HIV抗體無創(口腔黏膜滲出液及尿液)檢測試劑與有創(血液)檢測試劑的性能比較

葉 黎，陳曉茹，蘇 玲，梁 姝，楊 洪，袁 丹，楊 文△

(1.四川省疾病預防控制中心，四川成都 610041；2.涼山州疾病預防控制中心，四川西昌 615000)

截至2017年11月30日全國報告現存活人類免疫缺陷病毒(HIV)感染者/獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)患者754 852例[1]。而地處川滇黔交界處的四川省涼山彝族自治州(簡稱涼山州)是我國AIDS的高流行區之一[2]。截至2015年12月涼山州累計報告的HIV/AIDS共計38 568例,居四川省第1位[3]。涼山州彝族地區艾滋病防治形勢日益嚴峻，擴大HIV抗體的篩查是早發現、早治療的基礎，對控制艾滋病的傳播和流行具有至關重要的作用。目前，檢測HIV抗體最常用的方法是對血液樣本進行初篩檢測，再進行補充實驗加以確認。但常規方法均需采集血液，為有創采樣。部分高危人群或地處偏遠山區的人群對有創采血接受度較低。在一定程度上影響了這類人群的檢測意愿,不利于擴大檢測范圍。因此，理想的HIV檢測方法應具有無損傷性、安全性、靈敏性等特點。有研究表明，HIV感染者尿液、唾液、精液、淚液均含有HIV抗體[4-6]；口腔黏膜滲出液、尿液較易采集且采集過程無創，因此，HIV無創檢測試劑的上市為擴大檢測范圍提供了新的選擇[7-8]?！度珖滩z測技術規范》(2015年修訂版)也將口腔黏膜滲出液及尿液作為了新的HIV檢測樣品種類。2017年中國疾病預防控制中心發布的全國HIV抗體診斷試劑臨床質量評估報告顯示，2015-2017年麗珠HIV抗體酶聯免疫試劑的靈敏度均為100.00%、特異度為98.61%～100.00%[9]。因此，本研究將以麗珠HIV抗體酶聯免疫試劑作為對比試劑，評估目前市面上常用的1種檢測原理為免疫層析法的口腔黏膜滲出液試劑A、1種檢測原理為免疫滲濾法口腔黏膜滲出液試劑B和1種檢測原理為酶聯免疫法尿液HIV抗體檢測試劑C的檢測性能，旨在為無創檢測在HIV1/2抗體篩查中的推廣應用提供依據。

1 資料與方法

1.1研究對象 2017年10月至2018年3月招募涼山州布拖縣年齡6～65歲的HIV感染者100例，未知感染狀態的體檢者200例。不包括經期婦女。

1.2儀器與試劑

1.2.1評價試劑A HIV 1/2口腔黏膜滲出液檢測試劑(免疫層析法)，廣州萬孚生物技術有限公司生產，試劑批號：W06370730，有效期：2019-7-10。

1.2.2評價試劑B 口腔黏膜滲出液HIV1+2型抗體檢測試劑(免疫滲濾法)，北京萬泰生物藥業股份有限公司生產，試劑批號：ID20170602，有效期：2018-05。

1.2.3評價試劑C HIVⅠ型尿液抗體檢測試劑(酶聯免疫法)，北京君禾藥業有限公司生產，有效期：2018-5-14。

1.2.4對比試劑 HIV抗體酶聯免疫檢測試劑盒，珠海麗珠試劑股份有限公司生產，試劑批號：2018030812，有效期：20190313。

1.2.5確證試劑 HIV 1+2型抗體檢測試劑盒(免疫印跡法)，上海英旻泰生物技術有限公司生產，試劑批號：IMT 1612001，有效期：2018-12-07。

1.2.6儀器 酶標儀、洗板機、37 ℃孵箱、全自動免疫印跡儀、普通冰箱等。

1.3方法

1.3.1口腔黏膜滲出液樣本的采集 醫務人員在100例HIV感染者中隨機選擇55例采集，45例為醫務人員指導受檢者采集。

1.3.1.1口腔黏膜滲出液樣本A 從評價試劑A包裝中取出口腔取樣器，用取樣器的采樣端沿受試者上、下齒齦輕輕來回擦拭，用時5～6 s。再翻轉取樣器，沿受試者上、下齒齦輕輕來回擦拭，用時5～6 s。將口腔取樣器插入裝有樣本處理液的樣本提取管內，緊貼提取管壁，上、下刮擦6～8次。從提取管中取出口腔取樣器，完成取樣。采集完成的樣本于2～8 ℃保存待檢。

1.3.1.2口腔黏膜滲出液樣本B 從評價試劑B鋁箔袋中取出無菌采集器，將采集器海綿端置于受檢者舌下5 min，待海綿軟化后將海綿在牙齦外周來回擦拭1～2 min。將采集器海綿端置擠壓裝置內，用力垂直擠壓采集器手柄，并將擠出的液體收集于樣品管中，完成取樣。采集完成的樣本于2～8 ℃保存待檢。

1.3.2尿液標本C的采集 采集受檢者清潔中段尿2～5 mL于一次性清潔尿杯內，檢測人員使用無菌吸管吸取1.5 mL尿液至凍存管中，于2～8 ℃保存待檢。

1.3.3血液標本的采集 采集受檢者乙二胺四乙酸抗凝全血6～10 mL，輕輕顛倒混勻6～8次。于6 h內1 500 r/min離心15 min取上層血漿，于2～8 ℃保存待檢。

1.3.4樣本檢測 口腔黏膜滲出液標本于采樣完成后12 h內完成檢測，血液、尿液標本于采樣完成后1周內進行檢測，所有樣本的檢測均嚴格按試劑盒說明書操作。尿液HIV-1抗體臨界值為0.25，光密度(OD)值大于或等于0.25為陽性(+)，<0.25為陰性(-)。血液標本使用麗珠酶聯免疫法進行初篩，初篩陽性按檢測技術規范進行復檢，復檢陽性者使用IMT HIV抗體確證檢測試劑確認其感染狀況。將3種評價試劑檢測結果與對比試劑進行比較。

1.4統計學處理 采用SPSS17.0統計軟件對數據進行分析，計數資料以率(%)表示，采用χ2檢驗；2種方法一致性比較用Kappa檢驗。根據邊緣概率的計算，κ=-1～1?！?.8 為二者具有高度一致性，0.8～0.4為二者具有中度一致性，<0.4為二者不一致。比較評價試劑與對比試劑的受試者工作特征(ROC)曲線下面積，檢測其檢驗效能。對樣本成功采樣的定義為受檢者愿意接受標本采集，且能收集到符合試劑盒說明書要求的樣本量。采樣成功率=成功采樣數/采樣人數。

2 結 果

2.1采樣成功率分析 按試劑盒說明書的采樣要求，不同樣本采樣成功率見表1。所有受試者均接受尿液和口腔黏膜滲出液的采集。尿液樣本采集成功率為100.00%?？谇火つB出液采集，按評價試劑A的采樣要求，采集成功率為99.00%，失敗的3例樣本原因為語言溝通不暢，樣本缺失；但按評價試劑B的采樣要求，采集成功率僅為81.00%，失敗原因均為未收集到試劑盒說明書要求的樣本量。有6.00%的受試者(18/300)拒絕采集其血液樣本。評價試劑A使用醫務人員采樣方式和醫務人員指導受檢者采樣方式的采樣成功率均為100%(45/45、55/55)。評價試劑B使用醫務人員采樣方式的采樣成功率[96.36%(53/55)]高于醫務人員指導受檢者采樣方式的采樣成功率[86.67%(39/45)]，但差異無統計學意義(χ2=3.162,P>0.05)。

2.2評價試劑A、B與對比試劑檢測結果比較 評價試劑A與對比試劑均有結果者280份，其中110份血液樣本對比試劑初篩陽性，后經IMT確認試劑確認均為陽性。評價試劑A的陽性符合率為98.21%[95%可信區間(95%CI)：93.06～99.69]，陰性符合率為98.81%(95%CI：95.32～99.79),總符合率為98.57%(95%CI：96.13～99.54)。評價試劑A與對比試劑一致性較好(κ=0.970)。評價試劑B與對比試劑均有結果者233份，其中89份血液樣本對比試劑陽性，經IMT確認試劑確認均為陽性。評價試劑B的陽性符合率為90.82%(95%CI：82.84～95.45)，陰性符合率為96.24%(95%CI：91.00～98.61)，總符合率為93.94%(95%CI：89.82～96.52)，陽性預測值為94.68%(95%CI：87.45～98.03)，陰性預測值為93.43%(95%CI：87.53～96.76)。評價試劑B與對比試劑一致性較好(κ=0.875)。見表2。

表1 4種樣本采集情況比較(n=300)

表2 評價試劑A、B與對比試劑檢測結果比較

2.3評價試劑C與對比試劑檢測結果比較 評價試劑C與對比試劑均有結果者282份，其中112份血液樣本參考試劑陽性，經IMT確認試劑確認均為陽性。評價試劑C的陽性符合率為97.32%(95%CI：91.79～99.31)，陰性符合率為95.29%(95%CI：90.61～97.80)，總符合率為96.10%(95%CI：92.93～97.94)，陽性預測值為93.16%(95%CI：86.55～96.79)，陰性預測值為98.18%[(95%CI：94.36～99.53)]。評價試劑C與對比試劑一致性較好(κ=0.919)。見表3。8例假陽性樣本中OD值為0.250～0.500 6例。3例假陰性標本的OD值分別為0.090、0.060、0.135。見表4。

表3 評價試劑C與對比試劑檢測結果比較

表4 11份尿液和血液標本檢測結果不符合標本結果比較

2.4評價試劑檢測HIV抗體的ROC曲線比較 評價試劑A、B、C檢測HIV抗體的ROC曲線下面積分別為0.991、0.935、0.975(95%CI：0.977～1.000、0.897～0.973、0.951～0.998)。見圖 1。提示3種無創檢測試劑檢測HIV抗體的準確性均較高。

圖1 評價試劑A、B、C檢測HIV抗體的ROC曲線

3 討 論

本研究招募的自愿接受檢測服務的300例參試者均同意自行或由醫務人員進行口腔黏膜滲出液及尿液的采集；但有6.00%(18/300)的參試者拒絕采集其血液進行檢測。據文獻報道，部分彝族群眾對采血有恐懼心理，易造成暈針、暈血，甚至由此引發群體事件[10]。無創樣本采集方式可接受度更高。

本研究結果顯示，不同的無創檢測樣本采集的成功率有差異，尿液(自行采集)采集成功率為100.00%，口腔黏膜滲出液評價試劑B的采樣成功率相對較低，為81.00%，分析原因可能為：(1)樣本要求較高，受檢者在口干的狀態下無法成功采集。(2)評價試劑B的采樣步驟相對于其他試劑稍顯復雜，受檢者需先將采集器的海綿端在舌下含軟(約需5 min以上時間)，再擦拭牙齦外周，用時稍長，部分受檢者不能掌握正確的采樣方式?？谇火つB出液評價試劑A采樣成功率較高，為99.00%，因其采集要求相對簡單，需受檢者配合的部分較少。另外，使用醫務人員采樣方式和醫務人員指導受檢者自行采樣方式的口腔黏膜滲出液的采樣成功率比較，差異無統計學意義(P>0.05)。說明經簡單培訓后受檢者即可正確掌握無創檢測樣本的采樣方式，提示為擴大HIV檢測覆蓋面，可推廣無創檢測或無創自檢的檢測模式。

據文獻報道，口腔黏膜滲出液中免疫球蛋白G抗體濃度約相當于血清中的1/20[11]；對口腔黏膜滲出液檢測試劑的靈敏度提出了較高要求。本研究結果顯示，口腔黏膜滲出液評價試劑A陽性符合率、陰性符合率均高于評價試劑B，是否由于2種試劑的采樣方式和檢測原理不同而導致的差異，目前尚無相關文獻報道。

口腔黏膜滲出液中可能含有的其他物質如病毒、細菌、膽紅素等，以及吸煙、服藥、牙周炎等因素均可能導致出現假陽性或假陰性[12]；一些經抗病毒治療,病毒載量減少者也有可能出現漏檢。本研究使用的尿液試劑C與對比試劑的符合率較高,進一步對尿液檢測OD值分析發現，8例假陽性樣本中中OD值為0.250～0.500 6例，提示OD值在0.50以下可能為尿液檢測的灰區[13]。對處于灰區范圍的樣本重復采樣檢測或采集血液進行檢測可大大提高檢測準確性。

在HIV感染者的尿液檢測結果中，219號樣本的OD值為0.135，有可能該樣本為非受檢者本人的。因尿液標本的采集具有一定的隱私性，在樣本采集過程中發現，個別受檢者使用水代替尿液標本，所以，不排除個別受檢者使用他人的樣本代替本人樣本。

尿液HIV抗體的檢測受患者體內抗體和病毒載量水平高低的影響，當處于HIV感染的早期階段或艾滋病終末期則抗體水平較低或經抗病毒治療患者血中病毒載量水平較低，相應地尿中抗體含量較低，可能導致假陰性結果的出現。另外，尿液中成分復雜，細胞、蛋白質、鹽類等，這些因素是否會導致檢測結果出現假陽性或假陰性尚需進一步的研究。

4 結 論

傳統的血液檢測方法由于需有創采集樣本，不但增加了醫務人員職業暴露的風險，同時也降低了高危人群和害怕采血人群的檢測意愿。本研究評價的3種HIV抗體無創檢測試劑與有創試劑比較，具有較好的一致性，符合率較高。因此，無創檢測試劑作為一種初篩檢測試劑，對醫療條件有限、采血困難的兒童、肥胖者、靜脈萎縮者等，以及具有特殊風俗習慣的少數民族地區將能極大地提高人群篩查率，為AIDS的預防和控制提供了新的檢測途徑。