血清microRNA-155水平在乳腺癌早期診斷和預后評價中的作用

張 超，童富云△，胡 瀅

(1.重慶市涪陵中心醫院乳腺甲狀腺血管外科，重慶 408000；2.陸軍軍醫大學第一附屬醫院乳腺甲狀腺外科，重慶 400038)

乳腺癌是嚴重威脅女性健康的惡性腫瘤，其發病率在我國呈逐年上升趨勢[1]。隨著手術，放、化療技術的飛速發展及多模態成像設備的應用，治療乳腺癌的療效得到了極大的改善。然而，乳腺癌的轉移與復發仍不能得到有效的控制，是乳腺癌患者致死的主要原因[2]。早期診斷乳腺癌并根據預后預測指導全程最佳治療達到減少復發、轉移的目的具有重要的研究意義。在乳腺癌早期診斷的標志物中微小RNA(microRNA)正受到越來越多的關注[3-6]。近期有研究表明，microRNA-155的過度表達與腫瘤的侵襲與轉移密切相關，其機制主要包括促進腫瘤細胞上皮-間質轉化、抑制細胞凋亡等[7-9]?；颊哐錷icroRNA-155水平與臨床病理的關系及其對診斷與預后預測的作用已成為目前的研究熱點。本研究通過回顧性分析乳腺癌患者與健康女性血清microRNA-155水平，研究其在乳腺癌早期診斷與預后評價中的意義。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2012年9月至2013年12月重慶市涪陵中心醫院經病理檢查診斷為乳腺癌的81例女性患者的外周血樣本及相對應的病理切片作為研究組。乳腺癌病理診斷標準采用WHO乳腺腫瘤的病理分型，入組患者均為美國國立綜合癌癥網絡(NCCN)乳腺癌臨床實踐指南臨床分期為Ⅰ～Ⅲ期的患者，且尚未開始接受手術等其他治療。收集同期在重慶市涪陵中心醫院健康體檢的80例健康女性的外周血樣本作為對照組。對照組均為成年、非妊娠、無嚴重心肺疾病的健康女性。乳腺癌組患者年齡35～75歲，平均(51.26±6.99)歲；對照組健康女性年齡29～76歲，平均(50.87±7.52)歲。兩組研究對象年齡比較，差異無統計學意義(P>0.05)。本研究已獲得該院倫理委員會批準，同時，經患者或親屬授權并簽署本研究知情同意書。

1.2方法

1.2.1提取總RNA 采集兩組研究對象血液標本5 mL于乙二胺四乙酸二鉀抗凝管中，靜置30 min，然后4 000 r/min(離心半徑20 cm)離心25 min，將上清液轉移至無RNA酶的Eppendorf離心管中，每管200 μL，根據RNA提取試劑盒(上海生工生物工程有限公司)說明書的要求，采用Trizol法提取RNA。

1.2.2microRNA的逆轉錄 采用microRNA q聚合酶鏈反應(PCR)試劑盒(南京凱基生物有限公司)進行逆轉錄。具體反應體系為包括50 ng/μL的模板RNA，25 U/μL的Poly A聚合酶1 μL，RTase Mix 1μL,PAP/RT緩沖液10 μL，使用焦碳酸二乙酯(DEPC)水將體系調整至30 μL。PCR反應程序設置為37 ℃ 60 min、70 ℃ 15 min?？寺∮肞CR引物(蘇州金維智科技有限公司)：上游引物3′-GGATCCGGTGGCACAAACCAGGAA-5′；下游引物5′-GAATTCTCTAAGTTTATCCAGCAGGGTG-3′。

1.2.3實時定量PCR檢測microRNA 采用實時定量熒光PCR的方法檢測樣本中microRNA-155的表達水平。具體反應體系包括10 μL的2×Mix 、2 μL通用引物、2 μL特異引物、2 μL cDNA等，然后使用無RNA酶的雙蒸水將體系調整為25 μL。PCR反應條件為95 ℃ 10 min、95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min，循環數(Ct)為50。

1.2.4計算microRNA相對表達量 使用U6內參基因對目標基因進行均一化。通過Ct值計算microRNA-155相對表達水平，即熒光PCR信號達到預設閾值所需要的Ct。ΔΔCt可計算目標基因的相對表達。ΔCT樣本=CT樣本-CT內參;ΔCT對照=CT對照-CT內參;ΔΔCT=ΔCT樣本=ΔCT對照。

2 結 果

2.1兩組研究對象血清microRNA-155表達水平比較 乳腺癌組患者血清microRNA-155表達水平明顯高于對照組，是對照組的3.5倍，差異有統計學意義(t=8.71,P=0.001)。見表1。

表1 兩組研究對象血清microRNA-155相對 表達水平比較

2.2microRNA-155表達水平與乳腺癌患者臨床病理特征的關系 microRNA-155表達水平與淋巴結轉移具有顯著的相關性,有淋巴結轉移患者microRNA-155表達水平明顯高于無淋巴結轉移者，差異有統計學意義(P<0.05)。然而，microRNA-155表達水平與患者年齡、腫瘤分期、腫瘤直徑、雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)等無關，差異均無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 microRNA-155表達水平與乳腺癌患者臨床 病理特征的關系(n=81)

圖1 microRNA-155表達的ROC曲線

2.3microRNA-155表達水平在乳腺癌中的診斷價值 血清microRNA-155水平診斷乳腺癌的ROC曲線下面積為0.941(95%可信區間：0.899～0.982)，臨界值為1.165，靈敏度、特異度分別為84.2%和91.3%。microRNA-155表達水平對乳腺癌具有較高的診斷價值。見圖1。

2.4microRNA-155表達水平在乳腺癌預后評價中的價值 以microRNA-155表達的中位數2.49將研究組或者分為小于2.49組(40例)和大于或等于2.49組(41例)。兩組患者生存率比較，差異有統計學意義(χ2=4.811，P=0.027)。見圖2。

圖2 兩組患者生存率比較

3 討 論

乳腺癌治療的關鍵在于早期診斷與干預，因此，發現新的易于檢測且具有一定靈敏度和預后預測作用的早期診斷分子標志物具有極大的臨床意義，從健康人群中篩查、鑒別出早期乳腺癌患者，進而提高乳腺癌早期診斷的效率，并盡早開始綜合治療，達到提高療效的目的。

microRNA是參與基因轉錄后水平調控的一類非編碼RNA，國內外研究均表明，其在腫瘤發生、發展中具有重要作用[10-12]。microRNA-155是一種多功能microRNA，血循環中主要來自于細胞，因血循環中其多與蛋白相結合，穩定性好，故是作為腫瘤標志物研究的基礎。

本研究比較了乳腺癌患者和健康者血清microRNA-155的表達水平，結果顯示，乳腺癌患者血清microRNA-155表達水平明顯高于健康女性，差異有統計學意義(P<0.05)，與相關研究結果一致[13]，即microRNA-155在乳腺癌患者血清中的表達顯著升高。本研究通過制作ROC曲線發現，檢測血清microRNA-155表達水平對乳腺癌具有較高的診斷價值，ROC曲線下面積為0.941，靈敏度、特異度分別為84.2%和91.3%，與國外相關研究結果相符[14-15]。

盡管鉬靶檢查等常規篩查手段在目前乳腺癌診斷中具有重要地位，但已有研究表明，microRNA-155診斷乳腺癌的診斷價值比鉬靶更高[16]。鉬靶還因輻射、乳腺組織本身等因素的影響導致應用受限。而檢測microRNA-155表達更易獲取檢測標本，對受試者基本無創傷和痛苦，操作方法成熟，是潛在的良好的診斷乳腺癌的標志物。

本研究結果顯示，血清microRNA-155的表達水平與淋巴結轉移顯著相關，淋巴結轉移組患者血清microRNA-155表達水平明顯高于無淋巴結轉移組，而與患者年齡、是否絕經、激素受體等臨床病理特點無關，與相關研究結果基本一致[17]。表明microRNA-155的高表達可能導致淋巴結轉移，而轉移正是乳腺癌患者致死的主要原因。本研究Kaplan-Meier生存分析結果顯示，不同microRNA-155表達水平組患者生存率比較，差異有統計學意義(P<0.05)，microRNA-155高表達提示預后較差，原因可能是microRNA-155通過調控促進上皮-間質轉化從而加快腫瘤轉移的進程[18]。

4 結 論

microRNA-155的表達在乳腺癌的診斷與預后預測中具有重要意義,可能成為診斷乳腺癌并根據預后預測指導臨床治療的重要標志物。