抗酸染色室間質量評價質控片的標準化制備及評價

張 震，郭 攀，王淑玲，顏 令，徐蘭蘭，廖 璞△

(1.重慶市人民醫院檢驗科,重慶 400014；2.內江市第二人民醫院檢驗科,四川內江 641000)

WHO宣布控制結核病最佳策略中重要的一步就是通過痰涂片顯微鏡檢查發現可疑患者[1]?？顾崛旧蚱浣洕?、方便且能快速篩查可疑結核病患者，一直以來均被發展中國家臨床醫生和實驗室人員所青睞[2]。我國絕大多數實驗室，包括基層醫療機構實驗室均開展了抗酸染色項目，但對該項目的準確度評價仍面臨巨大的挑戰[3]，雖然各級臨床檢驗中心組織有抗酸染色項目室間質量評價，但目前仍缺乏標準化制備抗酸染色項目室間質量評價質控片的相關研究。本研究基于重慶市臨床檢驗中心的平臺，探討了標準化制備穩定、均一抗酸染色室間質量評價質控片的方法，現報道如下。

1 材料與方法

1.1菌株來源 膿腫分枝桿菌標準菌株ATCC 19977(CICC10381)購自中國工業微生物菌種保藏中心。

1.2儀器與試劑 血培板、改良羅氏培養基購自重慶旁通生物科技有限公司，革蘭染色、抗酸染色試劑購自珠海貝索生物技術有限公司，比濁儀購自法國梅里埃，普通光學顯微鏡購自奧林巴斯(中國)有限公司。

1.3方法

1.3.1染色方法 革蘭染色、萋-尼氏抗酸染色按商品化染色液說明書操作。

1.3.2確定最適培養基 從-80 ℃冰箱中取出膿腫分枝桿菌標準菌株干粉，在做好個人防護的前提下于生物安全柜中用無菌肉湯1 mL溶解，溶解后用接種環挑取一環，接種于血平板上，分三區劃線，放于35 ℃、5%二氧化碳培養箱中孵育3 d[4]。另外取50 μL接種于改良羅氏培養基，培養5 d。將培養有ATCC 19977的血平板和改良羅氏培養基取出，取3 mL生理鹽水，制備成3.00麥氏濃度菌懸液。調整好后分別用空針抽取1 mL菌懸液注入陰性血培養中，搖勻，分別取10 μL在玻片上涂2 cm2大小的菌膜，玻片自然風干，固定，進行抗酸染色。

1.3.3確定最佳消化液、消化時間和消化溫度 (1)胰蛋白酶和N-乙酰-L-半胱氨酸(NALC)是消化痰液的2種良好消化劑[5]。有研究表明，使用1%胰蛋白酶消化30 min能得到理想的消化效果[6]；而NALC使用最多的濃度是2%、消化15 min[7]。因此，本研究按文獻報道的消化濃度和消化時間分別對胰蛋白酶和NALC的消化效果進行了評價。在生物安全柜中分別用無菌一次性塑料吸管吸取2 mL濃痰于痰杯中，分別加1%胰蛋白酶2 mL常溫消化30 min、2% NALC 2 mL常溫消化15 min，消化完后取10 μL于玻片上涂2 cm2菌膜，分別涂4張，2張進行革蘭染色，2張進行抗酸染色。(2)在生物安全柜中分別用無菌一次性塑料吸管吸取1 mL濃痰于痰杯中，加入1%胰蛋白酶1 mL分別在室溫和37 ℃消化30 min，消化結束后取10 μL于玻片上涂2 cm2，分別涂4張，2張進行革蘭染色，2張進行抗酸染色。(3)在生物安全柜中分別用無菌一次性塑料吸管吸取1 mL濃痰于痰杯中，分別加入1%、2%、5%、10%胰蛋白酶1 mL于37 ℃消化30 min，消化完后取10 μL涂于玻片上涂2 cm2，分別涂4張，2張進行革蘭染色，2張進行抗酸染色。(4)根據酶動力學相關知識，當酶濃度、底物濃度、反應溫度、pH確定的時候，反應速率隨即確定[8]，達到理想的消化效果，即有一個最佳的消化時間。為此，本研究設計了4種不同的消化時間。在生物安全柜中分別用無菌一次性塑料吸管吸取1 mL濃痰于痰杯中，加入2%胰蛋白酶1 mL于37 ℃分別消化10、20、30、60 min，消化完后取10 μL在干凈玻片上制成2 cm2橢圓形痰膜，分別涂4張，2張進行革蘭染色，2張進行抗酸染色。

1.3.4制備不同等級抗酸染色室間質量評價質控片 在生物安全柜中用無菌一次性塑料吸管吸取5 mL濃痰于痰杯中，加入2%胰蛋白酶5 mL，在37 ℃孵箱中消化20 min。將培養有膿腫分枝桿菌ATCC 19977的血平板取出，在生物安全柜中調菌懸液到0.50麥氏濃度，取100 μL菌懸液于900 μL生理鹽水稀釋10倍，再取稀釋后的菌懸液500 μL于500 μL生理鹽水中，稀釋2倍，之后再取100 μL稀釋的菌懸液加入900 μL消化的痰液，于生物安全柜中渦旋震蕩，混勻；取0.50麥氏濃度菌懸液100 μL于900 μL生理鹽水中稀釋10倍，再取100 μL稀釋的菌懸液加入900 μL消化的痰液，于安全柜渦旋震蕩，混勻；取0.50麥氏濃度菌懸液100 μL于900 μL生理鹽水中稀釋10倍，再取200 μL稀釋的菌懸液加入800 μL消化的痰液，于安全柜渦旋震蕩，混勻；取0.50麥氏濃度稀釋的菌懸液100μL加入900 μL消化的痰液，于生物安全柜中渦旋震蕩混勻。各取10 μL涂于玻片上，制成2 cm2橢圓形痰膜，各濃度分別制備4張。

1.3.5穩定性、均一性評價 (1)基于能力驗證質控片在發放過程中生物安全的考慮，本研究對抗酸染色質控片進行了滅菌處理，處理方式包括紫外線滅菌處理24 h、高壓蒸汽滅菌(121 ℃、20 min)、80 ℃高溫烘烤3 h；通過比較3種滅菌方式后膿腫分枝桿菌菌體染色形態，背景細胞形態，評價其穩定性。對紫外線滅菌24 h的室間質量評價質控片在室溫放置1、2周，1、3、6個月，每個時間點取出室間質量評價質控片進行抗酸染色，評價膿腫分枝桿菌ATCC 19977菌體形態及背景細胞形態。以鏡檢膿腫分枝桿菌菌體抗酸染色成典型的紅色桿菌、且染色結果穩定、顯微鏡下形態完好、背景中性粒細胞胞體完整、背景清晰、呈藍色作為穩定性評價標準。(2)在生物安全柜中隨機抽取制備好的、等級為+++室間質量評價質控片10張，每張進行抗酸染色鏡檢，讀取30個油鏡視野。計數每個油鏡視野的抗酸桿菌細菌數，計算平均值，根據中華人民共和國衛生行業標準WS 288-2017《肺結核診斷》判斷結果。

2 結 果

2.1血平板是最佳的培養基 血平板培養的膿腫分枝桿菌通過抗酸染色后形態呈典型的紅色長桿菌，直徑3.0～5.0 μm，鏡下容易識別(圖1)。改良羅氏培養基培養的ATCC 19977菌體細小，直徑0.5～1.0 μm，形態呈細小桿菌，不易識別(圖2)。不適于抗酸染色室間質量評價質控片的制備。

圖2 膿腫分枝桿菌ATCC 19977在改良羅氏 培養基上的菌落形態和抗酸染色鏡下形態

2.2胰蛋白酶是處理痰液最優的消化液 使用胰蛋白酶消化后的痰液均勻，流動性強，抗酸染色、革蘭染色低倍鏡下均能看見膿細胞相對均勻分布，而通過NALC消化后的痰液出現小的絮狀痰塊，且流動性欠佳，通過革蘭染色和抗酸燃染色后在低倍鏡下觀察，NALC消化的痰液細胞呈塊狀聚集，非均勻地分散，表明消化效果不理想(圖3、4)。

圖3 濃痰在1%胰蛋白酶消化30 min后的 外觀和顯微鏡下形態

圖4 濃痰在2% NALC消化15min后的 外觀和顯微鏡下形態

2.3胰蛋白酶在37 ℃條件下消化效果優于常溫下的消化效果 37 ℃下1%胰蛋白酶消化后痰液中的中性粒細胞呈均勻分布，而在室溫下消化后低倍鏡和高倍鏡下仍可見典型的黏液絲(圖5、6)。表明在37 ℃條件下胰蛋白酶消化效果明顯優于室溫下消化效果。

圖5 1%胰蛋白酶常溫消化濃痰1 h，革蘭 染色、抗酸染色高倍鏡下形態

圖6 1%胰蛋白酶37 ℃消化1 h，革蘭 染色、抗酸染色高倍鏡下形態

2.42%胰蛋白酶是制備抗酸染色質控片最佳的消化濃度 1%胰蛋白酶作為消化濃度，37 ℃消化1 h后顯微鏡下仍可見少量黏液絲，提示或許以1%胰蛋白酶作為消化濃度并非是最佳的。1%、2%、5%、10%胰蛋白酶作為消化液，在37 ℃孵箱中孵育30 min，通過外觀、抗酸和革蘭染色顯微鏡下觀察，2%胰蛋白酶消化30 min是最好的消化濃度。

2.52%胰蛋白酶消化20 min能達到最佳的消化效果 10 min時肉眼見痰液黏稠，流動性不佳；20 min可達到理想的消化效果，而消化40 min時痰液呈稀薄呈水狀，提示細胞被消化，顯微鏡下結果證實2%胰蛋白酶消化20 min能達到最佳的消化效果(圖7)。

圖7 不同時間點2%胰蛋白酶37 ℃消化 濃痰后的外觀比較

2.6制備不同級別抗酸染色項目室間質量評價質控片 利用充分消化的痰液稀釋200倍取10 μL制備2 cm2菌膜(+)，稀釋100倍取10 μL制備2 cm2菌膜(++)，稀釋50倍取10 μL制備2 cm2菌膜(+++)，稀釋10倍取10 μL制備2 cm2菌膜(++++)。

2.7穩定性評價結果 高壓滅菌121 ℃、20 min對膿腫分枝桿菌ATCC 19977菌體形態無影響，但會對背景細胞造成破壞，進而影響染色背景，不宜作為室間質量評價質控片的滅菌方式。紫外線滅菌24 h和80 ℃高溫烘烤對膿腫分枝桿菌ATCC 19977菌體形態及背景細胞染色均無影響，可作為滅菌的方法，且對質控片穩定性無影響。對紫外線滅菌24 h的室間質量評價質控片在室溫放置6個月對膿腫分枝桿菌ATCC 19977菌體形態和背景細胞的染色穩定性無影響。

2.8均一性評價結果 隨機抽取的10張抗酸質控片的結果都是(+++)。見表1。表明根據上述步驟做出的質控片均一性良好。

表1 抗酸染色質控片(+++)均一性評價

3 討 論

本研究利用膿腫分枝桿菌標準菌株ATCC 19977作為實驗菌株，結果顯示，在血平板上培養后的菌體較改良羅氏培養基培養后的菌體細長，染色后效果更為典型和便于觀察。分析可能的原因，改良羅氏培養基中加有孔雀綠，孔雀綠為抑菌劑，抑制其他雜菌生長的同時，對膿腫分枝桿菌生長有部分抑制作用，使改良羅氏培養基上的膿腫分枝桿菌菌體形態短小，制備成室間質量評價質控片后普通光學顯微鏡不利于觀察，即不能用于抗酸染色室間質量評價質控片的制備。另一方面，在最佳的消化液選擇過程中，通過查閱相關文獻發現，對濃痰消化使用最多的消化液為胰蛋白酶和NALC，本研究進一步比較了2種常用消化劑對濃痰的消化作用，結果顯示，胰蛋白酶消化效果明顯優于NALC。分析其原因，濃痰成分主要是黏多糖、黏蛋白[9]，而胰蛋白酶為蛋白水解酶，對精氨酸和賴氨酸肽鏈具有水解作用，可使痰液中的酸性糖蛋白和黏蛋白等水解為多肽或氨基酸[10]，所以，胰蛋白酶能有效對痰液進行消化，使各類細菌與細胞呈游離暴露狀態；而NALC為半胱氨酸的N-乙?；苌?，分子中含有巰基，能使黏蛋白肽鍵的二硫鍵(-S-S-)斷裂，只能使黏蛋白變成相對小的肽鏈，其消化效果明顯弱于胰蛋白酶。

相較于改良羅氏培養基，血平板上的膿腫分枝桿菌在顯微鏡下的形態更加細長，而改良羅氏培養基上的膿腫分枝桿菌短小，不易觀察。因此，對抗酸染色項目室間質量評價質控片的制備，血平板是培養膿腫分枝桿菌的良好培養基；通過革蘭染色和抗酸染色后利用顯微鏡鏡檢觀察質控片的背景，確定胰蛋白酶為最佳的消化液，最佳消化濃度為2%，最佳消化條件是37 ℃下消化20 min。另外，制備成0.50麥氏濃度的膿腫分枝桿菌通過使用胰蛋白酶消化后的痰液進行不同倍數的稀釋，可得到不同等級的抗酸染色室間質量評價質控片，且能保證其均勻和穩定。

抗酸染色項目因其操作簡便、經濟、快速等優點，受到我國各級臨床實驗室的青睞，其準確度對臨床的診斷至關重要。目前尚未見關于如何標準化制備抗酸染色室間質量評價質控片的相關文獻報道，本研究基于重慶市臨床檢驗中心的平臺，首次探討了標準化制備穩定、均一抗酸染色室間質量評價指控片的方法，并成功用于重慶市各臨床實驗室抗酸染色項目的能力驗證，保證了全市開展該項目臨床實驗室結果的準確性。