擬輪枝鐮孢菌毒素粗提液對玉米種子發芽及幼苗生長的影響

劉春元 邢小萍 韓衛麗

摘要 為建立玉米雜交種和自交系利用擬輪枝鐮孢菌毒素抗性篩選的試驗方法，制備擬輪枝鐮孢菌毒素粗提液，測定不同稀釋倍數毒素粗提液對2個玉米雜交種和4個玉米自交系處理4 和6 d后的種子發芽抑制率、胚根生長抑制率以及幼苗致萎效果，分析不同抗性玉米種質、毒素稀釋倍數和處理時間對玉米種子發芽、胚根和幼苗生長的影響。結果表明，易感雜交種豫玉22與抗性雜交種農大108的種子發芽抑制率和胚根生長抑制率均存在極顯著差異（P<0.01）;在處理后4、6 d時，前者的種子發芽抑制率、胚根生長抑制率分別比后者高7.2%、11.3%、12.7%、11.8%。在對玉米雜交種幼苗致萎蔫試驗中，用稀釋2倍和5倍的毒素粗提液處理，豫玉22與農大108雜交種幼苗間的萎蔫程度也存在顯著差異（P<0.05）。擬輪枝鐮孢菌毒素粗提液對不同抗性玉米種質種子發芽、幼苗生長的影響存在顯著差異，為利用擬輪枝鐮孢菌毒素粗提液對玉米品種進行苗枯病抗性鑒定和篩選提供理論依據。

關鍵詞 玉米苗枯病;擬輪枝鐮孢菌;毒素粗提液;發芽率;胚根生長

中圖分類號 S432.1文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2019）19-0158-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.19.046

Abstract In order to establish a simple method for evaluating the resistance of maize hybrids and inbred lines，? the crude toxin extract from the culture medium of Fusarium verticillioides was prepared ， and? the seed germination inhibition rate， radicle growth inhibition rate， as well as the wilting degree of 2 maize hybrids and 4 inbred lines under the treatment of the crude toxin at various dilutions and different treatment duration （4 or 6 d） were determined. The results showed that the susceptible hybrid Yuyu22 and resistant hybrid Nongda108 significantly differed in the inhibition rates of seed germination and radicle growth （P<0.01）， and the inhibition rates of seed germination and radicle growth of Yuyu22 were 7.2%， 11.3% and 12.7%， 11.8% higher than those of Nongda 108. An obvious difference between Yuyu22 and Nongda108 was also found under the treatment of the crude toxin extract at 2 and 5 diluted solution （P<0.05）.

The effects of crude extracts of fusarium rotatum toxin on seed germination and seedling growth of different resistant maize germplasms were obviously different， which provided certain basis for identification and screening of resistance to bacterial blight of maize varieties by using crude extracts of fusarium rotatum toxin.

Key words Maize seedling wilt disease;Fusarium verticillioides;Crude toxin extract;Germination rate;Radicle growth

玉米苗枯病是玉米生產中發生廣泛、為害嚴重的病害之一。近年來，由于感病品種推廣、種子帶菌、栽培管理粗放及環境條件改變等原因，導致該病頻繁發生，對玉米生產造成嚴重影響[1-3]。引起玉米苗枯病的病菌主要有鐮孢菌、立枯絲核菌、腐霉菌等。其中，擬輪枝鐮孢菌（Fusarium verticillioides）是主要病原菌之一[4-7]。該病菌寄主范圍廣泛，能侵染玉米、小麥等多種糧食作物，常引起苗枯、莖腐、穗腐等癥狀，對作物生產造成嚴重損失。該菌有性態為藤倉赤霉（Gibberella fujikuroi），在為害寄主的過程中，能產生多種非寄主?；舅?，對人和動物有很強的毒性[8]。研究表明，除影響糧食及其產品安全外，該類毒素還與人類癌癥發生有關[9-10]。

利用抗病品種是防治該病的有效措施之一[7]。近年來，利用病原菌毒素進行抗性材料的篩選逐漸成為品種抗性鑒定的一項重要方法。該方法可以快速、簡便地對大量材料進行初篩，目前已在稻瘟病菌[11-12]、棉花黃萎病菌[13]、小麥赤霉病菌[14]、煙草赤星病菌[15]等病原菌的抗性資源篩選中廣泛應用。而針對擬輪枝鐮孢菌毒素在玉米品種抗性鑒定中的應用較少。因此，筆者以引起玉米苗枯病的主要病原菌擬輪枝鐮孢菌為供試病原菌，測定不同濃度的擬輪枝鐮孢菌毒素粗提液對供試玉米雜交種和自交系的種子發芽和胚根生長的影響和幼苗的致萎蔫能力，分析毒素粗提液對玉米種子發芽和幼苗生長的影響，從而探討利用病菌毒素粗提液篩選抗源材料的可能性，以期為利用毒素快速篩選抗源材料提供依據，加快抗病育種進程。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 玉米種子。

玉米雜交種：農大108，對玉米苗枯病表現抗病;豫玉22，對玉米苗枯病表現為感病。

玉米自交系：5008-1、熊掌S以及BT，對玉米苗枯病表現抗病;N6，對玉米苗枯病表現感病。

供試玉米材料分別由河南省農業科學院、鄭州國家玉米改良分中心提供。

1.1.2 供試菌種。

從河南省玉米苗枯病的發病田間采集病樣，經組織分離、純化后，按柯赫氏法則進行鑒定，確定為擬輪枝鐮孢菌，在4 ℃冰箱保存。

1.1.3 培養基。

Richard 培養基：硝酸鉀（KNO3）10.0 g，硫酸鎂（MgSO47H2O）2.5 g，磷酸二氫鉀（KH2PO4）5.0 g，氯化鐵（FeCl3）0.02 g，蔗糖50.0 g，蒸餾水1 000 mL。配制后分裝，121 ℃下高壓滅菌20 min。

1.2 試驗方法

1.2.1 擬輪枝鐮孢菌毒素粗提液制備。

將保存在4 ℃冰箱的擬輪枝鐮孢菌轉置PDA培養基平板上，25 ℃條件下培養7 d。在無菌條件下，用直徑7 mm打孔器將長滿病原菌的PDA培養基切成菌塊，再轉置于裝有Richard培養液的三角瓶中，每瓶分裝5個菌塊。將三角瓶放在振蕩培養箱（22 ℃，1 400 r/min）培養20 d，而后用12層紗布過濾。將濾出液在6 000 r/min下離心20 min，收集上清液，在121 ℃下滅菌20 min，冷卻后備用。

1.2.2 擬輪枝鐮孢菌毒素粗提液對玉米種子發芽和胚根生長的影響。

先將玉米種子用無菌水浸泡24 h，撈出濾干水分，加入75 %乙醇表面消毒5 min。然后用無菌水將消毒過的種子沖洗3次，擺放在鋪有滅菌濾紙的250 mL三角瓶中，每三角瓶擺放20粒，加入50 mL稀釋倍數分別為0、1、2、5倍的毒素粗提液，以無菌水為對照，用無菌濾膜覆蓋瓶口，重復3次。將處理好的三角瓶放置于25 ℃、光暗比為12 h：12 h的恒溫培養箱內培養，分別在培養4和6 d時調查，統計發芽率、胚根長度，按下列公式計算毒素粗提液對種子發芽的抑制率和對胚根生長的抑制率。

種子發芽抑制率=（對照種子發芽率-處理種子發芽率）/對照種子發芽率×100%

胚根生長抑制率=（對照胚根長度-處理胚根長度）/對照胚根長度×100%

1.2.3 擬輪枝鐮孢菌毒素粗提液對玉米幼苗的致萎蔫作用。

玉米種子經75 %乙醇表面消毒5 min、無菌水沖洗3次后，播于裝有無菌沙土（沙∶土=3∶1）的營養缽中，待玉米苗2葉期時，小心拔出幼苗，沖洗干凈后，將切除根系的幼苗分別浸入裝有不同稀釋倍數的擬輪枝鐮孢菌毒素粗提液的燒杯中，每處理3次重復，每重復20株，無菌水處理為對照。處理后24、48、72、96 h時觀察記錄玉米幼苗失水萎蔫程度[16]。

玉米幼苗萎焉程度分級標準：“-”，所有幼苗的葉片無萎蔫癥狀;“+”，一級萎蔫，供試材料中，葉片輕度失水萎蔫的幼苗占50%以上;“++”，二級萎蔫，供試材料中，整株葉片失水萎蔫的幼苗占50%以上;“+++”，三級萎蔫，供試材料中，整株葉片失水干枯的幼苗占50%以上。

1.3 數據分析 利用Excel計算標準誤差，利用SPSS 16.0統計軟件進行方差分析，多重比較用鄧肯氏法。

2 結果與分析

2.1 擬輪枝鐮孢菌毒素粗提液對玉米種子發芽的影響

由圖1可知，毒素粗提液對玉米種子發芽的抑制作用與濃度、處理時間和玉米品種抗性有一定關系。處理4和6 d后，不同稀釋倍數毒素粗提液對種子發芽抑制率的變化趨勢基本相似（圖1），不同稀釋倍數的毒素粗提液對不同抗、感性的玉米雜交種和自交系種子的發芽抑制率均達顯著水平（P<0.05），不同稀釋倍數的毒素粗體液對玉米苗枯病表現感病的自交系品種N6的種子發芽抑制率達極顯著水平（P<0.01），除毒素粗提液處理后6 d的感病雜交種豫玉22（P>005）外，毒素粗提液的稀釋倍數與其他玉米品種處理后4和6 d的種子發芽抑制率均呈顯著的負相關關系（P<0.05）（表1）。

由圖1可知，擬輪枝鐮孢菌毒素粗提原液對種子發芽的抑制率最高，其中，在毒素粗提液處理4 d時，抗病雜交種農大108的種子發芽抑制率為86.0 %，抗病自交系品種的種子發芽抑制率為61.0%～84.6%;對感病雜交種豫玉22 的種子發芽抑制率為92.6%，對感病自交系N6的種子發芽抑制率達94.2%;隨處理后天數增加，在毒素粗提液處理后6 d時，感病雜交種和自交系品種的種子發芽抑制率分別達934%和95.3%;由圖1可知，擬輪枝鐮孢菌的毒素粗提液原液對同是抗病雜交種和自交系及同是感病的雜交種和自交系的種子發芽抑制效果基本一致。隨稀釋倍數增加，毒素粗提液對種子發芽的抑制率呈逐漸降低趨勢，當稀釋5倍時，處理4 d后的抗病雜交種農大108和抗病自交系5008-1的種子發芽平均抑制率分別為4.9%和-2.0%，感病雜交種豫玉22和感病自交系N6的種子發芽平均抑制率分別為8.1%和429%;處理6 d后的抗病雜交種農大108和抗病自交系5008-1的種子發芽平均抑制率分別為11.4%和1.3%，感病雜交種豫玉22和感病自交系N6的種子發芽平均抑制率分別為338%和44.7%。同一濃度毒素粗提液對玉米抗、感品種的種子發芽抑制率不同，毒素粗提液對感病雜交種和自交系玉米種子發芽的抑制率高于抗病雜交種和自交系的玉米品種（圖1）。

2.2 擬輪枝鐮孢菌毒素粗提液對玉米種子胚根生長的影響

由圖2可知，擬輪枝鐮孢菌毒素粗提液對玉米雜交種胚根生長的抑制作用與毒素濃度、處理后時間和試驗材料的差異有關，隨著病原菌毒素粗提液稀釋倍數的增加，對供試玉米種的胚根生長抑制作用減小。毒素粗體液處理后4和6 d時，各稀釋倍數的毒素粗提液對胚根生長的抑制效果變化趨勢基本相同。擬輪枝鐮孢菌毒素粗提液稀釋倍數與玉米種子胚根生長抑制率呈負相關，但除感病雜交種豫玉22外，其余供試玉米雜交種和自交系的種子胚根生長抑制率與擬輪枝鐮孢菌毒素粗提液稀釋倍數間的負相關性未達顯著水平（P>0.05），這與對種子發芽抑制的表現不同（表2）。由圖2、表2還可以看出，擬輪枝鐮孢菌毒素粗提液對玉米雜交種和自交系胚根的生長抑制作用不同，對雜交種胚根生長的抑制作用略強于自交系。擬輪枝鐮孢菌毒素粗提液原液處理4和6 d后，抗病雜交種農大108胚根生長抑制率分別為931%和95.8%，而感病雜交種豫玉22的胚根生長抑制率高達100%。

2.3 擬輪枝鐮孢菌毒素粗提液對玉米雜交種幼苗的致萎蔫作用

由表3可知，當擬輪枝鐮孢菌毒素粗提液濃度較高（稀釋倍數為0和1）時，抗、感雜交種幼苗間的萎蔫程度變化基本一致，均隨處理時間延長而加重。在處理后96 h時，抗、感雜交種均表現3級萎蔫。當毒素粗提液濃度較低（稀釋倍數≥2）時，抗、感雜交種幼苗間的萎蔫程度變化出現明顯差異。在2倍稀釋時，抗病雜交種農大108 在處理后48 h時才開始出現萎蔫;在處理后96 h時，萎蔫程度僅達2級。相對地，感病雜交種豫玉22在處理后24 h時即出現萎蔫，在處理后72 h達2級萎蔫。在5倍稀釋倍數時，抗病雜交種在處理后72 h時才開始出現萎蔫，到96 h時，萎蔫程度仍為一級;感病雜交種豫玉22在處理后48 h即出現萎蔫，在處理后96 h時達到二級萎蔫。因此，利用致萎蔫作用試驗評價玉米雜交種抗性時，稀釋倍數以2～5倍為宜。

3 結論與討論

鐮孢菌毒素主要有單端孢霉烯類、玉蜀黍赤霉烯類和伏馬毒素3類[17-19]，擬輪枝鐮孢菌侵染寄主后可產生多種毒素，如伏馬毒素、萎蔫酸、鐮孢菌酸等，該類毒素可對動、植物的正常生長造成傷害[20]。植物受到病原真菌侵染后，病原菌產生的多種毒素可以作用于細胞質膜，影響細胞膜的透性改變;也可以直接作用于細胞核和核糖體，影響細胞分裂。擬輪枝鐮孢菌產生的多種毒素，既可以影響細胞膜的透性，也可以影響寄主細胞的分裂，植物受害后通常表現萎蔫，或生長受到影響[21]。

該研究結果發現，擬輪枝鐮孢菌毒素粗提液對玉米種子的發芽和胚根生長具有較明顯的抑制作用，對供試玉米雜交種的幼苗也有明顯的致萎蔫作用。擬輪枝鐮孢菌毒素粗提液的作用效果與多種因素有關。首先，擬輪枝鐮孢菌毒素粗提液的濃度對各項測定指標有較大影響。該研究發現，隨稀釋倍數的增加，毒素粗提液對玉米種子的發芽、胚根的生長、幼苗萎蔫程度等的影響作用減小，這與田雪亮等[6]的研究結果一致。無論是玉米雜交種還是自交系的種子發芽和胚根生長試驗中都可以觀察到，隨稀釋倍數的增加，抗病和感病雜交種材料間的抑制率差值有擴大趨勢。在玉米雜交種幼苗致萎蔫試驗中，在0～1倍稀釋時，幼苗的萎蔫程度無差異;只有稀釋倍數為2～5倍時，幼苗的萎蔫程度才會出現差異。綜合該研究結果，在今后進行玉米抗性鑒定試驗時，可考慮選用的比較適宜的擬輪枝鐮孢菌毒素粗提液稀釋倍數為2倍或5倍。其次，毒素作用時間對試驗結果也有較大影響。在玉米雜交種試驗中，4 d處理已經能很明確地區分不同抗性的種質，但6 d處理的種子發芽和胚根生長抑制率均顯著高于4 d處理的對應值（P<0.01），因此今后鑒定試驗中，應處理時間稍長。第三，玉米種質的抗性與種子發芽和胚根生長抑制率、幼苗致萎蔫效果等也存在一定關系?？傮w來看，在玉米雜交種種子發芽和胚根生長抑制試驗中，毒素對抗性雜交種農大108種子發芽和胚根生長的抑制率在處理后4、6 d時比易感雜交種豫玉22的對應值分別低7.2%、11.3%、12.7%、11.8%，說明這2項試驗能很好地區別抗性和易感玉米雜交種;農大108適宜作為種子發芽和胚根生長抑制試驗中的抗性雜交種標準對照，而豫玉22也適合作為易感雜交種標準對照，應用于雜交種玉米抗性的初步鑒定。在玉米自交系種子發芽抑制試驗中，毒素對易感自交系N6的指標均比對抗性自交系BT、熊掌S和5008-1的對應值分別高218%～262%、96.8%，且抗性自交系之間也存在一定差異，說明通過病原菌毒素粗提液對種子發芽抑制的測定試驗，可大致區分部分感病和抗病自交系。但在胚根生長抑制試驗中，感病自交系N6的均值分別明顯高于抗性自交系熊掌S和5008-1的對應值，但與自交系BT的胚根生長抑制率無顯著差異。今后應收集較大量的自交系材料，運用毒素粗提液進行鑒定，才能對鑒定材料的抗性結果作出較為客觀的評價。

綜上所述，今后在對較大量玉米種質資源進行玉米苗枯病抗性鑒定和篩選時，可以考慮結合利用擬輪枝鐮孢菌毒素粗提液來進行鑒定，經對大量鑒定材料、多次鑒定結果比對后，如與利用病原菌鑒定差異不顯著，可考慮用此方法部分代替玉米苗枯病菌進行品種抗性鑒定和篩選。此方法簡便易行，可在室內較短時間對大量待鑒定材料進行鑒定，有效提高抗性鑒定的效率[22-24]。

參考文獻

[1] 宋淑云，晉齊鳴，孫秀華.玉米苗期病害概述[J].吉林農業科學，1997（4）：53-57.

[2] 田堯甫，楊曉芳，王仁清，等.2001年漯河地區玉米苗枯病重發原因調查[J].植保技術與推廣，2001，21（12）：12-13.

[3] 閆巖，傅俊范，徐秀德，等.遼寧省玉米苗枯病調查及原因分析[J].安徽農業科學，2005，33（7）：1174-1175.

[4] MUNKVOLD G P，OMARA J K.Laboratory and growth chamber evaluation of fungicidal seed treatments for maize sedling blight caused by Fusarium species[J].Plant disease，2002，86（2）：143-150.

[5] BALDWIN T T，ZITOME N C，MITCHELL T R，et al.Maize seedling blight induced by Fusarium verticillioides：Accumulation of fumonism B1 in leaves without colonization of the leaves [J].Journal of agricultural & food chemistry，2014，62（9）：2118-2125.

[6] 田雪亮，薛國正，郎劍鋒，等.串珠鐮刀菌粗毒素對玉米幼苗的脅迫作用研究[J].中國農學通報，2012，28（6）：39-42.

[7] 崔偉.商丘市玉米苗枯病發生情況及綜合防治措施[J].中國農技推廣，2015，31（4）：49，48.

[8] LESLIE J F，MARASAS W F O，SHEPHARD G S，et al.Duckling toxicity and the production of fumonisin and moniliformin by isolates in the A and E mating populations of Gibberella fujikuroi（Fusarium moniliforme）[J].Applied & environmental microbiology，1996，62（4）：1182-1187.

[9] FARBER E.The multistep nature of cancer development[J].Cancer research，1984，44（10）：4217-4223.

[10] THIEL P G，MARASAS W F O，SYDENHAM E W，et al.The implications of naturally occurring levels of fumonisins in corn for human and animal health[J].Mycopathologia，1992，117（1/2）：3-9.

[11] 高立宏，袁業琴.水稻稻瘟病菌粗毒素對水稻幼穗組織培養的影響及抗性篩選[J].長春師范學院學報（自然科學版），2007，26（2）：91-95.

[12] 劉艷，遲銘，王寶祥，等.利用稻瘟病菌粗毒素篩選水稻抗病突變體[J].西南農業學報，2016，29（9）：2016-2019.

[13] 王銘，臧麗麗，范凱，等.黃萎病菌毒素聯合法鑒定棉花對黃萎病的抗性[J].中國農業科學，2015，48（9）：1678-1688.

[14] 吳美金，王敏.赤霉菌粗毒素鑒定小麥赤霉病抗性的研究[J].種子，2009，28（8）：38-41.

[15] 孫麗萍，時焦，孟坤，等.利用赤星病菌毒素快速高通量鑒定煙草抗性種質的方法研究[J].中國煙草科學，2014，35（1）：80-84.

[16] 劉正坪，王若箐，張富榮，等.茄子黃萎病菌毒素液對茄種子發芽及幼苗生長的毒害作用[J].華北農學報，2001，16（1）：63-66.

[17] TAMURA M，MOCHIZUKI N，NAGATOMI Y，et al.A method for simultaneous determination of 20 fusarium toxins in cereals by highresolution liquid chromatographyorbitrap mass spectrometry with a pentafluorophenyl column[J].Toxins，2015，7（5）：1664-1682.

[18] MIROCHA C J，PATHRE S V，SCHAUERHAMER B，et al.Natural occurrence of Fusarium toxins in feedstuff[J].Applied & environmental microbiology，1976，32（4）：553-556.

[19] ROBERT H P，HOVE F V，SUSCA A，et al.Birth，death and horizontal transfer of the fumonisin biosynthetic gene cluster during the evolutionary diversification of Fusarium[J].Molecular microbiology，2013，90（2）：290-306.

[20] 劉開軍，羅少波，王亞琴，等.鐮刀菌毒素對植物形態和結構的影響[J].中國農學通報，2010，26（4）：53-56.

[21] 郭新梅，陳耀鋒，曹團武.禾谷鐮刀菌粗毒素對不同抗性水平小麥品種細胞膜透性的影響[J].植物遺傳資源學報，2005，6（2）：186-190.

[22] 何曉明，謝大森，彭慶務，等.節瓜抗鐮刀菌酸突變體的篩選和特性研究[J].中國農學通報，2009，25（2）：172-175.

[23] 楊亞君，陶晡，李川，等.腐霉枯萎病菌毒素在坪草抗病性篩選中的應用研究[J].草業學報，2008，17（3）：93-98.

[24] 臺蓮梅，許艷麗，閆鳳云.應用尖孢鐮刀菌毒素濾液鑒定大豆品質抗性初探[J].植物保護，2006，32（3）：49-52.