難治性高血壓患者血管緊張素原、血管緊張素Ⅱ1 型受體、質膜Ca2+- ATP 酶1 基因多態性研究

高佳兒 魏文娟 黃建振 彭俊 張靜 陸云燕

難治性高血壓是一種特殊類型的高血壓，是多種遺傳因素和環境因素共同作用引起的復雜性疾病。相對于血壓控制的高血壓患者，難治性高血壓患者有著更明顯的靶器官損害，并且心血管事件發生風險明顯增加[1-2]。目前國內外對于原發性高血壓致病基因的研究有了較多發現[3-6]，但對于難治性高血壓相關基因多態性的研究卻較少。Lynch 等[7]發現血管緊張素原（angiotensinogen，AGT）基因兩個單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphism，SNP）位點變異與歐洲裔美國人難治性高血壓相關，與非洲裔美國人卻無相關性，提示該基因多態性與難治性高血壓的關系可能存在人種差異。國內目前鮮有相關研究。本研究選取高血壓最重要的發病機制之一的腎素-血管緊張素-醛固酮系統中2 個重要的高血壓候選基因：AGT 基因兩個SNP 位點rs699 與rs5051、血管緊張素Ⅱ1 型受體（angiotensin Ⅱtype 1 receptor，AGTR1）基因1 個SNP 位點rs5186 及國外研究較多的質膜Ca2+-ATP 酶1（plasma membrane calcium ATPase isoform 1，ATP2B1）基因1 個SNP 位點rs12817819 為研究目標，旨在發現難治性高血壓患者的基因多態性，以及基因多態性與環境危險因素交互作用對難治性高血壓形成的影響，現報道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 選擇2016 年10 月至2018 年12 月在本院就診的難治性高血壓患者（RH 組）59 例，其中男39 例，女20 例，年齡32～84（57.26±13.29）歲；非難治性高血壓患者（非RH 組）77 例，其中男41例，女36 例，年齡36～86（58.36±12.70）歲。RH 組納入標準：服用包括利尿劑在內的3 種降壓藥物，收縮壓仍持續＞140mmHg，和（或）舒張壓＞90mmHg，或需要4 種及以上降壓藥物才能控制血壓的患者[8-9]。排除標準：繼發性高血壓患者，高血壓合并急性腦血管意外患者，高血壓合并妊娠患者，高血壓合并惡性腫瘤患者。

1.2 方法

1.2.1 一般資料采集 兩組患者均留取清晨空腹肘靜脈血樣，30min 內分離血漿并于-20℃保存。測量身高、體重、腰圍和血壓等，計算體重指數（BMI），采集吸煙、飲酒史。所有生化指標由本院檢驗科同批次專人檢測，包括空腹血糖、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、尿酸、血肌酐、同型半胱氨酸（Hcy）等。

1.2.2 基因多態性位點的檢測及分析 抽取空腹EDTA 抗凝的靜脈血300μl，應用血液基因組DNA抽提試劑盒（美國Axygen 公司生產）提取基因組DNA，嚴格按試劑盒說明書操作。采用直接測序法對所有研究對象的目標SNP 位點進行基因型檢測。將需要檢測的SNP 位點作為靶序列，根據SNP 位點兩側的保守序列設計引物，引物設計合成以后（由上海派森諾生物科技股份有限公司合成），確認DNA 模板質量合格的情況下，使用BI-2720 PCR 擴增儀進行擴增，擴增條件按試劑盒說明書設定，PCR 產物純化后應用美國ABI 3730XL DNA 自動測序儀進行基因分型（由上海派森諾生物科技股份有限公司協助完成）。比較兩組患者基因多態性位點，與并Hap Map 數據庫進行比較。1.3 統計學處理 采用SPSS 19.0 統計軟件，符合正態分布的計量資料以表示，比較采用t檢驗，偏態分布的以M（1Q1，Q3）表示，比較采用非參數檢驗。計數資料以百分率表示，比較采用χ2檢驗。兩組的基因頻率分布是否符合哈迪-溫伯格（Hardy-Weinberg，H-W）遺傳平衡定律采用χ2檢驗進行分析。采用logistic 回歸模型分析難治性高血壓的獨立相關因素及基因多態性與其他相關因素交互作用對難治性高血壓的影響。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組患者一般資料比較 見表1。

由表1 可見，兩組腰圍、BMI、空腹血糖、尿酸比較差異均有統計學意義（P＜0.05 或0.01）；其余指標比較差異均無統計學意義（均P＞0.05）。

表1 兩組患者一般資料比較

2.2 兩組患者AGT、AGTR1、ATP2B1 基因代表性SNP 位點最小等位基因頻率的比較 見表2。

由表2 可見，兩組AGT、AGTR1、ATP2B1 基因代表性SNP 位點最小等位基因頻率與國際人類基因組單體型圖（HapMap）中國人群分布的特點相符合。兩組AGT、AGTR1、ATP2B1 基因代表性SNP 位點基因型頻率分布符合H-W 遺傳平衡定律（P＞0.05），樣本具有群體代表性。

2.3 兩組患者各SNP 位點基因型分布的差異比較見表3。

表2 兩組患者AGT、AGTR1、ATP2B1 基因代表性SNP 位點最小等位基因頻率的比較

表3 兩組患者各SNP 位點基因型分布的差異比較[n（%）]

由表3 可見，兩組AGT 基因位點rs699、rs5051基因型頻率比較差異均有統計學意義（均P＜0.05），AGTR1、ATP2B1 基因SNP 位點差異均無統計學意義（均P＞0.05）。

2.4 基因多態性及環境因素與難治性高血壓的關系分析 見表4。

表4 基因多態性及環境因素與難治性高血壓的關系分析

由表4 可見，經logistic 回歸校正性別、年齡、腰圍、空腹血糖、血脂、血肌酐、血Hcy 水平后顯示，尿酸、BMI、rs699（CC）基因型、rs5051 基因型（TT）基因型是難治性高血壓均的獨立危險因素（P＜0.05 或0.01）。

2.5 rs699、rs5051 位點基因多態性與環境因素交互作用對難治性高血壓的影響 logistic 回歸分析顯示rs699、rs5051 單核苷酸多態性與空腹血糖交互作用對難治性高血壓的影響有統計學意義（OR=1.143，95%CI：1.014～1.288，P＜0.05），但校正性別性別、年齡、吸煙、腰圍、BMI、血脂、血肌酐、血Hcy 水平、尿酸等因素后，上述影響不再有統計學意義（均P＞0.05）。

3 討論

隨著人口老齡化以及肥胖、睡眠呼吸暫停低通氣綜合征的增多，難治性高血壓人群日益龐大，已成為影響國民健康的棘手問題。美國的高血壓患者中，難治性高血壓比例占15%～18%[10-11]，而我國高血壓患者將近2.7 億[12]，血壓達標率卻不足10%。

難治性高血壓的發病機制目前尚未完全明確，既往研究提示與多種因素相關，如交感神經過度激活、腎素-血管緊張素-醛固酮系統激活、炎癥反應、氧化應激和內皮細胞功能紊亂等相關[13-14]。到目前為止，關于遺傳方面的研究有限，Givens 等[15]研究發現一種特殊的細胞色素P450 CYP3A4 基因，該基因與美國非裔難治性高血壓的發生有關。另外一項關于歐洲裔美國人及西班牙人的研究發現，ATP2B1基因位點rs12817819 的A 等位基因與難治性高血壓顯著相關[16]。本研究未發現位點rs12817819 與難治性高血壓存在相關性。提示該基因多態性與難治性高血壓的關聯性存在人種或種族間的差異。這與前文Lynch 的研究結果相似。本研究結果顯示，AGT基因位點rs699、rs5051 基因型頻率在RH 組和非RH 組間的比較，差異有統計學意義。經logistic 回歸校正性別、年齡、BMI、空腹血糖、血肌酐等因素后顯示，rs699（CC）基因型、rs5051（TT）基因型是難治性高血壓的獨立危險因素。

難治性高血壓的發生是遺傳基因與環境因素相互作用的結果，具有病因的多元性和復雜性，很可能受到多個基因位點及環境危險因素的共同影響[17]。本研究顯示，RH 組腰圍、BMI、空腹血糖、尿酸與非RH組的差異具有統計學意義。logistic 回歸分析顯示尿酸、BMI 是難治性高血壓的獨立危險因素。此外本研究采用交互作用模型理論，探討AGT 基因位點rs699、rs5051 分別與腰圍、BMI、空腹血糖、尿酸交互作用對難治性高血壓的影響。logistic 回歸分析結果顯示，AGT 基因位點rs699 及rs5051 與空腹血糖交互作用對難治性高血壓產生的影響有統計學意義，但校正性別、年齡、腰圍、BMI 等因素后，上述影響不再有統計學意義。

綜上所述，AGT 基因位點rs699（CC）基因型、rs5051（TT）基因型是難治性高血壓發病的一個重要因素，另外尿酸、BMI 亦是難治性高血壓的危險因素，但未發現基因多態性與環境因素的交互作用對難治性高血壓形成產生影響。本研究為難治性高血壓遺傳學研究提供了相關信息，但由于樣本量較小，會產生一定的局限性，未來有待于更大樣本量更多基因位點的研究來揭示難治性高血壓遺傳學方面的病因。