VEGF過表達的骨髓間充質干細胞對大鼠牙槽骨缺損修復的影響

周芳 朱勇 唐成芳 王丹楊 李雪 黃碩

骨髓間充質干細胞(BMMSCs)具有多向分化潛能，為近期組織工程中骨骼損傷修復的研究熱點[1]。研究報道BMMSCs被應用于口腔牙周損傷的修復[2]。血管內皮生長因子(VEGF)是具有促進血管內皮生長及生成的糖蛋白，其參與骨愈合相關過程。研究表明，VEGF作為旁分泌因子促進骨折的修復、重塑過程，為骨形成或修復的正性調節因子[3-4]。本研究擬將二者優勢結合，通過轉染BMMSCs使其VEGF過表達并篩選穩定表達的細胞株，制作誘導成骨膜片，觀察VEGF過表達的膜片對大鼠牙槽骨損傷修復的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SD雄性大鼠40 只，體重(200±20) g ，由常州卡文斯實驗動物有限公司提供，動物質量合格證號(201722172)。

1.1.2 試劑 α-MEM培養基(Sigma公司,美國)；胎牛血清(FBS)(GIBCO公司,美國)；胰蛋白酶(Hyclone公司,美國)；VEGF過表達載體轉染試劑盒(上海吉瑪公司)；VEGF抗體、GAPDH抗體及羊抗小鼠IgG-HRP 抗體(CST公司,美國)；維生素C、茜素紅、油紅O、多聚甲醛、無水乙醇及其他分析純(國藥集團化學試劑有限公司)。

1.1.3 主要儀器 PIPETMAN L微量可調加樣器(Gilson公司,法國)；Allegra 64R Centrifuge臺式高速冷凍離心機(Beckman Coulter公司,美國)；CKX41倒置顯微鏡(Olympus公司,日本)；Thermo 311二氧化碳培養箱(Thermo scientific公司，美國)；BCM-1300A超凈工作臺(蘇凈安泰公司)。

1.2 方法

1.2.1 BMMSCs提取、分離培養及鑒定 取4 只SD大鼠脫臼處死，按文獻[1]方法提取分離BMMSCs，細胞以10% FBS 的α-MEM培養基培養在37 ℃、 5% CO2及飽和濕度條件的培養箱中，經48 h培養貼壁的細胞即為BMMSCs。按文獻[5]方法進行鑒定。

1.2.2 BMMSCs VEGF過表達轉染、篩選及驗證 細胞匯合度達70% 時開始轉染，參考文獻[6]以說明書方法將帶有表達綠色熒光的空載載體病毒液和VEGF過表達載體病毒液加入BMMSCs中，分別命名為對照組和過表達組，放入培養箱培養16 h,棄去上清并用PBS洗3 遍，加入全培養基繼續培養，穩定傳代1 周后用嘌呤霉素篩選穩定表達的細胞株，熒光顯微鏡和Western blot實驗驗證轉染效率。

1.2.3 成骨膜片的制作及驗證 將篩選的穩定轉染的過表達組和對照組BMMSCs胰蛋白酶消化5 min, 1 000 r/min離心10 min后以含10%FBS的α-MEM培養基重懸計數。按每孔3×105個/孔接種于6 孔板。放入培養箱培養，24 h時以10%FBS、50 mg/L維生素和α-MEM培養基配備膜誘導液，更換培養基為成膜誘導液，后間隔2 d換液1 次，16 d完成膜片制備，獲得的2 組膜片部分用來Vonkossa染色，顯微鏡下觀察膜片的組織結構。

1.2.4 建立牙槽骨損傷模型并植入細胞膜片 取36 只SD大鼠，以40 mg/L的2%的戊巴比妥鈉麻醉，手術暴露大鼠上頜骨并用牙科鉆在上頜骨兩側第一磨牙近中舌側牙槽骨造3 mm×3 mm×1 mm長方體骨缺損區域。大鼠上頜牙槽骨缺損處植入過表達組和對照組細胞膜片。同時以不植入細胞膜片設立空白組，每組12 只大鼠。而后縫合黏膜，術后注射抗生素3 d。

1.2.5 Micro-CT掃描 分別在術后第2、4、 6、 8周脫頸處死大鼠3 只， 取上頜骨置于4%的多聚甲醛固定， Micro-CT掃描并觀察牙槽骨缺損處成骨情況。

1.2.6 用Western blot法檢測VEGF蛋白表達 細胞培養匯合至70%，按實驗要求處理細胞后，按文獻[7]的方法進行蛋白提取、SDS-PAGE電泳、轉膜，及封閉。按需求加入VEGF抗體(1∶1 000)或GAPDH抗體(1∶1 000)4 ℃溫育過夜。次日，TBST洗膜3 次， 加入相應的辣根過氧化物酶標記二抗(1∶2 000)，室溫雜交1 h，PVDF膜以化學發光試劑盒進行顯色，用Syngene Imaging System進行成像，用Image J對蛋白印跡條帶進行處理和分析。

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 BMMSCs及過表達VEGF的BMMSCs的形態及鑒定

分離傳代后的BMMSCs形態多為菱形，生長狀態良好。過表達組和對照組BMMSCs在熒光顯微鏡下可見明顯綠色熒光。Western blot實驗發現與對照組相比，過表達組BMMSCs中VEGF表達提高(83.1±4.8)%(P<0.05)(圖 1)。

圖 1 各組BMMSCs形態、轉染后熒光和蛋白表達情況

2.2 細胞膜片制備后鑒定

過表達組和對照組膜片進行Vonkossa 染色，發現2 組膜片礦化結節染色陽性，如圖 2黑色箭頭所示，可見細胞外局部有黑色鈣結節。

2.3 牙槽骨損傷修復效果

與空白組相比，隨時間延長對照組牙槽骨修復效果較好，在第4和8 周結果具有統計學意義；與對照組相比，隨時間延長過表達組牙槽骨修復效果較好，在4、6和8 周結果具有統計學意義，數據見表 1。

Tab 1 Changes in bone volume fraction in the 3 groups (n=3， %，

注： 與空白對照組比較， ①P<0.05； 與對照組比較， ②P<0.05

圖 2 2 組BMMSCs膜片Vonkossa 染色結果

3 討 論

拔牙、牙齒長期缺失或增齡性變化等原因，都會導致牙槽骨缺損，而牙槽骨缺損為后續牙齒修復帶來了很多困難。研究發現，前傾及水平阻生的下頜第三磨牙拔除后會造成下頜第二磨牙遠中牙槽骨的缺損[8]。傳統骨損傷的修復為自體或同種異體移植術，因存在供區并發癥和免疫反應，所以急需新的骨損傷修復方法。組織工程學的興起為骨損傷修復提供了新的解決方案。BMMSCs為組織工程學成骨轉化和修復骨缺損的工具細胞[9]。多方研究報道BMMSCs在軟骨損傷修復中具有明顯優勢[9-11]。然而，單純以BMMSCs為工具的骨修復還不能達到理想目的。研究發現VEGF可通過細胞外信號調節激酶途徑促進BMMSCs的增殖[12]。而另有文獻報道，VEGF作為旁分泌因子促進骨折的修復、重塑過程，為骨形成或修復的正性調節因子[3-4]。這些都提示，VEGF在骨修復中可能發揮重要作用。

本研究提取分離BMMSCs，并通過轉染BMMSCs使其VEGF過表達，進一步實驗制作誘導成骨膜片，建立牙槽骨損傷模型并植入膜片，觀察VEGF過表達的膜片對大鼠牙槽骨損傷修復的影響。定期進行Micro-CT檢測發現，與空載轉染組相比，VEGF過表達的BMMSCs成骨誘導膜片明顯增強大鼠損傷牙槽骨的修復。提示VEGF可能通過促進BMMSCs功能的發揮或自身的分泌增強大鼠損傷牙槽骨的修復，然而具體機制還有待于進一步研究。本實驗還在動物實驗階段，需要臨床進行驗證?？傊?，本研究發現VEGF過表達的骨髓間充質干細胞能增強大鼠牙槽骨損傷的修復。