人巨細胞病毒IE1-72蛋白在膠質瘤中的表達及臨床意義

丁大領 吳力新 張風江 郭宗澤 龐長河 劉獻志 孫劍瑞*

(1鄭州大學第一附屬醫院神經外科，河南 鄭州 450052; 2中國醫科大學附屬第一醫院神經外科，遼寧 沈陽110001)

腦膠質瘤是最常見的原發性顱內腫瘤，約占腦腫瘤的80%，具有侵襲性并且缺乏有效的治療措施，而對于高級別腦膠質瘤患者的平均生存期一般只有12～15 個月，雖然手術及術后給于輔助治療，但總體療效仍很差[1-3]。人巨細胞病毒(human cytomegalovirus, HCMV)屬于皰疹病毒 β 亞科，在人群中廣泛傳播， 病毒感染無季節性區別，全年皆可發生。我國是世界上 HCMV 感染率最高的國家之一，在普通人群中感染率80%以上，懷孕婦女原發或繼發的 HCMV 感染可造成胎兒畸形、智力低下或發育遲緩等，嚴重者甚至可引起巨細胞包涵體病[4-5]。近年來，關于HCMV感染和腦膠質瘤的研究越來越多，并且存在較大的爭議，本文通過分析人巨細胞病毒IE1-72蛋白在膠質瘤中的表達情況并且與患者預后的關系，為膠質瘤的發病機制提供理論依據。

材料與方法

一、一般資料

選擇2007年1月至2016年12月鄭州大學第一附屬醫院和中國醫科大學附屬第一醫院神經外科接受手術治療的腦膠質瘤組織標本89例，其中男55例，女34例，平均年齡(43.8±12.7)歲。對照組標本來自于原發性癲癇病灶切除術后腦組織。病理學診斷依據世界衛生組織(WHO)中樞神經系統腫瘤分級標準(2016年)[6]，WHO III級和Ⅳ級為高級別膠質瘤。所有患者均未接受過放、化療及免疫治療等相關治療(表1)，所有患者通過電話詢問或定期來院復查隨訪。隨訪8～36個月，中位隨訪時間為19個月。

二、免疫組織化學方法檢測HCMV IE1-72蛋白的表達

選取典型的腦膠質瘤組織蠟塊進行連續性切片，厚度4 μm，并放入68 ℃烤箱中烘烤20 min。石蠟經二甲苯脫蠟和不同濃度的乙醇水化后，3% H2O2室溫孵育10 min，檸檬酸緩沖液高溫高壓抗原修復2.5 min，阻斷內源性過氧化物酶活性，并血清封閉。每張切片甩去多余血清后滴加50 μL已稀釋鼠抗人IE1-72抗體 (Abcam, ab30924, 濃度為1 ∶40)，4 ℃孵育過夜。4 ℃過夜后需在37 ℃復溫45 min，1×PBS洗3次。生物素標記二抗孵育和鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶孵育各20 min，DAB顯色，顯微鏡下控制染色時間，蘇木素核復染及返藍，中性樹膠封片，系統顯微鏡下分析照相。

三、結果判定

以細胞質或細胞核中出現棕黃色或者棕褐色顆粒為陽性，根據染色陽性細胞所占百分比和染色強度進行半定量分析。染色強度由兩位研究員分別獨立評分。每張切片選取5個不同的高倍視野進行觀察，每個視野進行隨機計數200個腫瘤細胞。染色強度評分(0分為無染色；1分為弱染色，淺黃色；2分為中度染色，黃褐色；3分為重度染色，棕黃色)和陽性細胞百分數評分(0分為陰性0%～1%；1分為陽性細胞數2%～25%；2分為陽性細胞數26%～50%；3分為陽性細胞數51%～75%；4分為陽性細胞數>75%)。染色指數=染色強度×染色陽性腫瘤細胞×比例。在染色指數評分大于4分，定義為高表達，染色指數評分小于4分，認為低表達。

四、統計學方法

采用SPSS 19.0統計軟件進行統計學分析HCMV IE1-72蛋白表達水平與患者年齡、性別、病理級別的關系采用Spearman等級相關分析，HCMV IE1-72蛋白表達水平在膠質瘤與對照腦組織之間差異采用Wilcoxon秩和檢驗，構建Cox回歸模型，分析HCMV IE1-72蛋白的表達水平與腦膠質瘤患者無進展生存期的關系。采用χ2檢驗計算各組之間的差異，以P<0.05認為有顯著性差異，有統計學意義。

圖1 HCMV IE1-72蛋白在腦膠質瘤和對照腦組織中的表達情況(免疫組化，×200)

Fig 1 HCMV IE1-72 protein expression in glioma and control brain tissues (IHC, ×200)

A: Astrocytoma (Grade II); B: Astrocytoma (Grade III); C: Glioblastoma tissues; D: Normal human brain tissues.

結 果

一、HCMV IE1-72蛋白在腦膠質瘤中表達

采用免疫組化方法檢測89例腦膠質瘤組織中和10例對照腦組織標本中HCMV IE1-72蛋白的表達情況(圖1A～D)，結果發現76.4%的(68/89)膠質瘤組織中出現HCMV IE1-72蛋白陽性反應，主要位于細胞核和(或)細胞質中，其中75.0%(24/32)Ⅱ級星形細胞瘤、70.9%(22/31)Ⅲ級星形細胞瘤和84.6%(22/26)膠質母細胞瘤中出現陽性表達，在腫瘤壞死組織及瘤周正常腦組織中無陽性表達，同時對照腦組織標本中也沒有HCMV IE1-72蛋白表達(表1)，HCMV IE1-72蛋白在腦膠質瘤中的表達水平明顯高于對照腦組織(Z=-4.915,P=0.000)。另外HCMV IE1-72蛋白免疫染色強度與腦膠質瘤患者的性別(r=0.059，P=0.586)、年齡(r=0.045，P=0.675)無明顯的相關性。

二、HCMV IE1-72蛋白表達水平與腦膠質瘤病理級別的關系

在免疫組化半定量分析中，40.6%(13/32)的II級星形細胞瘤，51.6%(16/31)的III級星形細胞瘤和53.8%(14/26)的膠質母細胞瘤組織中出現HCMV IE1-72蛋白高度表達，高級別腦膠質瘤(Ⅲ～Ⅳ級)細胞核及細胞質中有較高的HCMV IE1-72蛋白表達，但我們發現HCMV IE1-72蛋白免疫染色強度與腦膠質瘤病理級別(r=0.112，P=0.295)無明顯的相關性。同時，不同腦膠質瘤組織中HCMV陽性表達的腫瘤細胞數與染色強度具有較大差異，甚至在同一標本的不同染色部位結果也不相同。

表1 89名腦膠質瘤患者的臨床特征和HCMV IE1-72蛋白的表達情況

Tab 1 Clinical features of 89 patients and the expressions of HCMV IE1-72 protein in glioma

Clinical featureCasesn% Total89 Sex Male5561.8 Female3438.2 Age (years) 10～403134.8 40～605056.2 ≥6089.0 Extent of resection Gross total removal6674.2 Residue<30%2325.8 IE1-72 Positive6876.4 Negative2123.6 Tumor grade Grade Ⅱ3235.9 Grade Ⅲ3134.8 Grade Ⅳ2629.3

三、HCMV IE1-72蛋白表達水平與腦膠質瘤患者的預后關系

雖然HCMV IE1-72蛋白在腦膠質瘤組織中不同程度的表達，但不同級別腦膠質瘤之間HCMV IE1-72蛋白表達量無顯著性差異，同時我們決定評估在HCMV IE1-72蛋白陽性表達和無HCMV IE1-72蛋白表達的兩組膠質瘤患者中其預后結果是否具有差異性。我們使用Kaplan-Meier生存分析方法，發現腦膠質瘤患者中IE1-72蛋白低表達組和高表達組患者的PFS無相關性(χ2=2.710，P>0.05)。見圖2。

圖2 腦膠質瘤組織中IE1-72蛋白低表達組和高表達組Kaplan-Meier生存曲線

Fig 2 Kaplan-Meier survival analysis chart of IE1-72 protein in glioma tissue of low expression group and high expression group

討論

腦膠質細胞瘤是最普遍的惡性腫瘤之一，并且缺乏有效的治療方法[2,6]，在我國其年發病率為5/10萬，且發病率呈持續上升趨勢。腦膠質瘤有高度浸潤性生長的特點，術后發生復發轉移的概率相當高并難以根治[7]。因此，怎樣有效地抑制腦膠質瘤的復發已成為研究的熱點。近年來研究顯示，人巨細胞病毒(HCMV)感染與腦膠質瘤的關系存在較大的爭論[8-13]。

HCMV屬于雙鏈線性結構的β亞科皰疹病毒，大小約為240 kb。HCMV在人群中廣泛傳播，感染無季節性區別。我國是世界上 HCMV感染率最高的國家之一，我國成人感染率接近100%。在人類個體不同發育時期，HCMV主要侵染的器官及細胞不同，在胎兒及新生兒時期，主要感染神經系統、腎臟上皮細胞；而在兒童時期，主要侵染淋巴組織。懷孕婦女原發或繼發的 HCMV感染可造成胎兒畸形、智力低下等，嚴重者甚至可引起巨細胞包涵體病[4-5,9]。

最近有學者發現HCMV感染存在于人類多種不同類型的腫瘤組織中，Cobbs CS[8]等人采用免疫組化法對不同級別腦膠質瘤組織中 HCMV IE1-72抗原的表達進行分析，結果顯示抗原陽性率為100%。Mitchell DA[13]等研究發現， 90%以上的膠質母細胞瘤組織中可檢測到 HCMV基因組及其蛋白。Harkins等[14]研究發現在32例原發性和浸潤性導管癌的上皮腫瘤中，運用免疫組化方法檢測到97%出現HCMV IE的表達。同時Harkins等[15]也檢測了來自45份結腸息肉、結腸腺癌患者病變組織、病變相鄰組織及正常黏膜組織的標本，結果發現結腸腺癌患者的HCMV IE1-72抗原檢出率為80%，而對同一患者腫瘤毗鄰的以及遠離腫瘤的正常結腸黏膜的HCMV IE1-72抗原檢測卻為陰性。盡管如此，HCMV感染與腦膠質瘤的關系目前仍存在較大爭論，部分學者通過免疫組化、巢式PCR、原位雜交等技術在腦膠質瘤組織中卻不能檢測到該病毒的表達[16-18]。本研究通過免疫組化法發現76.4%細胞核和(或)細胞質中出現HCMV IE1-72蛋白陽性表達，其中75.0% II級星形細胞瘤、70.9% III級星形細胞瘤以及84.6%膠質母細胞瘤組織中出現陽性表達；但在對照腦組織標本中沒有發現HCMV IE1-72蛋白陽性表達，腦膠質瘤組織與對照腦組織的表達有顯著性差異(P<0.05)，本研究與Mitchell DA、Cobbs CS[8,13]等研究一致。同時本研究結果發現不同級別腦膠質瘤中HCMV IE1-72蛋白表達差異性沒有統計學意義，在高級別腦膠質瘤(Ⅲ～Ⅳ級)細胞核及細胞質中卻有較高的HCMV IE1-72蛋白表達。這些研究結果表明了 HCMV 感染在膠質瘤的發生發展中產生影響。但我們通過進一步生存分析發現HCMV IE1-72蛋白表達水平與膠質瘤患者的PFS無相關性(P>0.05)。

前期一些研究成果發現HCMV感染人體后，可以潛伏于宿主的特定細胞，形成持續的潛伏感染，與宿主長期共存并且還可以對宿主細胞的增殖、分化、遷移、侵襲等產生影響[8]。我們認為HCMV感染在腦膠質瘤的發生發展中起到一定的作用，但HCMV感染對腦膠質瘤細胞的增殖和侵襲的影響是一個復雜的過程，本研究可以為理解膠質瘤的形成和進展機制提供理論依據，并可以為治療膠質瘤提供新的有效靶點。