多糖硫酸酯抗凝血涂層應用于高分子醫用管路

楊雪純 ，于美麗 ，高文卿

（1.天津醫科大學三中心臨床學院，天津市人工細胞重點實驗室，天津300170；2.天津醫科大學研究生院，天津300070；3.天津市第三中心醫院，天津市人工細胞重點實驗室，天津300170；4.天津市第三中心醫院心臟中心，天津300170）

抗凝血涂層技術是利用化學或物理的方式，將抗凝物質牢固地結合在管路的內表面，抗凝血涂層技術的應用可以減少血液凈化過程中的炎癥反應，提高管路系統的生物相容性[1]。材料表面肝素化是提高材料表面血液相容性和生物相容性的有效手段。肝素是一種反應活性高、抗凝血性突出的天然抗凝劑，通過和抗凝血酶III、肝素結合蛋白和血小板因子等活性物質結合來發揮其抗凝血作用。研究顯示，肝素在具有抗凝血活性的同時，也具有抗血小板活性，可引發不正常出血等副作用，且存在攜帶動物致敏原或病毒等安全隱患[2]。本實驗目的在于尋找具有抗凝血生物活性的物質，作為肝素替代品，并試圖降低材料來源和制作的成本。肝素發揮抗凝血作用與分子結構的特異性、硫酸基含量以及負電性有關。多糖的單糖分子上羥基與硫酸反應可以得到多糖硫酸酯，抗凝血機制與肝素相似，而且多糖硫酸酯還具有抗腫瘤、抗病毒、抗氧化性和調節免疫能力等[3]，而且副作用低、生物相容性好、無毒無害，是一種良好的抗凝血劑。Anastase等[4]研究了葡聚糖衍生物和天然褐藻多糖中的免疫調節特性，證明了巖藻聚糖和右旋糖酐衍生物具有良好的免疫調節作用，可以作為新的抗凝血藥物或用于生物相容性材料涂層。

本研究在對醛基化海藻酸鈉抗凝血涂層的研究基礎[5-7]上，主要選取生物相容性較好的海藻酸鈉以及具有良好的抗炎性和抗病毒性的黃芪多糖和白芨多糖三種植物多糖，采用惰性化濃硫酸法對其進行硫酸化修飾，并采用共價鍵結合法將修飾后的多糖硫酸酯涂層物固定于體外循環管路材料表面。通過對涂層管路表面形態的分析和表面凝血時間的對比，篩選出抗凝效果較好的植物多糖硫酸酯。

硫酸酯化多糖是一類單糖分子上羥基被硫酸根取代的多糖，也稱硫酸多糖或多糖硫酸酯[8]。海藻酸鈉具有良好的生物相容性和抗凝血性，價格低廉，容易獲得，廣泛應用于醫學材料和生物工程領域。以硫酸酯基取代海藻酸鈉單糖上的羥基即得到海藻酸鈉硫酸酯，具有良好的抗凝血活性，可以降低血脂和血液粘稠度，還具有清除血漿脂蛋白和纖維蛋白原的作用。Fan等[9]研究了影響海藻酸鈉硫酸鹽取代度（DS）的因素，并發現高濃度和高取代度的海藻酸鈉硫酸酯能夠有效抑制內源性凝血途徑。黃芪多糖是一種免疫促進劑或調節劑，黃芪多糖單糖分子中的羥基與硫酸反應，在一定取代度范圍內，硫酸取代度越大，抗凝血活性越強[10]，同時黃芪多糖硫酸酯具有良好的抗病毒、抗腫瘤、抗輻射、抗氧化等作用[11]。白芨多糖具有收斂止血、消腫生肌等功效，俞林花等[12]發現，白芨多糖能夠有效促進成纖維細胞增殖和膠原的合成，從而可以促進潰瘍創面的愈合；陳景耀等[13]發現白芨多糖硫酸酯化處理后表現出很強的清除超氧陰離子自由基的作用，且在低濃度時表現出較強的清除羥基自由基的作用，而目前硫酸化白芨多糖在抗凝血方面并沒有深入的研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 海藻酸鈉（天津市光復科技有限公司）；白芨（河南世濟中藥材有限公司）；黃芪（四川名都藥有限公司）；氯化鈉（天津市光復科技有限公司）；乙醇（天津市中瑞潔康科技有限公司）；聚乙烯亞胺（SIGMA-ALDRICH，美國）；氰基硼氫化鈉（SIGMA-ALDRICH，美國）；98%濃硫酸（天津市光復科技有限公司）；亞硝酸鈉（SIGMA-ALDRICH，美國）。醫用PVC（天津市塑料研究所）；透析袋（天津市聯星生物有限公司）；24孔細胞培養板（Corning，美國）；離心機（Eppendorff，德國）；凝血自動分析儀（DiagnosticaStago，法國）；紅外分光光度計（NICOLET 6700，Thermo，美國）；掃描電鏡（Phenom，FEI Company，美國）。

1.2 實驗方法

1.2.1 植物多糖的提取

1.2.1.1 黃芪多糖的提取與純化：采用堿提醇沉的方法提取黃芪多糖[14]。精密稱取300 g黃芪并粉碎，向三頸燒瓶中加入水2 800 mL，95%乙醇150 mL，1 mol/L NaOH溶液，調節pH至12，浸泡24 h后，加熱至80～85℃，攪拌6 h后，過濾棄去殘渣，將上清液蒸發濃縮至1 500 mL，冷卻至室溫后，倒入2倍體積的95%乙醇中，有白色絮狀物析出，靜置，將上層清液倒出，取出沉淀，干燥，得粗提取黃芪多糖。

1.2.1.2 白芨多糖的提取與純化：采用水提醇沉的方法提取白芨多糖[15]。準確稱取240 g白芨并打碎，向三頸燒瓶中加入5 000 mL水，緩慢加入白芨粉末，控制溫度在75～80℃，攪拌4～5 h后，過濾棄去殘渣，得到白芨多糖提取物。將提取物加熱濃縮至3 000 mL，再倒入2倍體積的95%乙醇中，有白色絮狀物析出，靜置，將上層清液倒出，取出沉淀，干燥，得到粗提取白芨多糖。

1.2.2 多糖的硫酸化處理

1.2.2.1 海藻酸鈉硫酸酯（SAS）的制備：將海藻酸鈉脫水干燥。根據文獻[2,16]的方法，按照濃硫酸和海藻酸鈉物質的量之比為6：1，向濃硫酸中迅速加入海藻酸鈉，0℃攪拌反應4 h后，將反應體系調節pH至弱堿性，得到淡黃色的海藻酸鈉硫酸酯溶液。將所得溶液透析處理20 h，倒入2倍體積的95%乙醇中，有淡黃色沉淀析出。靜置，將沉淀濾出并干燥，得到硫酸化海藻酸鈉。

1.2.2.2 黃芪多糖硫酸酯（SAPS）的制備：采用與上述相同的方法制備黃芪多糖硫酸酯。

1.2.2.3 白芨多糖硫酸酯（SBPS）的制備：采用與上述相同的方法制備白芨多糖硫酸酯。

1.2.3 材料表面預處理和表面修飾

1.2.3.1 PVC管路材料酸化預處理：配制濃度分別為30%、50%和70%的酸溶液。將PVC管路材料剪成小段備用。將剪好的PVC管路材料浸入到不同濃度的酸溶液中，酸化處理5 min后，用蒸餾水沖洗干凈并干燥。選取透明度好、表面形態結構完整的PVC管路待用。

1.2.3.2 酸化PVC管路材料的聚氨基化處理：將酸處理后的PVC管路材料浸入質量分數為0.05%的PEI溶液中進行聚氨基化處理20 min，將處理后的管路材料取出，用蒸餾水清洗干凈并干燥。

1.2.3.3 涂層物的制備：將肝素鈉（效價為197.2單位/mg）充分溶解于去離子水中，加入一定量亞硝酸鈉，在酸性條件下冰浴攪拌反應2 h；調定溶液pH至中性，得到低分子肝素鈉（LMWH）溶液；將所得LMWH溶液進行透析處理24 h，其間更換去離子水3次，濾出分子量過小的低分子肝素[17]。

用同樣的方法對海藻酸鈉硫酸酯、黃芪多糖硫酸酯及白芨多糖硫酸酯進行醛基化處理。

1.2.3.4 材料的表面修飾：配制不同濃度的多糖硫酸酯涂層物溶液。配制0.1 g/L LMWH溶液。向各反應體系中加入1.75 g NaCl和20 mg NaBH3CN充分混勻，調節溶液pH為3.5，將PVC管路材料浸沒入反應液中，40℃恒溫水浴震蕩反應2 h。取未經處理的PVC管路材料，浸入相同體積的蒸餾水中，在相同條件下處理2 h。

1.2.4 涂層表面形貌及功能基團分析

1.2.4.1 涂層表面形貌分析：將涂層后的管路材料充分干燥，剪開管路暴露出涂層表面，樣品表面噴金，通過掃描電鏡觀察涂層前后材料表面形貌變化。

1.2.4.2 涂層表面功能基團特性分析：將涂層后的管路材料充分干燥，剪開管路暴露出涂層表面，用紅外探頭掃描涂層前后材料表面，分析涂層表面的特征基團；紅外掃描波長范圍650～4 000 nm。

1.2.5 涂層表面凝血時間測定 取健康新鮮全血，離心處理10 min，獲得貧血小板血漿（Platelet-poor plasma，PPP），測定凝血常規四項，即部分凝血活酶時間（APTT）、凝血酶原時間（PT）、凝血酶時間（TT）和纖維蛋白原（FIB）；將不同涂層材料剪成表面積約為0.25 cm2的碎片，置于24孔培養板內；每個涂層樣品孔中分別加入PPP，37℃條件下恒溫孵育反應2 h；取出孵育后的血漿，加入離心管內，再次測定四項凝血常規指標，計算并分析每組樣品凝血時間差值和變化。

1.2.6 實驗分組 根據涂層物類型和涂層物濃度將實驗分為以下組：空白對照組（Em組）、低分子肝素組（LMWH組）、硫酸化海藻酸鈉組（SAS1組、SAS2組、SAS3組）、硫酸化黃芪多糖組（SAPS1組、SAPS2組、SAPS3組）、硫酸化白芨多糖（SBPS1組、SBPS2組、SBPS3組）。為保證硫酸酯化反應過程中濃硫酸的量的充足和實驗操作的安全性，初選取磺化劑中濃硫酸和多糖的物質的量之比為6：1。

表1 不同多糖硫酸酯涂層物種類和濃度Tab 1 Variety and concentration of different polysaccharides sulphate coating

1.3 統計學方法 本文中的數據統計與分析使用SPSS 23.0軟件和Origin 8.0軟件完成。

2 結果

2.1 酸化預處理表面篩選 觀察酸化預處理后材料透明度和表面形態的完整性，篩選出經30%酸溶液預處理的PVC管路材料。

2.2 涂層表面形貌及功能基團分析 使用掃描電鏡對涂層表面形態進行分析，LMWH涂層（b）分布較均勻，海藻酸鈉硫酸酯涂層（c-e）分布較不均，黃芪多糖硫酸酯涂層（f-h）和白芨多糖硫酸酯涂層（i-k）分布相比前者較均勻，管路材料表面紋理清晰可見；涂層管路和未涂層管路相比，表面可見明顯涂層物，但表面結構未有明顯變化，可見涂層過程未破壞管路材料表面的物理結構（見圖1）。

圖1 涂層管路材料表面形貌分析Fig 1 Surface morphology analysis of coated pipeline material

2.3 涂層表面功能基團特性分析 通過紅外光譜法檢測到多糖涂層管路組和肝素涂層管路組在波長約為3 400 cm-1處均有一個較淺的特征吸收峰，而空白對照組沒有這個吸收峰，表明實驗中多糖硫酸酯和低分子肝素均可以固定在管路材料表面。波長為1 020 cm-1處為硫酸根基團（-SO3）的反對稱伸縮振蕩吸收峰，通過紅外光譜可以看出，多糖硫酸酯涂層組和低分子肝素涂層對照組具有硫酸根基團的吸收峰，而空白對照組沒有，說明通過硫酸化處理后的多糖硫酸酯具有與低分子肝素抗凝血作用相同的硫酸根基團（-SO3），并且已經固定于材料表面（圖 2）。

圖2 涂層管路材料紅外表征圖Fig 2 Infrared characteristics of coated pipeline materials

2.4 涂層表面凝血功能評價 通過對反應前后以及不同涂層材料凝血常規指標的分析，空白對照組和未經涂層組對比，APTT未見明顯差異，而LMWH組 APTT 明顯延長（P＜0.05）（表 2）?？梢娊涍^涂層的管路APTT均顯著高于多糖空白對照組，說明材料表面的抗凝血性能有明顯改善（P＜0.05）。SAS1、SAS2 組（表 3）、SAP1、SAPS2 組（表 4）和 SBPS1、SBPS2組（表5）3種多糖硫酸酯涂層的管路之間APTT無顯著性差異（P＞0.05），但均顯著長于空白對照組（P＜0.05）。SAS3、SAPS3和SBPS3之間APTT未有明顯差異（P＞0.05），但均長于空白對照組和單一多糖涂層組（P＜0.05），且與LMWH涂層組相比APTT無顯著性差異（P＞0.05）。說明多糖硫酸酯涂層組和多糖硫酸酯-LMWH復合涂層組均有良好的抗凝血性能。

表2 對照組材料表面凝血四項（±s,n=6）Tab 2 Four items of clotting routine of Material surface in control group（±s,n=6）

表2 對照組材料表面凝血四項（±s,n=6）Tab 2 Four items of clotting routine of Material surface in control group（±s,n=6）

涂層種類未涂層 空白對照 L M W H涂層P T-s e c 6 1 2.8±1.0 0 1 3.4±1.2 1 1 6.1±1.5 4 A P T T 6 3 5.9±2.3 5 3 6.9±4.1 1 7 1.6±1 6.6 T T 6 1 3.3±4.4 9 1 8.2±1.4 2 4 9.5±8.6 1 F I B-s e c 6 1 7.8±1.0 0 1 6.7±4.5 1 1 4.6±3.2 0 n

表3 海藻酸鈉硫酸酯涂層凝血四項（±s,n=6）Tab 3 Four items of clotting routine of Sodium alginate sulphatecoating（±s,n=6）

表3 海藻酸鈉硫酸酯涂層凝血四項（±s,n=6）Tab 3 Four items of clotting routine of Sodium alginate sulphatecoating（±s,n=6）

涂層種類S A S 1 S A S 2 S A S 3 P T-s e c 6 1 4.7±1.0 7 1 3.8 8±0.8 4 1 4.7±1.0 5 A P T T 6 4 4.6±2.8 8 4 4.1 5±1.0 6 6 4.2±1 3.6 7 T T 6 1 9.4±1.9 4 1 2.4 8±3.1 5 5 0.6±1 4.9 4 F I B-s e c 6 1 3.0±2.3 2 2 0.4 5±1.2 4 1 5.9±4.2 9 n

表4 黃芪多糖硫酸酯涂層凝血四項（±s,n=6）Tab 4 Four items of clotting routine of Astragalus polysaccharide sulfate coating （±s,n=6）

表4 黃芪多糖硫酸酯涂層凝血四項（±s,n=6）Tab 4 Four items of clotting routine of Astragalus polysaccharide sulfate coating （±s,n=6）

涂層種類S A S 1 S A S 2 S A S 3 P T-s e c 6 1 4.2±0.4 6 1 3.9 8±1.3 3 1 5.1±0.7 1 A P T T 6 4 4.6±2.8 8 4 2.1 3±3.7 1 7 9.9±8.4 1 T T 6 1 8.7±1.5 7 1 3.2 0±4.0 4 1 0 4.4±5 6.2 8 F I B-s e c 6 1 4.8±3.4 4 1 9.4 8±1.2 2 1 3.8±3.6 1 n

表5 白芨多糖硫酸酯涂層凝血四項（±s,n=6）Tab 5 Four items of clotting routine of Bletillastriata polysaccharide sulfate coating （±s,n=6）

表5 白芨多糖硫酸酯涂層凝血四項（±s,n=6）Tab 5 Four items of clotting routine of Bletillastriata polysaccharide sulfate coating （±s,n=6）

涂層種類S A S 1 S A S 2 S A S 3 P T-s e c 6 1 4.0±0.7 1 1 3.2 0±0.6 9 1 5.4±1.7 3 A P T T 6 4 5.1±5.7 7 4 3.4 0±3.5 1 7 6.2±7.4 2 T T 6 1 8.2±1.0 3 1 4.8 5±3.2 7 5 6.8±2 6.8 4 F I B-s e c 6 1 9.1±4.4 3 1 7.8 0±0.8 0 1 1.6±4.4 4 n

3 討論

高文卿[5-7]、李金友[18-19]等分別制備了醛基化海藻酸鈉-肝素復合涂層和氧化海藻酸鈉涂層，均取得了良好的抗凝血效果。本研究在此基礎上采用濃硫酸法修飾植物多糖，并制備了多糖硫酸酯涂層。研究結果顯示，天然植物多糖經硫酸酯化修飾后，可以獲取植物多糖硫酸酯，具有一定的抗凝血功能。紅外譜圖掃描顯示3種多糖硫酸酯及LMWH均已固定于材料表面，證實了經過重氮化處理可以使多糖硫酸酯及LMWH分子帶有活性醛基，帶有醛基的多糖硫酸酯及LMWH與經過酸化和聚氨基化預處理的聚氯乙烯管道進行了有效的共價交聯。掃描電鏡觀察發現涂層過程并未改變材料表面的物理結構。

在血液相容性評價實驗中，LMWH涂層物通過阻斷內源性凝血途徑可顯著延長凝血時間，具有顯著抗凝效果，主要表現為APTT明顯延長。海藻酸鈉硫酸酯涂層物、黃芪多糖硫酸酯和白芨多糖硫酸酯均可延長APTT時間，具有一定的抗凝效果，3種多糖硫酸酯涂層物的抗凝血性能并無顯著性差異，考慮實驗中選取的涂層濃度較低。SAS-LMNH復合涂層、SAPS-LMWH復合涂層和SBPS-LMWH復合涂層抗凝效果劣于LMWH涂層，但同樣可顯著延長APTT及TT時間，具有較好的抗凝效果。經涂層的材料表面主要表現為APTT明顯延長，證實了多糖硫酸酯的抗凝血機制與低分子肝素相似，通過阻斷內源性凝血途徑保持了良好的抗凝功效。

本研究通過定性和定量分析，初步證明了植物多糖硫酸酯制備抗凝血涂層的可行性。天然植物多糖經硫酸酯化處理后，可以具有良好的抗凝血性質，并且通過共價交聯的方式與管路材料有效結合，發揮抗凝血作用。對于具有促凝血作用的白芨多糖，經硫酸化處理后，被證實具有抗凝血性，為多糖修飾研究提供了新思路。濃硫酸法操作簡單，不會產生有機溶劑污染，但有研究表明該方法修飾所獲得的多糖硫酸酯取代度較低，因此硫酸化修飾的不同方法和條件對多糖生物活性的影響需做進一步探究。此外，多糖硫酸酯涂層在不同高分子醫用材料中的應用價值，以及涂層材料的抗病毒性、抗炎性以及穩定性等安全特性，有待進一步研究驗證。