電針對Beagle犬展神經損傷后小膠質細胞活化狀態的影響

王蕾 張毅 王旭東 葉子

(南通大學第二附屬醫院:1急診中心; 2神經外科; 3中醫科，江蘇 南通 226001)

顱內感染、腫瘤、顱腦外傷、眼部病變等常出現導致展神經損傷，損傷后局部微環境代謝復雜，而神經細胞高度分化、再生能力低，影響了患者的生活質量[1]。迄今尚缺乏促進其功能修復的有效措施，顯微外科手術修復不盡滿意，相關的基礎研究目前也存在異議。針對病因治療外，電針刺激是一種較好的康復治療方法[2]。小膠質細胞是中樞神經系統的免疫吞噬細胞，在傷害性應激狀態下迅速反應，釋放大量的細胞因子，而研究得出炎癥反應是影響神經損傷后功能恢復的關鍵[3]。小膠質細胞在不同的微環境中可以出現不同的細胞表型：M1型與M2型。在神經細胞損傷后可激化為M1型，誘導免疫炎癥反應，但過多的炎癥反應因子同時也會導致正常細胞的損傷及凋亡[4]。M2型小膠質細胞主要抑制機體過度的免疫反應，促進炎癥修復，保證神經修復與再生[5]。故抑制炎癥刺激對神經細胞的過度打擊，調控小膠質細胞M1型與M2型動態平衡成為神經功能保護作用機制的焦點?；谝陨媳尘?，本實驗以電針刺激為核心，利用小膠質細胞為切入點，采用Western Blot技術明確展神經中M1、M2型標志分子的表達，進一步探討電針刺激展神經修復的機制。

材料與方法

一、實驗對象

選用健康Beagle犬(6月齡,n=36)，雌雄各半，體重(15.0±0.5) kg，由南通大學醫學院動物實驗中心提供，許可證號SCXK(蘇):2008-0010。實驗動物飼養于單獨的犬房，可自由走動，保證適宜的溫度進行飼養，飼養2 w進行實驗。隨機分為3組，每組12只：假手術組(A)、損傷組(B)和電針處理組(C)。實驗動物治療4 w取材進行Western Blot檢測展神經小膠質細胞M1、M2型標志分子的表達水平。動物的處理遵守國家健康協會制定的實驗動物使用指南。實驗分組：假手術組(A)：Beagle犬麻醉后，僅暴露分離展神經，術中不進行神經損傷處理，縫合切口皮膚，在電針刺激時進行束縛，連續2 w，每次持續15 min。損傷組(B)：Beagle犬麻醉后，制作展神經損傷模型，在電針刺激時進行束縛，連續2 w，每次持續15 min。電針處理組(C)：12只Beagle犬展神經損傷模型建立后進行電針刺激，每次持續15 min連續2 w。參數設置：刺激脈沖頻率 5 Hz，時程 0.1 ms，刺激強度 1.0 V。

二、實驗方法

1.展神經損傷動物模型制作：術前12 h禁食后注射3%戊巴比妥鈉(1 mL/kg)靜脈麻醉。將Beagle犬置于手術臺進行側臥位，固定試驗動物頭顱，耳緣牽向尾側固定，麻醉充分開顱后皮瓣翻向外側切除大腦半球，保留中腦組織，經顳肌附著處縱向切開。經顳底入路開顱，骨窗盡量靠近顱底，擴大骨窗范圍從眶后到顴弓前，并沿顳骨窗下緣切開硬腦膜沿斜坡向上外方做一創口約3.5 cm×3.5 cm。經巖顳韌帶下方進入海綿竇充分暴露深部的展神經。用有齒止血鉗擠壓夾閉展神經30 s后直視鉗壓處組織菲薄，切斷展神經軸突但維持神經鞘膜完性，以犬眼球呈內斜視表明造模成功。

2.電針刺激：C組展神經損傷模型制完成后將2個電極(5F導管)分別置入神經損傷處兩側。向外方牽拉上下眼瞼，在瞼板與球結膜交界處充分暴露外直肌，將電極均插入外直肌，植入深度約3.0 mm，間距約4.0 mm，縫合切口固定電極。游離端自眼眶后下方引出固定，形成回路，術后連續2 w給予電針刺激，每次持續15 min。參數設置：脈沖頻率為5 Hz，時程 0.1 ms，強度1.0 V。A及B組僅束縛，不刺激。

3.Western Blot檢測小膠質細胞的M1、M2分子表達：取上述Beagle犬各分組每組12只，用10%水合氯醛進行深度麻醉后，迅速用手術剪剪下展神經節段，在低溫無菌冰盤上進行操作，分離出少許神經組織置于1 mL勻漿器球狀部位，盡量充分剪碎組織。加入含苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride, PMSF)的400 μL單去污劑裂解液裂進行勻漿。裂解30 min后在4 ℃下12 000 rpm離心10 min，取上清分裝置于-20 ℃保存。提取小膠質細胞的總蛋白，通過NanoDrop定量，取40 μg蛋白進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel, SDS-PAGE)電泳，將蛋白以恒定電流30 mA，電轉90 min轉移到聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride, PVDF)膜上，TBST洗膜3次，然后5%TBST脫脂奶粉的以60 rpm的速度封閉60 min，加入一抗4 ℃冰箱孵育過夜(一抗的濃度：白細胞介素1β(interleukin 1β，IL-1β)為1 ∶200，誘導性一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)為1 ∶3 000，精氨酸(arginase)為1 ∶1 000，腦源性神經營養因子(brain derived neurotrophic factor, BDNF)為1 ∶200，一抗孵育完成后TBST漂洗3次，再移至新雜交袋中，與熒光標記二抗(1 ∶20 000)常溫孵育60 min，TBST充分清洗后以增強化學發光法(enhanced chemiluminescence, ECL)顯影并拍照，進行條帶灰度分析。

三、統計分析

結 果

一、Beagle犬展神經電刺激損傷模型建立

Beagle犬展神經暴露清楚(箭頭所示)，術后均生存良好，無感染、角膜潰瘍等并發癥，展神經損傷后，犬眼球呈內斜視(圖1、2)。

二、Western Blot 結果

將三組實驗動物治療4 w取材進行Western Blot檢測展神經小膠質細胞M1、M2型標志分子的表達水平。

B組的iNOS的表達較A組比較增加(P<0.05)，C組的iNOS與A組無統計學差異(P>0.05)；其中與B組相比，C組iNOS降低(P<0.05)；同時B、C組的IL-1β的表達較A組比較均增加(P<0.05)，其中與B組相比，C組IL-1β降低(P<0.05)。而與A組相比，B、C組Arginase表達均增加(P<0.05)，其中C組的Arginase較B組表達增加(P<0.05)，BDNF在B、C組的表達均增加(P<0.05)，C組的BDNF較B組表達增加(圖3)。

圖1 Beagle犬展神經

Fig 1 Nerve of Beagle dog model

圖2 展神經損傷后眼球位置

Fig 2 The position of the eyeball after nerve injury

圖3 電針刺激對小膠質細胞M1、M2型標志分子表達

Fig 3 Expression of M1 and M2 marker molecules on microglia stimulated by electroacupuncture

表1 電針刺激對小膠質細胞M1、M2型標志分子表達比較

Tab 1 Comparison of electroacupuncture stimulation on expression of M1 and M2 type markers in microglia

GroupiNOSIL-1βArginaseBDNF Group A0.11±0.930.02±1.290.25±1.140.05±1.08 Group B0.31±0.89a0.09±1.15a0.38±1.03a0.49±0.78a Group C0.14±1.01b0.05±0.91ab0.67±0.89ab0.82±0.68ab

Note:aP<0.05,vsGroup A;bP<0.05,vsGroup B.

討論

外展神經損傷病因較為復雜，由多種因素導致支配神經受損引起眼球運動受限。目前的顯微外科手術治療展神經損傷的臨床療效有了較高的進步，但對于嚴重神經損傷的功能恢復仍不是滿意的解決方案。而針刺的基礎研究及臨床試驗均發現，電針刺激神經損傷有效地提高受損神經功能恢復率[6]。通過減輕損傷細胞炎癥反應、抑制神經細胞凋亡、改善代謝微環境，調節炎性因子釋放，從而促進神經再生、阻斷炎癥級聯反應[7]。目前較多學者在針刺治療周圍神經損傷的研究主要集中在面神經和坐骨神經損傷修復，在動眼神經損傷修復亦有相關研究。同時利用電針刺激外展神經麻痹亦取得了較好的療效，但關于針刺促進外展神經修復機制研究較少。

當內環境細胞因子水平的改變、侵染病原體的類型、刺激的強度與時間等應激狀態出現，小膠質細胞最先啟動免疫反應。通過產生一系列的免疫受體：①Toll樣受體(toll like receptors, TLRs)能夠使缺血性損傷惡化，但是缺血性損傷前TLRs短暫激活卻能降低繼發損傷[8]；②核苷酸結合寡聚化結構域(nucleotide-binding oligomerization domains, NODs)、NOD樣受體和多種清道夫受體等，對于神經元凋亡及認知功能產生影響，目前主要研究于阿爾茨海默病(Alzheimer disease, AD)，同時產生多種炎性因子TNF-α、IL-6、IL-1β、IFN-γ和多種趨化因子[9]，表現為M1型。有研究表明M1型小膠質細胞關鍵性標記物為iNOS。iNOS能夠利用精氨酸產生NO，與過氧化物反應形成過氧亞硝基陰離子，產生細胞毒性[10]。在消滅病原體的同時，還通過氧化應激反應釋放氮基團與活性氧自由基對神經元起到強烈的神經毒性作用[11]。而IL-1β與IL-1受體結合后，激活NF-κB通路促進炎癥發生[12]。M2型小膠質細胞能誘發一系列的抗氧化反應，上調血紅素氧合酶-1(heme oxygenase-1, HO-1)表達，抑制缺血后活性氧產生[13]。M2型小膠質細胞還能夠通過IL-10發揮負反饋作用，抑制促炎因子IL-1β、IL-6和TNF-α產生，上調神經生長因子(nerve growth factor, NGF)表達，抑制Caspase-3活性，減少神經元死亡[14]。新生神經元的存活易受微環境的影響。小膠質細胞能夠通過P2X4R釋放BDNF，促進新生神經元存活[15]。Arginase和Ym1能預防細胞外基質降解[16]。M2型小膠質細胞能夠去除異常的突觸，促進功能性突觸形成而發揮神經保護作用[17]。

我們課題組在前期研究中已經成功建立Beagle犬展神經損傷的動物模型，通過顳底入路，術后試驗動物生存較滿意，無嚴重感染、癲癇等危重并發癥，除展神經損傷所致的眼球運動障礙外，未觀察到合并其它神經功能障礙表現[18]。建模成功后用電針刺激展神經，術后4 w開始Beagle犬的瞳孔中心至外眥內側緣距離明顯縮小，外直肌功能開始恢復，認為電針刺激可以明顯促進損傷的展神經恢復[19]，我們猜測4 w是展神經小膠質細胞從M1型轉化為M2型進行活化的關鍵時刻。通過Western Blot檢測，我們發現C組M1型標志分子iNOS和IL-1β的表達較B組顯著降低，表明電針刺激能夠抑制小膠質細胞活化為M1型。而C組Arginase和BDNF表達較B組增多，電針刺激能夠顯著升高M2型轉化。

綜上所述，我們的研究從切斷展神經軸突作為損傷因素，通過觀察電針刺激后其對小膠質細胞表型的影響。但是試驗中我們保持神經鞘膜完性，保留了神經電活動的傳導連續性，而小膠質細胞的活化狀態是受多種因素綜合影響的，包括應激因素的種類、程度、時間等，包括活化過程依賴的細胞種類，接受神經元損傷程度的信號程度等，值得我們繼續深入研究。