不同環境因子和碳氮源對短小芽孢桿菌BP-171無機氮降解特性的影響?

宋 君， 趙 坤， 田相利，2??， 解玉萌， 何 玉， 董雙林，2

(1 海水養殖教育部重點實驗室(中國海洋大學)，山東 青島 266003；2 青島海洋科學與技術國家實驗室，山東 青島 266237)

在水產養殖中，高濃度的氨態氮和亞硝酸態氮往往會對養殖動物產生嚴重的脅迫，甚至導致死亡，因此如何將有毒形態的氮元素轉化為無毒的硝酸態氮一直是水產養殖環境管理重要內容之一[1]。然而，隨著水產養殖業的進一步發展及對周圍環境的影響，包括硝酸態氮在內的氮污染物在水產養殖水體中積累問題也越來越受到人們的關注。實際上，氮污染物的去除一直以來都是人們在污水處理中非常關心的問題，而生物脫氮是被認為目前處理污水和廢水氮污染物最經濟有效的方法之一[2]。但傳統的生物脫氮過程往往是由好氧硝化與厭氧反硝化兩個相互獨立的過程構成的，且作用于兩個反應階段的菌群及環境條件都不相同，因此傳統脫氮工藝比較復雜，致使生物脫氮的應用在一定程度上受到了限制[3]。然而，隨著越來越多的異養硝化菌-好氧反硝化菌被分離出，像產堿菌屬(Alcaligenes)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、假單孢菌屬(Pseudomonas)、戴爾夫特菌屬(Delftia)等，傳統的生物脫氮理論正在逐步被打破[4-5]。異養硝化菌和好氧反硝化菌具有生長快，脫氮效率高，可有效地去除水體氮素的過度積累，而且在處理過程中也可避免好氧區和厭氧區隔開分別進行的麻煩等優點。鑒于此，不同于工業和生活污水處理，如何篩選出適合水產養殖系統使用的異養硝化-好氧反硝化菌成為了相關領域研究的熱門。目前盡管異養硝化細菌對無機氮的去除特性的研究已有較多報道，但系統地對其無機氮降解機制和脫氮途徑的研究卻少見報道。本研究的所用短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus，編號BP-171)分離于海水蝦蟹養殖池塘。前期初步的研究發現，此菌株可有效降低水體中氨態氮和亞硝態氮濃度(未發表數據)。本研究在此基礎上進一步研究了不同環境因子和碳氮源條件下其脫氮特性，以查明環境因子對其脫氮性能的影響并對其脫氮機制進行初步探究，從而為其在水產養殖中的水質管理中的可能應用提供理論參考和技術支撐。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

本研究所使用短小芽孢桿菌菌株BP-171來自于本實驗室保種庫，是由本實驗分離自蝦蟹養殖池塘。

1.2 試劑

實驗過程中的所使用的化學試劑除了過硫酸鉀購自Sigma公司外，其余的化學試劑均從國藥集團公司購買。

1.3 培養基

本研究所使用的培養液主要如下：

經適當改進的2216E液體培養液：向1 000 mL海水中加入酵母2～2.5 g，胰蛋白胨6 g，121 ℃，20 min滅菌。

氨氮單一氮源培養液：2.080 8 g C6H12O6·H2O+0.160 5 g NH4Cl +1 L海水，121 ℃，20 min滅菌。

亞硝酸態氮單一氮源培養液：2.080 8 g C6H12O6·H2O+0.207 g NaNO2+1 L海水，121 ℃，20 min滅菌。

硝酸態氮單一氮源培養液：2.080 8 g C6H12O6·H2O+0.255 g NaNO3+1 L海水，121 ℃，20 min滅菌。

混合氮源培養液：2.080 8 g C6H12O6·H2O+0.085 g NaNO3+0.069 g NaNO2+0.053 5 g NH4Cl+1 L海水，121 ℃，20 min滅菌。

1.4 不同環境因子及碳源對菌株BP-171脫氮特性影響的實驗

本研究選擇的環境因素分別為pH、C/N、鹽度3個因素以及不同的碳源，每個處理分別設置了5個重復。各因子具體設置如下：

(1)碳源：乙酸鈉、丁二酸鈉、檸檬酸鈉、蔗糖、乳糖和葡萄糖；

(2)C/N：3、6、12、18、24；

(3)pH：4、5、6、7、8、9；

(4)鹽度：0、10、20、30、40、50、60。

實驗前將菌株BP-171預培養至對數期，按5%的接種量即吸取5 mL對數期菌液分別接種至含有100 mL滅菌后的氨氮單一氮源培養液、亞硝酸態氮單一氮源培養液和硝酸態氮單一氮源培養液中，氨氮初始濃度、亞硝酸鹽氮初始濃度、硝酸鹽氮初始濃度均約為42 mg/L，并分別設置不加入菌液的相應培養液作為空白對照。實驗中除研究因子外，其它實驗條件均設為：溫度28 ℃、鹽度30、pH=7.0、碳源為葡萄糖、C/N為18、振蕩器轉速為160 r/min。

1.5 菌株BP-171對不同氮源的脫氮性能研究的實驗

以氯化銨、亞硝酸鈉、硝酸鈉為單一氮源以及三者按1∶1∶1比例配制的混合氮源的4種培養液作為菌株BP-171的脫氮測試液，分別設置單一氨態氮濃度、單一亞硝酸態氮濃度、單一硝酸態氮濃度以及三氮混合總無機氮濃度均為42 mg/L，分別設置不加入菌液的相應培養液作為空白對照，研究菌株BP-171對不同氮源的脫氮特性。

將預培養的處于對數增長期的菌液(OD600約為1.0)接入盛有高溫滅菌后的100 mL測試液的250 mL的三角瓶中，實驗設置5個重復，實驗條件設置溫度為28 ℃、鹽度為30、pH為7.0、碳源為葡萄糖、C/N為18、振蕩器轉速為160 r/min、菌接種量為5%。連續培養5天，每天檢測培養液中菌體的生長量(OD600)，氨態氮、亞硝酸態氮、硝酸態氮、菌體有機氮、菌液有機氮以及總氮的濃度。

1.6 分析方法

計算菌株BP-171對降解液中無機氮的去除率所依據公式：

2 結果

2.1 不同環境因子及碳源對菌株BP-171脫氮特性的影響

2.1.1 不同碳源對菌株BP-171脫氮特性的影響 在不同碳源下，相應空白對照中的氨態氮、亞硝酸態氮和硝酸態氮含量在實驗前后均未發生改變，菌株BP-171對氨態氮、亞硝酸態氮和硝酸態氮去除情況如圖1所示。當以乙酸鈉和乳糖作為碳源時，菌株BP-171幾乎沒有脫氮能力，且菌株生長狀況也不好；而以蔗糖和葡萄糖作為氮源時菌株BP-171對無機氮的去除效果都較好，對氨態氮、亞硝態氮、硝態氮的去除率分別為74.07%和73.36%、37.39%和54.26%、87.88%和76.31%。綜合該菌對3種氮源的去除率，當碳源為葡萄糖時，菌株BP-171對無機氮氮的去除能力最佳。

圖1 不同碳源對菌株BP-171對無機氮去除的影響

2.1.2 不同C/N對菌株BP-171脫氮特性的影響 在不同C/N下，相應空白對照中的氨態氮、亞硝酸態氮和硝酸態氮含量在實驗前后均未發生改變，菌株BP-171對氨態氮、亞硝酸態氮和硝酸態氮去除情況如圖2所示。當C/N在12～24之間時，菌株BP-171對氨態氮、亞硝酸態氮和硝酸態氮均有較好的去除率；且當C/N比為18左右時，菌株對氨態氮和亞硝態氮的去除率最大，分別為76.88%和48.81%；而菌株對硝酸態氮的降解能力是隨著碳氮比的增加而增加的，當C/N比為18和24時，菌株BP-171對硝酸態氮的降解率分別為78.21%和83.07%。綜合碳氮比對菌株BP-171脫氮特性的影響，當C/N為18時菌株BP-171對無機氮去除能力最佳。

圖2 碳氮比對菌株BP-171對無機氮去除的影響

2.1.3 不同鹽度對菌株BP-171脫氮特性的影響 在不同鹽度下，相應空白對照中的氨態氮、亞硝酸態氮和硝酸態氮含量在實驗前后均未發生改變，菌株BP-171對氨態氮、亞硝酸態氮和硝酸態氮去除情況如圖3所示。菌株BP-171對氨態氮、亞硝酸態氮和硝酸態氮的去除效果均是先隨鹽度增高而增強，當鹽度超過30后，其去除效果又隨鹽度增高的而降低?？傮w來說，在鹽度20～40條件下，菌株BP-171對氨態氮、亞硝酸態氮和硝酸態氮均有較好的去除率，但在鹽度為30時菌株BP-171對氨態氮、亞硝酸態氮和硝酸態氮去除效果最好，最高去除率分別為72%、53.95%和71.48%。

圖3 鹽度對菌株BP-171對無機氮去除的影響

2.1.4 不同pH對菌株BP-171脫氮特性的影響 在不同pH下，相應空白對照中的氨態氮、亞硝酸態氮和硝酸態氮含量在實驗前后均未發生改變，菌株BP-171對氨態氮、亞硝酸態氮和硝酸態氮去除情況如圖4所示。菌株BP-171在pH為5～9范圍內對氨態氮均有較好的去除率，說明菌株在較廣的pH范圍內有較強的異養硝化作用。菌株在pH為6～9范圍內對亞硝酸氮有較好的去除效果，菌株在pH為7～9的范圍內對硝酸氮有較好的去除效果。故綜合pH對菌株BP-171的脫氮特性的影響，在pH為7～8時菌株BP-171對氨態氮、亞硝酸態氮和硝酸態氮均有較高的去除率，特別在pH為7.0左右，菌株BP-171對無機氮的去除效果最佳，對氨態氮、亞硝酸態氮和硝酸態氮的去除率分別為74.02%、55.79%和72.52%。

圖4 pH對菌株BP-171對無機氮去除的影響

2.2 菌株BP-171對不同氮源的脫氮性能的研究

圖5 氨氮培養液中各指標的動態變化

2.2.2 菌株BP-171以亞硝酸鈉為單一氮源時的好氧反硝化過程 在以亞硝酸鈉為唯一氮源時，空白對照中亞硝氮和總氮含量實驗前后均未發生改變，實驗后未檢測出氨氮、硝氮和有機氮成份，菌株BP-171對降解液中不同形態氮的影響如圖6所示。當以亞硝酸鈉為唯一氮源時，菌體BP-171的生長相對較慢。在實驗第2天，亞硝酸氮的去除率達到51.21%，而在后3天亞硝態氮含量變化不大，第5天后菌株對亞硝酸態氮去除率為53.61%；實驗過程中沒有氨氮的積累，實驗初期有部分硝酸態氮的積累，之后降解液中的硝酸態氮含量逐漸減少；菌體有機氮隨著菌體的生長不斷增加，菌液中的有機氮不斷減少；降解液中總氮顯著降低了23.89%?？傮w上看，菌株BP-171主要將部分亞硝態氮通過菌體同化，另有部分轉變為硝態氮，還有部分氮被從系統中脫除。

圖6 亞硝酸鹽氮培養液中各指標的動態變化

2.2.3 菌株BP-171以硝酸鈉為單一氮源時的好氧反硝化過程 在以硝酸鈉為單一氮源時，空白對照中硝氮和總氮含量實驗前后均未發生改變，實驗后未檢測出氨氮、亞硝氮和有機氮成份，菌株BP-171對降解液中不同形態氮的影響如圖7所示。菌株BP-171對降解液中硝酸態氮去除率高達83.39%，期間伴隨少量的氨態氮和亞硝態氮的積累；菌體有機氮有所積累，菌液有機氮則顯著減少；總氮含量顯著降低30.98%?？傮w上看，菌株BP-171對無機氮的去除主要通過反硝化作用和菌體生長的同化，以及少量向氨態氮和亞硝態氮的轉化。

圖7 硝酸鹽氮培養液中各指標的動態變化

2.2.4 菌株BP-171以混合三氮源作為氮源的同步異養硝化-好氧反硝化過程 在以3種氮源為混合氮源時，空白對照中3種無機氮和總氮含量實驗前后均未發生改變，實驗后未檢測出有機氮成份，菌株BP-171對降解液中不同形態氮的影響如圖8所示。當3種氮源同時存在時，菌株優先利用氨態氮，其次是亞硝態氮，最后是硝態氮。在實驗的第一天后菌株對混合氮源中的氨態氮去除率即達97.89%；降解液中亞硝態氮和硝酸態氮濃度均逐漸降低，實驗結束時，二者的去除率分別78.73%和46.57%；總氮含量明顯減少，總體降低15.14%；隨著細菌的生長，菌體有機氮含量增加，但菌液中的有機氮顯著降低。

圖8 混合三氮源培養液中各指標的動態變化

3 討論

3.1 環境條件對菌株BP-171的無機氮降解能力的影響

微生物在處理含氮廢水中有較大的研究和應用價值，而一株益生菌菌株能否成功應用于生產實踐中，不僅需要菌株本身具有較高轉化和脫氮性能，也需要其對環境條件具有較寬泛的適應性[9]。本研究所用菌株分離于蝦蟹養殖池塘，故測試溫度設置在了28℃。在此設置溫度條件下，主要研究了碳源、C∶N(質量比)、鹽度、pH等對菌株BP-171無機氮去除能力的影響。

碳源在菌株的反硝化過程中提供能量和電子，而不同的碳源對應著不同的分子量和空間結構，其能被利用的難易程度也不相同，所以不同碳源下菌株的生長狀況和脫氮能力也不同[10-13]。研究發現，位于細胞質膜和細胞壁之間的周質還原酶是起好氧反硝化作用的主要硝酸鹽還原酶，其活性大小與添加的碳源還原性有關。安健等[14]的研究結果表明凝結芽孢桿菌(Bacilluscoagulans)對小分子碳源乙酸鈉和丁二酸鈉的利用率相對高于對大分子碳源乳酸、蔗糖和水楊酸鈉的利用。但本研究中，當碳源為乙酸鈉和乳糖時，菌株BP-171幾乎無法體現其乎異養硝化作用和好氧反硝化作用，但在利用蔗糖和葡萄糖作為碳源時，菌株對無機氮的降解效果較好。相比較，蔗糖是非還原性二糖，葡萄糖和乳糖是還原性單糖，可見菌株BP-171對碳源的利用與碳源分子量大小及其還原性并無直接相關關系，這與前人的研究結果并不一致[14]。這表明，不同種屬菌株之間對碳源的利用特性也不盡相同，這或許與菌株自身特性存在的差異有關，尚待進一步研究確定。

除了菌株對碳源的利用有顯著差異外，細菌異養硝化-好氧反硝化過程中的碳氮比對于菌株脫氮能力的影響也有顯著差別。一般來講，異養菌的生長繁殖通常需要有機物作為碳源和能源，有機碳不足時不利于菌體生長，相應的生理功能也會降低[15]。異養硝化-好氧反硝化菌對C/N的要求也較高,李衛芬等[10]研究表明，在一定范圍內，碳氮比值越高，異養硝化菌的好氧反硝化速率越快。但不同菌種和菌株之間，適宜的碳氮比差異也比較大。例如，施氏假單胞菌(Pseudomonasstutzeri)菌株F1的最佳C/N為5[10]，雷氏普羅威登斯菌株(ProvidenciarettgeriYL)為C/N為10[16]，而假單胞菌屬(Pseudomonassp.)菌株XS76[1]去除氨氮的最適C/N則為15。本研究發現，菌株BP-171對氨態氮和亞硝酸態氮的去除率在C/N為18時最高，分別為76.88%和48.81%，對硝酸態氮的脫氮率也大大提高，達到78.21%。但當進一步增加C/N到24時，盡管對硝酸態氮的脫氮率顯著提高，但對氨態氮和亞硝酸態氮的去除率卻顯著下降，可能與過多的碳源會嵌入酶結構會導致酶活性降低，進而硝化能力導致下降有關[17]。值得注意的是，在水產養殖水體中，實際上的C/N一般會很低[18]，因此關于養殖水體的碳源種類選擇、碳源的添加方式乃至水處理的工藝等方面均尚需進一步加強研究。

pH也是影響不同脫氮菌株對氮轉化和脫除性能的重要環境因子之一。Gupta等[19]研究表明，當pH為中性或偏弱堿性時細菌的生長及反硝化酶活性最強，pH過高或過低都不利于菌株生長及反硝化性能的發揮，王弘宇等[20]和廖紹安等[21]的研究也同樣表明，pH為中性條件最有利于菌株生長及反硝化性能的發揮，這與本研究結果一致。本研究結果顯示在pH為7～8時菌株BP-171對氨態氮、亞硝酸態氮、硝酸態氮均有較高的去除率，特別在pH為7.0左右脫氮效果最佳，對氨態氮、亞硝酸態氮和硝酸態氮的去除率分別為74.02%、55.79%和72.52%。

微生物可以通過滲透壓調節自身新陳代謝，因而對鹽度有一定的適應能力[22]，但不同菌株對鹽度的適應能力也存在較大差異。本研究中菌株BP-171分離自海水蝦蟹養殖池塘，可以看出對鹽度的適應范圍較寬，在0～60范圍內均可生長，在鹽度20～40條件下，對氨態氮、亞硝酸態氮、硝酸態氮均有較好的去除率。但相比較，以鹽度為30時菌株BP-171對氨態氮、亞硝酸態氮和硝酸態氮去除效果最好，最高去除率分別為72.00%、53.95%和71.48%?？梢钥闯?，本研究中的短小芽孢桿菌BP-171是一株比較適宜海水養殖水體無機氮去除中應用的益生菌。

3.2 不同氮源對菌株BP-171的無機氮去除能力的影響

本研究還測試了以氨態氮、亞硝態氮和硝態氮3種氮源同時存在時菌株BP-171無機氮去除特性。從利用程度看，對氨態氮的去除效率高于以氯化銨為唯一氮源的情況，在實驗的第一天后菌株對混合氮源中的氨態氮幾乎全部去除，去除率已高達97.89%；對亞硝酸氮的去除效率也高于以亞硝酸鈉為唯一氮源的情況，去除率最高可達53.61%。這表明硝酸鹽的加入促進菌體對氨氮以及亞硝氮的代謝?？梢钥闯?，當3種氮源同時存在時，菌株BP-171會同時利用三者進行同步異養硝化-好氧反硝化作用[23, 29-30]。不過相比較，在多氮源存在的情況下，菌株BP-171對硝酸鹽的去除率有所降低，硝酸態氮的降解率總體低于以硝酸鈉為唯一氮源的情況(46.57%和83.39%)?？梢钥闯?，由于氨態氮與亞硝態氮的存在，菌株對硝酸態氮的利用主要發生在實驗后3天。降解液中總氮的減少與硝態氮的減少步調基本一致，因此，推測降解液總氮的減少是由于菌株利用硝酸態氮進行反硝化作用產生了氣態形式的氮，如N2O或N2。不過，具體產生了何種氣體還需要進一步研究確定。

4 結論

(1)短小芽孢桿菌菌株BP-171是一株異養硝化-好氧反硝化菌。

(2)在溫度28 ℃條件下，菌株BP-171在碳源為葡萄糖、C/N=18、鹽度20～40和pH=7.0～8.0條件下對降解液中無機氮有較好的去除作用。

(3)菌株BP-171對無機氮的轉化和去除包括菌體細胞的同化作用、異養硝化作用和好氧反硝化作用等生物學過程，不同氮源條件下具體機制有所差異。