以更準確地檢測出不同來源的MPs。目前人們對PMPs、LMPs及EMPs研究較多，對ErMPs的認識較少。

3 ErMPs概述

ErMPs是指紅細胞在各個因素刺激下發生活化或凋亡反應時所釋放的一種產物。隨著關于ErMPs的蛋白組學研究的不斷深入，有研究報道，ErMP組成成分與紅細胞存在一定的區別，但ErMPs可表達某些紅細胞的表面蛋白抗原［如CD235a（+）］[8]。并且不同的刺激因素可引起ErMPs組成成分發生相應的變化，現已發現的主要成分有含Band3蛋白、血型糖蛋白A、補體蛋白和GPI錨定蛋白等。

4 ErMPs的檢測

目前ErMPs的檢測技術多種多樣，常用的方法有顯微鏡觀察、酶聯免疫吸附法（ELISA）、流式細胞儀（FACS）和蛋白組學等。FACS的操作方法簡便快捷，并且可進行熒光標記檢測，使其成為臨床檢測ErMPs的重要方法[10]。隨著技術的發展，FACS不僅可以檢測到直徑最小約0.1 μm的ErMPs，還可以對其進行定量分析。近年來，國外相關研究證明，通過CD235a（+）、膜聯蛋白V及二醋酸羥基熒光素琥珀酰亞胺脂（CFSE）三者同時與ErMPs表面蛋白抗原結合，可以更有效地測定血液中ErMPs的數量[8]。

5 ErMPs的促凝作用

5.1 ErMPs與內皮細胞 眾所周知，正常的血管內皮細胞具有調節凝血和抗凝血等作用，血管內皮細胞里產生的一氧化氮（NO）可進入血小板細胞，使血小板活性降低，抑制其凝集和向血管內皮黏附，從而防止血栓的形成。當內皮細胞功能受到損傷時可促進凝血反應發生，進而促進血栓形成。由此推測血管內皮細胞損傷與DVT的發生有密切關系。

當紅細胞發生活化或凋亡反應時，將釋放含有血紅蛋白的ErMPs及游離的血紅蛋白，其中所含有的亞鐵離子可迅速與NO結合，以比紅細胞快1000倍左右的清除速度把NO從體內清除，進而達到降低NO生物利用度的目的[11]。當NO生物利用度下降后，血小板便更容易被激活，從而增加血栓形成的風險。大量研究已證實NO作用于平滑肌細胞時，平滑肌松弛，引起血管舒張作用。Camus等[12]報道，ErMPs、游離血紅蛋白具有收縮血管的作用，從側面提示ErMPs及游離紅細胞在NO清除過程中起一定作用。由此表明ErMPs可通過降低NO生物利用度而達到促凝的作用。

5.2 ErMPs與PS外翻 相關研究發現，ErMPs的膜主要為雙層磷脂，由脂類、蛋白質及糖類組成。靜息狀態下，各種磷脂不對稱地分布于細胞膜兩側分布于細胞膜外側的為磷脂酰膽堿和鞘磷脂，而磷脂酰乙醇胺（phosphatidyiethanolamine，PE）和磷脂酰絲氨酸（hosphatidylserine，PS）則分布于內層，這種不對稱性需要消耗能量來維持。當紅細胞激活或凋亡后釋放ErMPs，其位于膜內側的大量PS（帶負電荷）外翻，更易與凝血蛋白上的γ－羧基谷氨酸酶結構域（帶正電荷）發生靜電反應，更容易與凝血因子結合，從而進一步促進凝血反應[13]。眾所周知PS作為凝血啟動和吞噬識別過程中重要的信號分子，可有效地促進凝血因子FX的激活和凝血酶生成，從而促進血栓的形成。Guo等[14]的研究發現，合并DIC的急性早幼粒細胞白血?。╝cute promyelo cytic leukemia，APL）患者血漿中PS呈高表達水平PS表達水平對評估血栓形成傾向有一定的意義Mankelow等[15]的研究表明，SCD患者的高凝狀態可能與攜有PS促凝微粒的紅細胞存在密切關系由此推測，PS外翻在深靜脈血栓形成過程中發揮著一定的促凝作用。

5.3 ErMPs與TF表達 組織因子（tissue factor TF）是一種跨膜糖蛋白，是體內凝血途徑的主要啟動因子。TF主要以在微粒上表達的形式存在，這種微粒即為TF+MPs，其促凝作用最大。相關研究已證實TF+MPs的促凝活性高于無TF表達的MPs約10倍[16]。有研究[17]表明，MPs表面可表達組織因子TF，ErMPs也不例外。當組織和血管損傷后釋放TF，TF與凝血因子Ⅶ/活化凝血因子Ⅶa（FⅦ/FⅦa結合，從而啟動外源性凝血反應[18]。因為TF是FⅦⅦa的受體，其對FⅦ/FⅦa有很高的親和力，當紅細胞活化或凋亡時產生ErMPs，其表面表達TF時更容易結合FⅦ/FⅦa，從而形成凝血起始復合物激活FX和FIX啟動凝血，故增強了ErMPs的促凝活性。

6 ErMPs與深靜脈血栓形成關系

DVT是臨床常見病、多發病。1946年，Virchow提出：DVT三大發病原因為靜脈壁損傷、血流緩慢和血液高凝狀態。目前對此理論有了更多新的認識，尤其是DVT發病相關高危因素受到了重視。目前普遍認為內在和環境因素（年齡、制動、原發性高凝狀態、血型、地域差異、肥胖）、手術和創傷、靜脈留置導管、疾病因素（惡性腫瘤、SLE、炎癥性腸?。?、女性特殊因素（妊娠、口服避孕藥）等是深靜脈血栓形成的高危因素[19]，但其確切發病機制還不清楚。

目前相關研究發現，MPs已經涉入廣泛疾病譜，包括心血管疾病、糖尿病、炎癥狀態、敗血癥、抗磷脂抗體綜合征、血栓性血小板減少性紫癜和癌癥等。而這些疾病常導致血栓形成的高凝狀態。Zhou等[20]提出MPs在靜脈血栓栓塞癥（VTE）的病理生理過程中發揮重要作用。從病理學角度分析，血栓性淺表靜脈炎病理變化特點是靜脈壁有不同程度的炎癥、增厚和血管腔內血栓形成。而靜脈血流滯緩和血液高凝狀態等情況往往可引起深靜脈血栓形成，其血栓主要組成部分為紅細胞、血小板及少量纖維蛋白等。由此推測，由紅細胞釋放的ErMPs在深靜脈血栓形成中也起到一定作用。

大量的研究表明，MPs是幾種病理生理過程中的關鍵效應物，如內皮損傷和功能障礙、斑塊破裂、新生血管形成及急性血栓形成等。Jia等[21]的研究提及外周血中的PMPs可與ErMPs結合形成結合體，并通過試驗發現冠心病血淤證患者外周血中結合體呈高表達水平，由此推斷ErMPs在血淤證中發揮一定作用。而Amabile等[22]也提出，隨著患者血漿MPs水平的升高，患者發生動脈粥樣硬化、血栓形成及急性冠狀動脈疾病的風險也隨之升高。同時也證實靜脈血栓栓塞患者的血漿中可檢測到CD31（+）-EMPs，而慢性腎衰竭合并內皮細胞功能障礙患者的血漿中可檢測到ErMPs，但DVT與ErMPs相關性仍需不斷探究。

Suades等[23]的研究發現，急性ST-T段抬高型心肌梗死患者外周血中ErMPs及CD235a（+）的表達水平較健康對照組顯著升高，并且進行再灌注治療后ErMPs及CD235a（+）表達水平呈明顯下降趨勢。此研究發現，冠狀動脈血栓患者的外周動脈血中ErMPs水平高表達，表明外周血中ErMPs定量可用作急性期動脈血栓形成的敏感標記物。Suades等[23]表示，將進一步深入探究CD235a（+）-ErMPs在預測靜脈血栓形成中的評估價值。

近年來，國外有研究報道，血液-骨髓細胞源性的TF在某些疾病患者外周血中呈高表達水平，尤其是靜脈血栓疾病[24]。眾所周知，APL患者為下肢靜脈血栓形成好發人群，Zhang等[25]的研究證實，APL-BM-MNC來源微粒具有明顯的促凝活性。而其中ErMPs是否亦發揮相應作用仍需深入研究。Tesselaar等[26]首次描述了TF+MPs與急性靜脈血栓的關系。這項研究表明，合并VTE的胰腺癌和乳腺癌患者體內TF+MPs水平最高，并且TF+MPs活性明顯高于健康個體及自發性VTE患者。Zwicker等[27]也得出相似的結論，胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、直腸癌患者體內TF+MPs高表達，原未合并靜脈血栓的癌癥患者其1年內發生血栓率為38%，且均為TF+MPs高表達患者，不高者發生率為0。Thaler等[28]則提及TF與癌癥組織學分級、血管相關侵襲、血管生成和靜脈血栓栓塞的發生具有相關性，并證實高活性的TF-MP存在于低分化的胰腺癌表型中，其可浸潤胰周血管。因此，TF+ErMPs可能參與靜脈血栓形成的過程。

最近國外有關MPs的研究報道，MPs高表達可能增加自身免疫性疾病患者發生血栓事件的風險。Niccolai等[29]報道，ErMP可能在血栓形成中具有一定作用，尤其是慢性溶血性疾病，如地中海貧血（halassemia）、鐮狀細胞?。╯ickle cell disease，SCD）及陣發性睡眠性血紅蛋白尿（paroxysmal nocturnal hemoglobinuria，PNH）等。相關研究證實，溶血過程中紅細胞裂解所產生的ErMPs能夠激活內源性凝血途徑，促進凝血酶的生成[30]。

近年來，人們對ErMPs與慢性溶血性疾病患者合并血栓性疾病的關注不斷增加。例如Sun等[31]報道中提及，中間型地中海貧血患者脾切術后，血漿中ErMPs數量較術前急劇增多。

Camus等[32]通過大鼠模型實驗證實，SCD來源的ErMPs可引起大鼠血管閉塞及腎、腦血液灌流的減少，且隨著MPs劑量的增加，其血管閉塞持續時間延長。Kozuma等[33]的研究表明，PNH患者發生溶血反應時常伴有血栓形成，其外周紅細胞釋放的MPs的促凝活性促進PNH的血栓形成。而最近相關研究報道，PNH細胞通過補體沉積的非鈣離子依賴途徑釋放ErMPs，從而增加血栓形成風險[34]。

綜上所述，深靜脈血栓形成是一種臨床常見病、多發病，近年來我國DVT的發病率呈上升趨勢。初診DVT主要通過患者的臨床癥狀、臨床體征、相關輔助檢查（如D-二聚體、血管B超）等多個方面綜合考慮，但診斷存在一定的滯后性，這將延誤治療的最佳時機并影響患者的預后。如果可以尋找到一種可早期預測DVT的生物標志物，無疑是診治DVT的福音。目前隨著人們對ErMPs的關注不斷增加，其在血栓性疾病中的作用不斷被發現[8]，如調節血管內皮細胞功能、激活凝血系統及調節炎癥反應等。但ErMPs具體的促凝機制及與深靜脈血栓形成的關系仍未被闡明，仍需我們進行大量科研研究及臨床應用。相信在不久的未來，ErMPs將為深靜脈血栓的預防和治療開拓一個全新的視野。

［1］Radwanski K，Garraud O，Cogasse F，et al．The effects of red blood cell prepartion method in vitro markers of red blood cell aging and inflammatory response．Transfusion，2013，53：3128-3138．

［2］Belizaire RM，Prakash P，Richter JR，et al．Microparticles from stored red blood cells activate neutrophils and cause lung injury after hemorrhage and resuscitation．J Am Coll Surg，2012，214：648-655．

［3］Koshiar RL，Somajo S，Norstrm E，et al．Erythrocyte-derived microparticles supporting activated protein C-mediated regulation of blood coagulation．PLoS One，2014，9：104-200．

［4］Tantawy AA，Adly AA，Ismail EA，et al．Circulating platelet and erythrocyte microparticles in young children and adolescents with sickle cell disease：Relation to cardiovascular complications．Platelets，2013，24：605-614．

［5］Wu ZH，Ji CL，Li H，et al．Membrane microparticles and diseases．Eur Rev Med Pharmacol Sci，2013，17：2420-2427．

［6］Nakamura M，Yamada N，Ito M．Current anagement of venous thromboembolism in Japan：Current epidemiology and advances in anticoagulant therapy．J Cardiol，2015，66：451-459．

［7］Rank A，Nieuwland R，Crispin A，et al．Clearance of platelet microparticles in vivo．Platelets，2011，22：111-116．

［8］Nomura S，Shimizu M．Clinical significance of procoagulant microparticles．J Intensive Care，2015，3：2．

［9］Grisendi G，Finetti E，Manganaro D，et al．Detection of microparticles from human red blood cells by multiparametric flow cytometry．Blood Transfus，2015，13：274-280．

［10］Van der Pol E，Coumans FA，Grootemaat AE，et al．Particle size distribution of exosomes and microvesicles determined by transmission electron microscopy，flow cytometry，nanoparticle tracking analysis，and resistive pulse sensing．Thromb Haemost，2014，12：1182-1192．

［11］ LiaoHX，ZhangWL，MaX．CurrentAdvancementsof Erythrocyte-derived Microparticles in Coronary Heart Disease．Adv Cardiovasc Dis，2016，37：525-528．

［12］ CamusSM，GausseresB，BonninP，etal．Erythrocyte microparticles can induce kidney vaso-occlusions in a murine model of sickle cell disease．Blood，2012，120：5050-5058．

［13］Rubin O，CrettazD，Tissot JD，et al．Microparticles in stored red blood cells：submicron clotting bombs?Blood Transfus， 2010，8：31-38．

［14］Guo F，Meng DM，Zhang N，et al．Role of TF+MP and Ps i thrombogensis of acute promyelocytic leukemia．Chin J Clin Pat 2013，5：222-225．

［15］Mankelow TJ，Griffiths RE，Trompeter S，et al．Autophagi vesicles on mature human reticulocytes explain phosphatidylser ine-positive red cells in sickle cell disease．Boold，2015，126 1831-1834．

［16］Xu J，Meng WT．Role of tissue factor positive microparticles i coagalation and thrombosis．IJBTH，2016，39：174-179．

［17］易曉榕，桂曉美，馮江．微粒與凝血．實驗與檢驗醫學，2016 34：322-326．

［18］Geddings JE，Mackman N．New players in haemostasis an thrombosis．Thromb Haemost，2014，111：570-572．

［19］Zhang BY，Xue GH．Causes and risk factors of deep venou thrombosis．Chin J Surg，2003，23：197-200．

［20］Zhou L，Qi XL，Xu MX，et al．Microparticles：new light she on the understanding of venous thromboembolism．Acta Pharma col Sin，2014，35：1103-1110．

［21］Jia QL，Meng H，Hu YH，et al．Microparticles aggregates o peripheral blood in the unstable angina pec-toris patients with blood stasis pattern．J B Univ Tradit Chin Med，2017，40：59 64．

［22］Amabile N，Rautou PE，Tedgui A，et al．Microparticles：ke protagonists in cardiovascular disorders．Semin Thromb Hemost 2010，36：907-916．

［23］Suades R，Padro T，Vilahur G，et al．Growing thrombi releas increased levels of CD235a（+）microparticles and decrease levels of activated platelet derived microparticles．Validation in ST-elevation myocardial infarction patients．J Thromb Haemost 2015，13：1776-1786．

［24］Manly DA，Boles J，Mackman N．Role of tissue factor in ve nous thrombosis．Annu Rev Physiol，2011，73：515-525．

［25］Zhang YM，Chen B，Wu LY，et al．Role of Microparticles De rived from Acute Promyelocvtic Leukemia Cells in Coagulopathy J Exp Hematol，2017，25：693-698．

［26］Tesselaar ME，Romijn FP，Van Der Linden IK，et al．Mi croparticle associated tissue factor activity in cancer patient with and without thrombosis．J Thromb Haemost，2009，7：1421 1423．

［27］Zwicker JI，Liebman HA，Neuberg D，et al．Tumor-derive tissue fator-bearing microparticles are associated with venou thromboembolic events in malignancy．Clin Cancer Res 2009，15：6830-6840．

［28］Thaler J，Cihan AY，Mackman N，et al．Microparticleassociated tissue factor activity in patients with pancreatic cancer：correlation with clinicopathological features．Eur J Clin Invest，2013，43：277-285．

［29］Niccolai E，Emmi G，Squatrito D，et al．Microparticles：Bridging the Gap between Autoimmunity and Thrombosis．Semin Thromb Hemost，2015，41：413-422．

［30］Stief TW．Thrombin generation by hemolysis．Blood Coagul Fibrinolysis，2007，18：61-66．

［31］Sun N，Cheng P，Deng DH．Advances in Pathogenesis and Related Clinical Research of Thromboembolism in Patients with Thaiassemia after Splenectomy．J Exp Hematol，2016，24：949-953．

［32］Camus SM，De Moraes JA，Bonnin P，et al．Circulating cell membrane micmparticlestransferheme to endofhelialcells activation and vaso-occlusions in sickle cell disease．Blood，2015，125：3805-3814．

［33］Kozuma Y，Sawahata Y，Takei Y，et al．Procoagulant properties of microparticles released from red blood cells in paroxysmal nocturnal haemoglobinuria．Br J Haematol，2011，152：631-639．

［34］Su X，Cheng P，Deng DH．Research Advance of Microparticles in Hypercoagulation of Hemolvtic Anemia．J Exp Hematol，2017，25：622-626．