紅參破壁飲片抗疲勞、耐缺氧、耐低溫作用及急性毒性研究

曹曉俊，梅全喜，高玉橋，林慧，胡瑩，彭麗華，成金樂

1.中山市中智藥業集團有限公司，廣東 中山 528437；2.廣州中醫藥大學附屬中山醫院，廣東 中山 528401

紅參為五加科植物人參Panax ginsengC.A.Mey.的栽培品經蒸制后的干燥根和根莖，其功能主要為大補元氣，復脈固脫，益氣攝血，用于體虛欲脫，肢冷脈微，氣不攝血，崩漏下血。紅參破壁飲片為將紅參傳統飲片經現代粉碎技術加工至D90＜45μm（300目以上）的粉體，通過誘發自身物質的黏性，制成的30～100目均勻干燥顆粒狀飲片。其服用方式靈活多樣，可如傳統飲片一樣煎煮服用，也可如沖劑沖泡服用，還可如咖啡制備成混懸液全成分服用。

由于中藥破壁飲片經破壁粉碎加工，原傳統飲片的細胞結構被粉碎破壞，使細胞內化學成分的溶出量大大提高，有利于提高有效成分的利用率，但同時其他成分的加速釋放則可能放大潛在的不良反應和毒副作用。另外，與傳統飲片煎煮服用的湯劑相比，中藥破壁飲片的全成分服用方式，造成吸收進入人體的化學成分更充分，也可能產生與傳統飲片不一樣的藥效或毒性反應。因此，有必要開展破壁飲片與其傳統飲片的有效性和安全性比較研究，并探索量效關系和量毒關系，從而為中藥破壁飲片的安全、臨床有效應用提供基礎科學依據。本項目以紅參品種為研究對象，以最大給藥量法考察紅參破壁飲片與其傳統飲片的急性毒性差異；以不同劑量的紅參破壁飲片與其傳統飲片的抗疲勞、耐缺氧和耐低溫的藥理藥效差異比較，評價兩種形式飲片的有效性差異[1-3]。

1 材料

1.1 動物

NIH小鼠，體重為20 g～22 g，由廣東省醫學實驗動物中心提供，許可證號：SCXK（粵）2008-0002，粵監證字2008A022。

1.2 藥品及配制

紅參破壁飲片和紅參傳統飲片（中山市中智藥業集團有限公司）；人參莖葉總皂苷片（沈陽東昂制藥有限公司，批號：20090401，每片含人參莖葉皂苷為25 mg）。

藥效試驗藥品配制方法：紅參破壁飲片，加入蒸餾水研磨配制成可灌胃給藥的不同濃度的混懸液；紅參傳統飲片，按照傳統中藥煎煮方法煎煮（加水量為剛好沒過藥面約5 cm，煎煮1.0小時后以紗布過濾藥液，藥渣再加蒸餾水煎煮0.5小時，過濾藥液），濃縮2次濾液成一定濃度的湯劑濃縮液。陽性對照藥（人參莖葉總皂苷片），給藥前將藥片研磨成細粉狀，并用生理鹽水調勻成含人參莖葉皂苷29 mg/mL的藥液。

急性毒性試驗藥品配制方法：紅參破壁飲片，加入蒸餾水研磨配制成0.298 g生藥/mL的混懸液（最大質量濃度）；紅參傳統飲片，煎煮濃縮成2.27 g生藥/mL的濃縮液（最大質量濃度）。

2 方法

2.1 抗疲勞作用比較研究[4-6]

選取NIH小鼠70只，隨機分為7組，每組10只，均雌雄各半：正常對照組（生理鹽水組）、陽性對照組（人參莖葉皂苷58 mg/kg小鼠）、紅參傳統飲片組（2.34 g生藥/kg小鼠）、紅參破壁飲片等劑量組（2.34 g生藥/kg小鼠）、紅參破壁飲片1/2劑量組（1.17 g生藥/kg小鼠）、紅參破壁飲片1/4劑量組（0.59 g生藥/kg小鼠）、紅參破壁飲片1/8劑量組（0.29 g生藥/kg小鼠）。各試藥組動物均按0.1mL/10 g小鼠劑量連續灌胃給藥7天，正常對照組給予等體積生理鹽水。末次給藥60分鐘后，每只小鼠尾部捆綁相當于自身體重10%的重物后將小鼠置于水溫（20±0.5）℃，水深20 cm的恒溫水箱中強制游泳，從小鼠入水時起至沉到水底無力向上沖起時為止記為小鼠持續游泳時間。

2.2 耐缺氧作用比較研究[5-7]

選取NIH小鼠70只，隨機分為7組（分組同前），每組10只，均雌雄各半。各試藥組動物均按0.1 mL/10g劑量連續灌胃給藥3天，正常對照組給予等體積生理鹽水。末次給藥后1小時，將小鼠置于250 mL盛有鈉石灰20 g的磨口廣口瓶內，每瓶放1只，于瓶口涂凡士林，將蓋蓋嚴以造成瓶內氧氣逐漸減少，而形成缺氧環境，密封同時記錄時間，觀察在缺氧應激狀態下小鼠的活動，直至死亡，以呼吸停止為判斷死亡指標，記錄各小鼠的存活時間。

2.3 耐低溫作用比較研究[7-8]

選取NIH小鼠140只，隨機分為7組（分組同前），每組20只，均雌雄各半。各試藥組動物均按0.1 mL/10 g劑量連續灌胃給藥7天，正常對照組給予等體積生理鹽水。末次給藥30分鐘后，將小鼠放入（-18±1）℃冰箱中，每隔1小時開冰箱檢查1次（出現動物死亡后改為每30分鐘開冰箱檢查1次），拾出死亡動物，記錄3.5小時內動物死亡數，以各組動物的死亡率作為比較指標，比較各組小鼠的耐低溫能力。

2.4 急性毒性比較試驗[1-3]

取NIH小鼠90只，雌雄各半，按性別隨機分為正常對照組、紅參破壁飲片組和紅參傳統飲片組，30只/組（雌雄各半），給藥前禁食不禁水6小時，給藥后禁食4小時。試藥組以最大給藥量法單次灌胃給藥：紅參破壁飲片組按0.032 mL/g最大容積灌胃給予0.298 g生藥/mL的混懸液；紅參傳統飲片組按0.032 mL/g最大容積灌胃給予2.27 g生藥/mL的藥液；對照組按0.04 mL/g給予蒸餾水。灌胃后連續觀察14天，記錄動物的體重、精神狀態、毛發、自主活動、攝食量、糞便、口鼻分泌物等一般狀況，并記錄動物的不良反應和死亡情況。實驗結束時頸椎脫臼處死小鼠，解剖和肉眼觀察重要臟器顏色及形態學改變情況。

2.5 數據處理

采用SPSS 13.0統計軟件處理，進行單因素方差分析及組間t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 抗疲勞作用比較

結果如表1所示：與紅參傳統飲片組相比，等劑量的紅參破壁飲片組動物存活時間顯著延長（P＜0.05），即等給藥劑量下，破壁飲片對小鼠抗疲勞的作用比其傳統飲片更顯著（P＜0.05）；與傳統飲片比較，其1/2、1/4和1/8劑量的破壁飲片具有同等的抗疲勞作用。

表1 紅參破壁飲片及其傳統飲片對小鼠抗疲勞試驗的影響 （±s，n=10）

表1 紅參破壁飲片及其傳統飲片對小鼠抗疲勞試驗的影響 （±s，n=10）

注：與紅參傳統飲片組比較，*P＜0.05。

組別正常對照組陽性對照組紅參傳統飲片組紅參破壁飲片等劑量組紅參破壁飲片1/2劑量組紅參破壁飲片1/4劑量組紅參破壁飲片1/8劑量組存活時間（min）2.12±1.32 4.55±2.50 4.56±1.59 7.78±1.58*5.00±1.42 3.54±1.70 3.93±1.92

3.2 耐缺氧作用比較

結果如表2所示：同等給藥劑量相比，破壁飲片延長小鼠常壓缺氧存活時間的作用比其傳統飲片更顯著（P＜0.05）；與傳統飲片比較，其1/2、1/4、1/8劑量的破壁飲片均具有同等的提高小鼠耐缺氧作用。

表2 紅參破壁飲片及其傳統飲片對小鼠常壓缺氧存活時間的影響 （±s，n=10）

表2 紅參破壁飲片及其傳統飲片對小鼠常壓缺氧存活時間的影響 （±s，n=10）

注：與紅參傳統飲片組比較，*P＜0.05

組別正常對照組陽性對照組紅參傳統飲片組紅參破壁飲片等劑量組紅參破壁飲片1/2劑量組紅參破壁飲片1/4劑量組紅參破壁飲片1/8劑量組存活時間（min）29.07±4.06*36.65±3.34 37.12±4.13 43.28±7.89*37.88±4.26 35.99±7.01 37.74±11.30

3.3 耐低溫作用比較

結果如表3所示：與紅參傳統飲片組相比，等劑量的紅參破壁飲片能顯著降低小鼠死亡率（P＜0.05），即同等給藥劑量下，破壁飲片提高小鼠耐低溫的作用比其傳統飲片更顯著（P＜0.05）；與傳統飲片比較，其1/2劑量的破壁飲片具有同等的藥效作用。

表3 紅參破壁飲片及其傳統飲片對小鼠耐低溫作用的影響

3.4 急性毒性比較

與正常對照組比較，紅參破壁飲片組和紅參傳統飲片組動物灌胃給藥后，大部分動物均出現活動減少，神情倦怠，除此以外，未見其他明顯異常反應；1～3小時后，動物基本恢復正常，與正常對照組比較，無明顯異常。3小時后，各組動物的精神狀態良好、毛色光潔、活動自如、呼吸均勻、攝食量、糞便未見明顯異常、口鼻內無異常分泌物，無動物死亡。在給藥前、給藥后第3、第7和第14天，分別對動物進行稱重，各時間點動物體重均無明顯組間差異，見表4。

實驗結束時頸椎脫臼處死小鼠，解剖并肉眼觀察，主要臟器顏色及形態學無改變。實驗數據顯示，紅參破壁飲片組的小鼠最大給藥劑量為9.5 g生藥/（kg·d），換算成人體用量為1.05 g生藥/（kg·d），紅參傳統飲片的小鼠最大給藥劑量為72.6 g生藥/（kg·d），換算成人體用量為8.0 g生藥/（kg·d），均無急性毒性反應產生。紅參傳統飲片的成人（體重60 kg）臨床推薦用量為3.0～9.0 g生藥/d，即成人推薦用量為0.05～0.15 g生藥/（kg·d）。由此可見，以最大給藥量法對小鼠灌胃給藥紅參破壁飲片（劑量相當于其傳統飲片臨床用量的7～21倍），未出現急性毒性反應。

表4 紅參破壁飲片及其傳統飲片急性毒性實驗觀察結果 （±s，n=30）

表4 紅參破壁飲片及其傳統飲片急性毒性實驗觀察結果 （±s，n=30）

組別正常對照組紅參破壁飲片組紅參傳統飲片組動物數（n）30 30 30死亡數（n） 體重/g 0 0 0給藥前21±1.2 21±1.1 20±1.3給藥后3天23.8±2.2 24.6±1.6 22.5±1.4給藥后7天29.9±2.9 30.1±1.3 29.7±1.2給藥后14天37.2±3.2 36.3±1.8 36.5±1.3

4 討論

4.1 研究結果小結：綜合紅參破壁飲片與傳統飲片的3個藥效比較研究和急性毒性試驗結果，表明：①紅參破壁飲片和傳統飲片均有耐缺氧、抗疲勞和耐低溫的作用；②同等劑量下，紅參破壁飲片耐缺氧、抗疲勞和耐低溫的作用比其傳統飲片更顯著；③與傳統飲片比較，其1/2劑量的破壁飲片具有同等的功效作用；④以相當于其傳統飲片臨床最大用量的7倍劑量服用紅參破壁飲片時，未出現急性毒性反應，也未出現毒性反應大于其傳統飲片。

4.2 研究樣品制備及給藥方式：本試驗紅參破壁飲片由同批次的傳統飲片制備而成，可減少原料批次差異帶來的試驗誤差，保證試驗的平行可比；紅參破壁飲片的推薦應用方式為全成分服用（沖泡連渣服用或制成咖啡狀混懸液服用），而紅參傳統飲片的習慣應用方式為煎煮成湯劑服用，所以為保證試驗的準確性，本項目在開展藥效和安全性評價試驗時，給受試小鼠服用的樣品也盡量模擬實際應用方式而制備（破壁飲片制備成混懸液服用；傳統飲片制備成湯劑服用）。

4.3 劑量的設置：本試驗在設置不同劑量的組別時考慮了中藥藥效作用雙向調節的特點以及中藥破壁飲片的成分利用率提高對應用劑量的影響，所以試驗組除了設置與傳統飲片的等劑量組以外，還設置了能反映中藥破壁飲片減少服用劑量的低劑量組別。