未知植物病毒分子生物學檢測方法的研究現狀

趙娜 苗艷梅 趙敏

摘要：植物的真菌病原菌可以通過核糖體RNA或者其他通用引物進行鑒定，植物病毒缺乏通用引物，這給植物未知病毒病的鑒定帶來較大挑戰。隨著分子生物學及測序技術的發展，出現了很多直接從植物病料中檢測未知病毒的方法，這些方法推進了植物病毒的發掘和病原鑒定，取得了非常好的效果。本文主要闡述近年來應用于檢測未知植物病毒的分子生物學方法。

關鍵詞：未知植物病毒：分子生物學：檢測方法

中圖分類號：$432.4+1 文獻標識碼：A 文章編號：1000-4440（2019）01-0224-05

對植物而言，植物病毒是僅次于真菌的第二大病原，由于其流行和爆發對糧食危害極大，且防治困難，故有植物癌癥之稱。據不完全統計，受植物病毒影響，全世界每年糧食總產量損失約10%。有關植物病毒的研究已有100多年歷史，但大多數研究僅限于農作物中的疾病，有很多植物病毒未被發現。植物病毒結構特殊，而且沒有通用的編碼序列，這增加了植物病毒研究的難度，植物病毒的多樣性仍是未知的，有待新的研究方法去揭秘。

植物病毒的傳統檢測方法主要包括指示植物鑒別法、血清學試驗法如酶聯免疫吸附試驗（ELISA）]、分子雜交技術法、電鏡技術法。最近，隨著分子生物學技術的迅猛發展，聚合酶鏈式反應（PCR）技術、基因芯片等已廣泛應用于植物病原的鑒定中。但是，利用這些常用試驗方法進行鑒定的前提是必須了解病原物的生物學特性和基因組特征。譬如，基因芯片技術可以一次性檢測10種病毒，但只能檢測未知病害植物中的已知病毒。這些方法對于植物未知病毒的挖掘以及植物新病害的診斷研究有很強的限制性，在實際工作中不易推廣。由此可見，未知植物病毒的檢測方法在新病毒發現方面發揮著十分重要的作用。本文重點闡述利用分子生物學技術檢測未知植物病毒的研究現狀。

1基于傳統分子生物學技術的未知病毒檢測方法

隨著分子生物學技術的發展，出現了很多針對未知植物病毒的檢測技術。由于植物病毒基因組結構較為簡單，多為1個或者2個開放閱讀框，且核酸會殘存在發病植物病料中，故可以通過追蹤、放大基因組本身的方法鑒定核酸序列，再與NCBI數據庫中已知病毒序列進行比對，利用生物軟件分析病毒生物學特征，確診病原?，F階段，基于傳統分子生物學的未知植物病毒檢測方法主要有雙鏈RNA（dsRNA）技術、cDNA代表性差異分析（RDA）技術、核酸序列非依賴性引物擴增技術等。

1.1 dsRNA技術

植物病毒基因組以RNA為主，占90%以上。雙鏈RNA是RNA病毒、類病毒等在寄主體內形成單鏈核糖核酸（ssRNA）的特異復制中間型產物，具有病毒特異性，且性質穩定，不隨寄主改變而改變。因此，提取植物組織或者病毒粒子中的dsRNA，可用于病毒種類鑒別，病毒侵染診斷。1986年Dale等首次從表現出典型癥狀的香蕉病株中分離得到dsRNA，并在以后的研究中確定存在于寄主植物韌皮部組織的病毒粒體為香蕉束頂病毒（BBTV）?，F階段，越來越多的研究者通過提純dsRNA，提高樣品中核酸的有效率，結合二代測序方法來檢測未知病毒。同時，dsRNA的提取方法也在不斷更新、完善，為植物病毒各個領域的研究提供技術保障。

1.2CDNA代表性差異分析技術

cDNA代表性差異分析技術建立在cDNA文庫的基礎上，通過提取患病和健康植物的總RNA，逆轉錄形成cDNA，對比患病植物與健康植物cDNA的差異，進行消減，減小文庫規模，進而得到差異的cDNA序列，進行多次雜交，去除相同核酸，降低二次擴增背景的影響。戰晴晴在構建柴胡全長cDNA文庫時，雖然首次發現蠶豆萎蔫病毒2（BB—WV-2）可以侵染柴胡，但沒有發現新病毒?？傊?，cDNA代表性差異分析方法較為繁瑣、費時，且發現新病毒的幾率較小。

此外，Cooper等利用高效液相色譜一串聯質譜（HPLC-MS/MS）方法，通過分析差異表達蛋白質來鑒定植物感染的未知病原體。這種利用質譜法分析差異蛋白質的方法類似于cDNA代表性差異分析技術，但由于其數據的缺失值較多，獲得結果的質量好壞以及可靠性高低參差不齊，給差異蛋白質的篩選造成了很大阻力。

1.3核酸序列非依賴性單引物擴增技術

核酸序列非依賴性單引物擴增技術（sISPA）是一種平末端連接擴增技術，原理如圖1顯示，起初僅用于檢測DNA病毒，后來有學者采用改良的DNase-SISPA技術測定未知DNA和RNA病毒的序列，證實了該擴增方法對RNA病毒檢測的有效性。由于該方法不需要提純病毒，可以直接從病樣中提取核酸，所以近年來越來越多的實驗室通過此方法檢測未知植物病毒。趙西梅通過提取dsRNA病毒，并以其為模板進行非序列依賴性PCR擴增，成功從有病癥的地黃中分離到油菜花葉病毒（ORMV）和地黃花葉病毒（ReMV），從有病癥的白術中分離出香豆萎葛病毒2號（BBWV2）。

1.4簡并核苷酸引物擴增技術

簡并核苷酸引物擴增技術（DOP）是通過巧妙設計引物來進行序列非依賴性擴增的，原理如圖2顯示，以3’端和5’端的特異性核苷酸序列以及中間6個核苷酸構成的隨機引物為引物群.起初的引物是很隨機的，但隨著3’端引物上特異性核苷酸的結合，在隨后的反應過程中，擴增產物的核酸匹配度越來越高，產物通過測序比對，即可找到未知的植物病毒序列。Badillo等對葉脈有條紋狀壞死而且頂梢和葉側脈部變黃的番茄植株進行檢測時，利用等軸不穩環斑病毒屬（I/arv/rus）簡并引物的方法進行擴增，最終獲得番茄壞死條紋病毒（TomNSV）全基因組，基因組分析結果表明，該病毒是亞組2的新成員。Ciuffo等在調查葉片具有病毒樣癥狀（花葉、畸形和壞死）的萵苣時，利用馬鈴薯Y病毒屬（Potyvirus）外殼蛋白（CP）所設計的簡并引物成功擴增出1種新病毒，暫命名為意大利萵苣壞死病毒（LINV），該病毒可以通過桃蚜非持久性方式進行傳播。

Shahid等在鑒定黑莓黃脈病病原時，利用簡并引物檢測到一種新的雙鏈DNA病毒，暫時稱為黑莓病毒F（BVF），該病毒為桿狀DNA病毒屬（Bad-navirus）新成員。一種暫命名為金盞花花葉?。ˋd-MV）的香石竹斑駁病毒屬（Carmovirus）新成員是科研人員通過簡并引物方法發現的。由于簡并引物技術可操作性較強，耗時短、費用低，近年來在很多植物的未知病原鑒定中發揮重要作用。

2基于新型測序技術的未知病毒檢測方法

上述幾種未知病毒檢測的最終結果都必須依靠核酸的Sanger測序技術，通過NCBI網站Blast比對最終確定病毒種類。第二代測序技術（NGS）的推出，打破了Sanger測序技術的瓶頸，進入高通量測序技術時代，為挖掘新的未知病毒提供了新思路。

NGS從2009年開始應用于植物病毒領域，該領域包括植物病毒的發現，基因組序列測定以及生態學和流行病毒學的研究。這種新檢測技術的流程主要包括樣品核酸的準備，核酸文庫的構建，上機測序，生物信息學數據分析等基本過程。根據核酸樣品的不同來源，可以將NGS技術分為2大類，其中一類以宏基因組為研究對象，另一類以siRNA（Small interfering RNA）為研究對象。

2.1基于宏基因組學的NGS

宏基因組學以特定生態環境中全部微生物的遺傳信息為研究對象，來研究部分微生物的功能基因篩選以及微生物與環境或者個體之間的關系，樣品中病毒核酸如何富集，即核酸的有效性是保證序質量的關鍵。利用NGS的宏基因組學對植物病毒的最早研究來自于英國學者Adams等，為了保證NGS測序質量，提高樣品核酸的有效性，先將從蛇鞭菊中獲得的病原分離物摩擦接種到千日紅，再通過對宿主核酸消減雜交，構建cDNA，進行NGS，最終獲得一個名為蛇鞭菊輕斑駁病毒（GMMV）的黃瓜花葉病毒屬（Cucumovirus）新成員。同樣，Green等13伽將病樣分離物摩擦接種于本氏煙，從而提取有癥狀的本氏煙總RNA，構建cDNA文庫，利用Illumi-na公司的NextSeq 500平臺進行NGS，最終獲得蕪菁黃花葉病毒屬（Tymovirus）的新成員，暫時命名為奎東茄褪綠花葉病毒（NarCMV）。

Tang等為了提高NGS病毒序列的檢出率，先將病原分離物摩擦接種于本氏煙，提取本氏煙總核酸，利用脫氧核糖核酸酶I消除DNA，同時消減宿主的rRNA，利用消減后的RNA構建eDNA文庫，基于454平臺進行NGS，最終獲得一個暫時命名為罌粟花葉病毒（OPMV）的全基因組序列。值得關注的是，根據RNA病毒中間體dsRNA的特征，Petrzik等通過直接提取樣品中的dsRNA，大大減少宿主核酸的影響，構建文庫，進行NGS，最終獲得醋栗病毒A（cu-VA）。此外，為了進一步減少宿主核酸的影響，Pardi-na等直接從提純的病毒顆粒中提取核酸，進行NGS，最終獲得甘薯G病毒（sPVG）的全基因組序列。

2.2基于siRNA深度測序的NGS

siRNA是在RNA沉默機制中產生的一種具有序列特異性調控功能的分子。植物RNA沉默機制的主要功能之一是抗病毒。植物對病毒產生適應性免疫應答反應，會在被病毒侵染的植物細胞中產生與病毒相關的siRNA，這些siRNA可用于檢測植物中的RNA和DNA病毒，甚至可用于檢測一些結構新穎的類病毒。siRNA與已知病毒沒有明顯的序列相似性，因此，siRNA高通量測序技術不依賴于已知病毒信息，可以檢測樣品群體中的全部病毒信息，適用于新病毒的發現，為植物未知病毒研究開拓新的思路。

迄今為止，通過對siRNA進行NGS，檢測植物未知病原分離物較成功的案例來自于li等的報道。他們提取有癥狀番茄樣品中的siRNA，并進行深度測序，生物信息學分析結果表明，樣品中含有馬鈴薯紡錘塊莖病類病毒（PSTVd）、鳳果花葉病毒（PepMV）和1種新的病毒暫時命名為番茄壞死矮化病毒（ToNSV）]。有學者采用siRNA深度測序技術，發現了2種薔薇科植物內侵染的新病毒，即來自野薔薇樣品的玫瑰葉叢簇伴隨相關病毒（RLRaV）和來自有果實開裂癥狀桃植株樣品的桃裂果伴隨相關病毒（Pc-FaV）。此外，陳莎利用小RNA深度測序技術對云南省和貴州省玉米病毒病進行檢測，獲得3種未知的RNA病毒[玉米黃化花葉病毒（MYMV）、玉米相關的形影病毒（MAUV）、玉米相關的整體病毒（MATV1）]和1種國內首次報道的DNA病毒留尼旺玉米線條病毒云南分離物（MSRV-YN）]。

3展望

植物病毒多樣性的研究尚處于起步階段，作物中新病毒的發現，野生植物中新病毒的潛在生態影響以及病毒在感染植物中的潛在作用，這些問題的解決都依賴于未知病毒檢測技術的發展。綜上所述，利用已有的基因組序列，設計各個病毒屬所特有的簡并引物進行擴增，這種方法操作簡單、費用低，是研究人員發現新病毒的首選方法。由于病毒種類繁多，所以研究人員需要克服簡并引物設計的困難。

NGS技術具有高效、快速、非序列依賴性的優勢，革新了發現和鑒定病毒的方法，在短短5年時間內發現多種新病毒種類，但是NGS也有一定缺陷。首先，對于病毒滴度較小的病毒，二代測序技術往往會忽略該類病毒的存在：其次，NGS雖然可以發現傳統方法難以發現的新病毒，但是它往往會忽略科赫法則，不能證明新病毒是導致病害的病原體;再次，對于較大規模的植物病毒種類普查項目，二代測序技術的成本昂貴?？傊?，單一的未知植物病毒分子生物學檢測技術，難免存在局限性，所以在實際應用中，應根據樣品和調查項目狀況，有針對性地選擇1種或者幾種檢測技術，才能有效挖掘更多未知的植物病毒。