MiR-148a-3p通過靶向SRPK2抑制結腸癌細胞轉移

王小東，馬博昭，戚峰

（天津醫科大學總醫院普通外科，天津300052）

隨著生活水平的提高和生活方式的改變，結直腸癌（colorectal cancer，CRC）的發病率每年都在增加[1]。腫瘤轉移是CRC患者喪失手術機會的最重要原因之一。大約20%～25%的患者在初次診斷CRC時出現肝轉移，40%～50%的患者在切除原發性CRC后發生肝轉移[2]。盡管目前CRC的診斷和治療方法取得了顯著進展，腫瘤轉移仍是影響結腸癌患者生存的重要因素[3]。目前，術后化療是Ⅲ期結腸癌患者的標準治療[4]。因此，尋找和開發結腸癌中的靶向治療劑具有重要的意義。

MicroRNA （miRNA/miR）代表一組獨特的非編碼RNA分子，其通過與信使RNA（message RNA，mRNA）的3′-UTR區結合而轉錄后調節基因表達，導致翻譯抑制或mRNA降解[5]。越來越多的證據表明，miRNA失調與許多人類疾病有關，并且與各種腫瘤的增殖和轉移密切相關，包括CRC[6]、乳腺癌[7]、肺癌[8]和胃癌[9]。很多研究已經證明，CRC中有很多miRNA 的變化。例如，miR-135a、miR-137、miR-143、miR-148a-3p和 miR-31[10-12]。MiR-135a可以通過影響p21和周期蛋白D2影響結腸癌細胞的增殖[13]。MiR-143過表達可以抑制結腸癌增殖，促進結腸癌細胞凋亡[14]。已經有研究顯示，miR-148a-3p在早期復發II期和Ⅲ期結直腸癌根治術后具有重要的臨床意義。MiR-148a-3p的失調發生在多種腫瘤中，如胰腺癌[15]、胃癌[16-18]、非小細胞肺癌[19]、乳腺癌[20]和鼻咽癌[21]等。MiR-148a-3p通過抑制DNA甲基化酶Ⅰ的表達抑制胃癌的轉移和侵襲[18]。MiR-148a-3p可以通過引導DNA甲基化從而調節乳腺癌表面雌激素受體的表達[20]。但是目前，miR-148a-3p對結腸癌的作用研究還很少，發揮作用的機制也不完全清楚。

富含絲氨酸/精氨酸蛋白特異性激酶（Serine/Arginine-rich protein specific kinases，SRPK），如SRPK1和SRPK2，可以磷酸化可變剪接因子/剪接因子2并調節細胞周期[22]。對于SRPK2，其發揮的主要作用是促進腫瘤細胞的轉移[23]。但是目前SRPK2在結腸癌中的表達的調控機制還不完全清楚。

在本研究中，筆者發現相對于正常結直腸粘膜上皮細胞，miR-148a-3p在結腸癌細胞中表達降低，SRPK2在結腸癌細胞中表達增高。在結腸癌細胞中過表達miR-148a-3p可以抑制結腸癌細胞的遷移及侵襲能力。相反的，miR-148a-3p inhibitor可以增強結腸癌細胞的遷移及侵襲能力。同時，miR-148a-3p可以影響結腸癌細胞上皮-間質轉化。熒光素酶報告系統結果顯示，SRPK2是miR-148a-3p的直接作用靶點。MiR-148a-3p過表達可以抑制SRPK2 mRNA和蛋白的表達，而miR-148a-3p敲低時，SRPK2 mRNA及蛋白表達增高。MiR-148a-3p通過調控SRPK2表達可能是影響結腸癌細胞轉移的機制之一。

1 材料與方法

1.1 細胞培養 人結腸癌細胞系（SW480，S

W620，LOVO和HCT-116）和人正常結直腸上皮細胞系FHC從中國科學院（中國上海）購買或本實驗室凍存。用含有10%胎牛血清（FBS）的DMEM培養基，在37℃，含有5%CO2的培養箱中培養細胞。培養基每2 d更換1次。

1.2 細胞轉染 轉染前，將2.5×104個細胞接種到6孔板的每個孔中并孵育24 h，然后棄去培養基。用100 nmol/L miR-148a mimic（Ribobio，廣州，中國）或200 nmol/L miR-148a inhibitor（Ribobio，廣州，中國）及對應的陰性對照（negtive control，NC）轉染細胞。使用Lipofectamine 2000試劑促進轉染（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）。

1.3 劃痕和transwell侵襲實驗 通過劃痕和帶有Matrigel（BD Bioscience，USA）基質膠的transwell小室檢測細胞遷移和侵襲能力。對于劃痕實驗，將轉染后的細胞接種于6孔板中，當細胞達到90%匯合時，吸出培養基并用磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗兩遍。在含有1%FBS的培養基中饑餓培養過夜后吸出培養基。用200 μL移液管尖端在單層細胞表面劃出三條平行的劃痕，用PBS洗滌細胞以除去碎片，并培養24 h觀察劃痕距離。對于transwell侵襲實驗，將200 μL含有1×105個細胞的無血清培養基加入上室中，并將600 μL含有10%胎牛血清（FBS）的培養基加入到下室中。在37℃培養24 h后，除去基質膠，將穿透基質膠并到達基底膜的細胞在4%多聚甲醛中固定，用0.1%結晶紫染色10 min，并在倒置顯微鏡下計數細胞數。

1.4 熒光素酶報告系統 將結合miR-148a-3p的野生型（Wt）或突變型（Mut）SRPK2序列克隆到pGL3 Basic載體（Promega）中。將293T細胞接種在24孔板中48 h后，將10 μg pLUC-Wt-SRPK2或pLUC-Mut-SRPK2與miR-148a-3p mimic或inhibitor（Ribobio，廣州，中國）共轉染到 293T 細胞中。培養箱中培養24 h，裂解細胞并檢測熒光素酶活性（Promega，USA）。

1.5 RNA提取和定量實時PCR（qRT-PCR） 通過RNA提取試劑盒（QIAGEN，上海，中國）提取總RNA，并將1 μg總RNA添加至20 μL的反應系統中。GoScript Reverse Transcription試劑盒（Promega，USA）用于HOTAIR的逆轉錄，miR-148a-5p通過莖環法逆轉錄（QIAGEN，Shanghai，China）。 GAPDH和U6作為內參。引物序列如下：

miR-148a-3p，上游，5′-GCTAGCCTCCGAAGCAAACAATGAAA-3′，下游，5′-AAGCTTCGTCTACAAGGACTAACCGAAA-3′；

SRPK2，上游，5′-AGCTGGGATTATAGGCGCAT-3′，下游，5′-TTGTTAGGGGAGGGAGCTTG-3′；

Vimentin， 上 游 ，5′-CATTGAGATTGCCACCTAC-3′，下游，5′-CGTTGATAACCTGTCCATC-3′；

E-cadherin，上游，5′-AGAACGCATTGCCACATACA-3′，下游，5′-GAGGATGGTGTAAGCGATGG-3′；

N-cadherin，上游，5′-ATGAAAGACCCATCCAC G-3′,下游,5′-CCTGCTCACCACCACTA-3′；

GAPDH：上游，5′-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3′，下游 5′-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3′；

U6：上游，5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游，5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。PCR 反應進行40個循環，并使用2-ΔΔCt方法計算RNA相對表達。

1.6 蛋白質印跡分析（Western blot） 使用RIPA裂解液裂解CRC細胞以獲得總蛋白。每個樣本40μg總蛋白分別加入10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）的樣本孔中進行凝膠電泳，電泳結束后將蛋白質轉移到聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜，Millipore，USA）上。用0.5%牛血清白蛋白封閉具有印跡蛋白的膜2h，然后用抗E-cadherin抗體（1∶1500，Cell Signaling Technology（CST），USA），抗 N-cadherin 抗體（1：1 500，CST，USA），抗 Vimentin 抗體（1∶1 500，CST，USA），抗 SRPK2 抗體 （1∶1 500，R&D Systems，USA） 或抗-β-actin 抗體（1∶3 000，CST，USA），4℃過夜孵育。洗滌膜3次并在室溫下用稀釋的辣根過氧化物酶（HRP）標記的二抗（1∶2 500，CST，USA）孵育2 h。使用化學發光檢測試劑盒（Millipore，USA）檢測免疫反應性蛋白質條帶。通過G-Box系統（Syngene，USA）獲得圖像并通過Image J軟件（美國國立心理健康研究所，USA）進行分析。

1.7 統計學分析 使用t檢驗或單因素方差分析（ANOVA）分析連續數據。所有數據均使用Statistic Package for Social Science軟件（SPSS 19.0，USA）和GrapPad Prism（GraphPad Software，Version 5.0，USA）進行統計學分析。所有數據以±s表示，P＜0.05表示有統計學意義。每個實驗均進行了3次獨立實驗。

2 結果

2.1 miR-148a-3p結腸癌細胞系中低表達，SRPK2在結腸癌細胞系中高表達 首先檢測了人結腸癌細胞中與人正常結直腸粘膜細胞FHC中miR-148a-3p及SRPK2的表達情況。結果顯示，相對于FHC，結腸癌細胞系 HCT-116，SW480，LOVO和 SW620中 miR-148a-3p 表達降低（P＜0.05）（圖 1a）。相反的，SRPK2 mRNA及蛋白在結腸癌細胞系中高表達（P＜0.05）（圖 1b，1c）。在接下來的實驗中，筆者選擇HCT-116和SW480兩種細胞進行實驗。

圖1 MiR-148a-3p及SRPK2在結腸癌細胞系中的表達Fig 1 The expression of miR-148a-3p and SRPK2 in colon cancer cell lines

2.2 miR-148a-3p抑制結腸癌細胞侵襲及轉移 為了檢測miR-148a-3p對結腸癌細胞遷移及侵襲能力的影響，筆者進行了劃痕試驗和transwell試驗。使用 miR-148a-3p mimic，miR-148a-3p inhibitor及對應NC轉染結腸癌細胞。如圖2a所示，miR-148a-3p mimic，miR-148a-3p inhibitor可以明顯增加和降低結腸癌細胞中miR-148a-3p的水平（P＜0.05）。劃痕實驗結果顯示，過表達miR-148a-3p的結腸癌細胞相對遷移距離明顯下降 （P＜0.05），而敲低miR-148a-3p的結腸癌細胞相對遷移距離明顯增加（P＜0.05）（圖 2b）。此外，過表達 miR-148a-3p的結腸癌細胞穿透基質膠的細胞數目減少（P＜0.05），而敲低miR-148a-3p的結腸癌細胞穿透基底膜的細胞數目增加（P＜0.05）（圖2c）。這些結果提示我們，miR-148a-3p可以影響結腸癌細胞遷移及侵襲能力。

圖2 MiR-148a-3p對HCT-116及SW480遷移及侵襲能力的影響Fig 2 The effect of miR-148a-3p on migration and invasion of HCT-116 and SW480

2.3 MiR-148a抑制結腸癌細胞發生上皮-間質轉化 上皮間質轉化是腫瘤轉移過程中的重要生物學過程之一。為了檢測miR-148a-3p對結腸癌上皮間質轉化的影響，筆者檢測了上皮標志E-cadherin，間質標志N-cadherin及Vimentin的表達。結果如圖3a，3b顯示，過表達miR-148a-3p的結腸癌細胞E-cadherin 表達增加 （P＜0.05），N-cadherin 及 Vimentin表達降低 （P＜0.05）。而在miR-148a-3p敲低的結腸癌細胞中，E-cadherin表達明顯降低 （P＜0.05），N-cadherin 和 Vimentin 表達明顯增加（P＜ 0.05）。這些結果提示，miR-148a-3p可以抑制結腸癌細胞上皮-間質轉化。

圖3 MiR-148a-3p對HCT-116及SW480上皮-間質轉化的影響Fig 3The effect of miR-148a-3p on epithelial-mesenchymal transition of HCT-116 and SW480

2.4 SRPK2是miR-148a-3p的直接靶點 為了闡明miR-148a-3p抑制CRC細胞遷移的潛在機制，筆者使用TargetScan 7.2和miRPathDB數據庫預測了miR-148a-3p的可能靶點。預測結果顯示SRPK2是miR-148a-3p的潛在靶點。為了證明SRPK2是miR-148a-3p的直接靶點，筆者進行了熒光素酶報告實驗。將結合miR-148a-3p的野生型（Wt）或突變型（Mut）SRPK2序列克隆到 pGL3 Basic載體中（圖 4a），并與miR-148a-3p mimic或miR-148a-3p inhibitor共轉染293T細胞后檢測熒光素酶活性。實驗結果顯示，miR-148a-3p mimic和Wt-SRPK2共轉染的293T細胞中熒光素酶活性明顯下降（P＜0.05）（圖 4b）。相反，當 Wt-SRPK2和 miR-148a-3p inhibitor共轉染到293T細胞中時，熒光素酶活性增加（P＜0.05）（圖 4b）。這個結果提示，SRPK2 可能是miR-148a-3p的直接作用靶點。

圖4 熒光素酶報告實驗驗證SRPK2是miR-148a-3p的直接作用靶點Fig 4 Verification of SRPK2 as a direct target of miR-148a-3p using the luciferase reporter assay

2.5 MiR-148a-3p抑制結腸癌細胞系中SRPK2的表達 為了證實miR-148a-3p對CRC細胞中SRPK2表達的影響，筆者進一步檢測了miR-148a-3p mimic或inhibitor轉染的CRC細胞中SRPK2的mRNA和蛋白質表達。結果顯示，用miR-148a-3p inhibitor轉染結腸癌細胞后，SRPK2的mRNA及蛋白水平明顯增加（P＜0.05）（圖 5a，5b）。相反的，用 miR-148a-3p mimic轉染結腸癌細胞后，SRPK2的mRNA及蛋白表達明顯降低（P＜0.05）（圖 5a，5b）。這些結果提示，miR-148a-3p可以直接影響SRPK2表達。

圖5 MiR-148a-3p對HCT-116及SW480中SRPK2表達的影響Fig 5 The effect of miR-148a-3p on the expression of SRPK2 in HCT-116 and SW480

3 討論

MiRNA的失調與幾乎所有類型的疾病相關，包括腫瘤[24]。許多研究已經證明miRNA失調在CRC發生和發展中起重要作用[25]。目前，miRNA的預后價值和潛在的作用機制仍有待進一步研究[26]。MiR-148a-3p在結腸癌的低表達可能與結腸癌的發生與不良預后有關[27-28]。但是目前miR-148a-3p在結腸癌中的調控作用還不完全明確。在本研究中，筆者發現miR-148a-3p在結腸癌細胞系中低表達。過表達miR-148a-3p可以抑制結腸癌細胞的轉移及侵襲能力，同時抑制結腸癌細胞發生上皮間質轉化。熒光素報告實驗結果顯示SRPK2是miR-148a-3p的直接作用靶點。在結腸癌細胞中過表達miR-148a-3p可以抑制SRPK2的表達。MiR-148a-3p可能通過SRPK2來影響結腸癌的進展。

MiRNA的失調與CRC的發生發展及耐藥性的產生關系密切。例如，miR-34c-5p高表達腫瘤患者預后差，可以抑制結腸癌細胞的凋亡[29]。MiR-92b-3p可以促進結腸癌細胞增殖，轉移及侵襲[30]。然而，并不是所有的miRNA均表現出腫瘤促進作用，很多研究已經顯示有些miRNA在抑制腫瘤過程中起到重要的作用。例如，miR-233可以抑制結腸癌的增殖及促進凋亡[31]。MiR-206可以調節結腸癌細胞對5-氟尿嘧啶的抗性[32]。MiR-153可以抑制IDO1表達從而增強CART的治療效果。在本研究中，筆者發現miR-148a-3p在結腸癌細胞中低表達，過表達miR-148a-3p可以明顯抑制結腸癌的轉移及侵襲能力。同時，miR-148a-3p過表達可以抑制結腸癌細胞發生上皮間質轉化。

許多研究已經證明，miRNA主要通過調控其靶基因的表達發揮調控作用。例如，miR-218可以通過靶向cFLIP誘導結腸癌細胞凋亡[33]。本研究中，筆者通過TargetScan 7.2和miRPathDB數據庫預測了miR-148a-3p的潛在靶點，結果提示SRPK2是miR-148a-3p的潛在靶點。熒光素酶活性實驗提示，SRPK2是miR-148a-3p的直接靶點。但是，由于miRNA可能具有多個靶點，通過作用于不同的靶點可發揮不同的生物學作用。因此miR-148a-3p在結腸癌中的作用還需要進一步的探究。

SRPK2主要參與介導哺乳動物細胞中前體mRNA剪接因子的相互作用和定位[34]。近期的研究顯示，SRPK2與腫瘤的侵襲與轉移相關[23,35]。但是，SRPK2在腫瘤細胞中的表達調控機制還不完全清楚。腫瘤細胞發生上皮間質轉化是腫瘤發生轉移的重要過程之一。為了進一步探究miR-148a-3p調控SRPK2的表達是否影響結腸癌細胞的上皮間質轉化，分別上調或者下調結腸癌細胞中miR-148a-3p的表達水平。在結腸癌細胞中過表達miR-148a-3p時，SRPK2 mRNA及蛋白表達降低，腫瘤的轉移及侵襲能力受抑制。相反的，結腸癌中miR-148a-3p敲低時，SRPK2 mRNA及蛋白表達增加，結腸癌細胞轉移及侵襲能力增強。因此筆者推測，miR-148a-3p可能通過影響SRPK2的表達，影響結腸癌細胞的上皮間質轉化。因此，進一步通過Western blot檢測了結腸癌細胞中上皮標志E-cadherin及間質標志N-cadherin和Vimentin的表達。結果顯示，miR-148a-3p過表達，SRPK2表達降低的同時，E-cadherin表達增加，而N-cadherin和Vimentin表達降低。相反的，miR-148a-3p敲低時，SRPK2表達增加，上皮標志E-cadherin表達降低，間質標志N-cadherin和Vimentin表達增加。這些結果提示，miR-148a-3p可能通過調節SRPK2的表達，影響結腸癌細胞的上皮間質轉化，改變結腸癌細胞的遷移及侵襲能力。

綜上所述，筆者發現miR-148a-3p在抑制結腸癌細胞轉移及侵襲過程中起到了重要的作用，發現了miR-148a-3p調控結腸癌細胞轉移及侵襲的新機制。結果顯示miR-148a-3p過表達可以通過降低SRPF2表達抑制結腸癌細胞的轉移及侵襲。miR-148a-3p/SRPK2可能參與結腸癌轉移的調控，可能成為治療結腸癌的新靶點。