新型冠狀病毒N蛋白優勢表位區段抗原的克隆表達及其診斷價值初步評價

王坤，張玲，王超男，陳遠哲，范占科，李垚，劉念，馮曉燕，付強，張賀秋，

1.濱州醫學院，山東 煙臺 264003；2.東方海洋（北京）醫學研究院，北京 100071

2019年底，全球陸續出現了一系列原因不明的肺炎病例，2020年2月11日，國際病毒分類委員會（ICTV）將該病原體新型冠狀病毒正式命名為嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（severe acute respiratorysyndrome coronavirus2，SARS-CoV-2），世界衛生組織（WHO）將這一病毒導致的疾病正式命名為新型冠狀病毒肺炎（coronavirus disease 2019，COVID-19）[1]。SARS-CoV-2 屬于冠狀病毒β屬，其遺傳物質是單正鏈RNA，基因組包含29 891個核苷酸，與2003年暴發的SARS冠狀病毒（SARS-CoV）的同源性為82%。SARS-CoV-2的結構蛋白主要包括棘突糖蛋白（S）、包膜糖蛋白（E）、膜糖蛋白（M）和核衣殼蛋白（N）。N蛋白與基因組RNA形成復合物，在病毒粒子組裝過程中與病毒膜蛋白相互作用，在提高病毒轉錄和組裝效率方面起關鍵作用。同時，N蛋白相對保守，在病毒的結構蛋白中所占比例最大，感染早期機體就能產生抗N蛋白的高水平抗體[2]。

血清學改變是COVID-19患者疾病發展過程中的普遍事件，會發生在感染的早期并一直持續至感染后期，甚至康復期。檢測COVID-19患者血清中產生的抗體，可做到早診斷、早隔離、早治療。病毒感染時，血清中出現的抗體主要是IgM和IgG。IgM抗體表明活躍或最近的感染；IgG抗體在感染中出現較晚，通常表明既往感染，但不排除最近感染的患者，這些患者可能仍然具有傳染性，特別是當同時檢測到IgM抗體時[3]。為了提高抗體檢測試劑的性能，我們利用生物學軟件分析了N蛋白氨基酸序列的B細胞表位分布及疏水性，選取含有優勢表位的抗原區段進行克隆表達，并對其診斷價值進行了初步評價。

1 材料與方法

1.1 材料

23例經臨床確診的COVID-19患者血清標本、20例乙肝患者血清樣本和40例健康體檢者血清樣本均由廣州市第八人民醫院提供。大腸桿菌BL21、質粒pColdi為本室保存；DNA限制內切酶BamHⅠ、EcoRⅠ購自Promega公司；HRP標記的抗人IgG、IgM二抗購自Bethyl公司。

1.2 N蛋白抗原性分析及優勢表位區段篩選

采用BIOSUN生物信息學軟件分析新型冠狀病毒N蛋白氨基酸序列，首先輸入全長序列，然后利用B細胞表位分析功能，根據表位峰值的高低篩選確定優勢表位區段。

1.3 N蛋白優勢表位區段抗原表達質粒構建

由北京諾賽生物技術有限公司合成N蛋白優勢表位抗原的編碼基因，采用BamHⅠ、EcoRⅠ酶切位點，通過雙酶切，將N蛋白優勢表位抗原的編碼基因插入同樣經BamHⅠ、EcoRⅠ雙酶切的pColdi質粒，獲得pColdi-NP重組質粒。

1.4 抗原純化及制備

將測序正確的重組表達質粒轉化大腸桿菌BL21感受態細胞，挑取單菌落于3 mL含氨芐西林鈉的LB液體培養基中，37℃振蕩培養過夜，次日接種于250 mL新鮮的LB液體培養基中，37℃、160 r/min培養4 h至對數生長期，加150 μL 1 mol/L 的 IPTG，15℃誘導12～14 h，4℃、6000 r/min離心10 min收集菌體；用25 mmol/L Tris-HCl（pH8.5）重懸菌體，冰浴超聲，4℃、12 000 r/min離心10 min收集上清，過濾備用。Ni柱純化，平衡后，將處理好的樣品緩慢上樣，待吸光度值開始上升時收集穿過液；平衡后，依次用含25、250 mmol/L 咪唑的 25 mmol/L Tris-HCl（pH8.5）溶液洗脫，分別收集蛋白峰，電泳分析純化產物，驗證純化后的目的蛋白。

1.5 抗原純度及相對分子質量測定

利用Gel-ProR Analyzer Version 3.0 for Windows軟件分析純化后N蛋白優勢表位抗原的相對分子質量和純度。

1.6 N蛋白優勢表位抗原活性鑒定

采用Biocore結合實驗檢測抗原抗體的相互作用，分別用PBS以1∶100稀釋陽性血清和陰性血清。傳感器預處理后，以5 μL/min的速率通入血清進行抗體綁定，通入時間分別為1.2 min。隨后將1 mg/mL N蛋白優勢表位抗原以30 μL/min的速率通入進行結合，通入時間為6 min。解離時間與結合時間相同。

1.7 ELISA法鑒定N蛋白優勢表位抗原活性和特異性

采用ELISA方法檢測人血清樣本中抗新型冠狀病毒N蛋白IgM/IgG抗體。用碳酸鹽包被緩沖液（pH9.6）稀釋N蛋白優勢表位抗原，濃度為2.5 μg/mL，每孔包被100 μL，4℃過夜；用洗滌液洗板2 次，200 μL/孔；加入 110 μL/孔封閉液（0.01 mol/L PBS，1%BSA，pH7.2），室溫封閉6 h；用洗滌液洗板 5 次，200 μL/孔；真空干燥 4～6 h。檢測時，每孔加入100 μL樣品稀釋液后，分別加入5 μL待測血清，37℃反應30 min，棄液，用洗滌液洗板 5 次，300 μL/孔，拍干，加入 100 μL/孔 HRP標記的抗人IgM/IgG抗體，37℃孵育20 min；用洗液洗板5次，200 μL/孔；加入TMB顯色底物A、B液各50 μL，充分混勻，37℃避光反應10 min；加入 50 μL/孔 2 mol/L H2SO4終止反應，終止后 10 min內采用酶標儀測定各孔的D450nm值。

1.8 統計學分析

運用GraphPad Prism 5軟件對檢測結果進行t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義，繪制ROC曲線，以約登指數最大判斷Cut-off值，≥Cut-off值判定為陽性，＜Cut-off值判定為陰性，并計算靈敏度與特異性。

2 結果

2.1 新型冠狀病毒N蛋白優勢表位抗原區段的確定

利用BIOSUN生物學軟件分析尋找B細胞表位，根據表位分布圖最終確定N蛋白優勢表位抗原區段為15～215 aa（圖1）。

圖1 新型冠狀病毒N蛋白B細胞表位分析

2.2 抗原表達、純化與鑒定

將測序正確的重組質粒轉化大腸桿菌誘導表達，Ni柱純化后獲得純化抗原，電泳分析純化產物，驗證純化后的目的蛋白在250 mmol/L咪唑洗脫液中（圖2）。Gel-ProR Analyzer Version 3.0 for Windows軟件分析結果表明，純化后N蛋白優勢表位抗原的相對分子質量為28.10×103，純度為96.23%（圖3）。

圖2 N蛋白優勢表位區段抗原SDS-PAGE鑒定

圖3 N蛋白優勢表位抗原相對分子質量（A）和純度（B）分析

2.3 N蛋白優勢表位區段抗原活性的初步評價

采用Biocore結合實驗檢測抗原抗體的相互作用，動力學數據見表1。ka為結合速率常數，反映大分子間的作用結合速度；kd為解離速率常數，反映分子復合物解離速度；KD為解離平衡常數（KD=kd/ka）。結果顯示，陽性血清與N蛋白優勢表位抗原的結合速率常數顯著高于陰性血清，同時，陽性血清與N蛋白優勢表位抗原的解離速率常數顯著低于陰性血清。

表1 抗原抗體結合力分析

2.4 COVID-19患者血清中的IgM、IgG抗體檢測

用N蛋白優勢表位區段抗原包被酶聯板，間接ELISA法對23例經臨床確診的COVID-19患者血清標本、20例乙肝患者和40例健康體檢者血清樣本進行抗N抗原IgM和IgG抗體檢測，結果如圖4。COVID-19患者血清中IgM和IgG抗體水平均顯著高于健康體檢者和乙肝患者組（P＜0.0001）。根據ROC曲線，IgM抗體診斷COVID-19的AUC值為0.797，IgG抗體診斷COVID-19的AUC值為0.998。對于IgM檢測，以約登指數最大時的D450nm=0.123為臨界值，IgM對COVID-19檢測的靈敏度為 60.87%（14/23），特異性為 90%（36/40）。對于IgG檢測，以約登指數最大時的D450nm=0.178為臨界值，IgG對COVID-19檢測的靈敏度為95.65%（22/23），特異性為100%（40/40）。

圖4 N蛋白優勢表位區段抗原血清學檢測性能

3 討論

2019年12月暴發的COVID-19感染性疾病在全球蔓延，成為國際關注的重大突發事件，據報道人與人之間的傳播潛伏期為2～14 d，通過飛沫、受污染的手或物體表面傳播[4]。隨著SARSCoV-2感染的流行，迫切需要一種準確、快速、低成本的實驗室病原學診斷方法。COVID-19流行數據表明，血清學反應，尤其是病毒特異性IgM和IgG，是有效的血清學輔助診斷標志物[5]，有助于COVID-19的診斷，包括PCR結果陰性或無臨床癥狀的感染者[6]。冠狀病毒所編碼的抗原中，N蛋白具有較高的免疫原性，可在早期感染時分泌到體液中，有可能作為抗原檢測的生物標志物，同時抗N蛋白抗體可被用于檢測冠狀病毒感染[7]。

本研究為了獲得高活性N蛋白抗原，通過生物學軟件分析選取了優勢表位區段抗原并獲得了高效表達，采用Biocore結合實驗初步確定15～215 aa優勢表位區段抗原可以與COVID-19患者血清樣本發生特異性抗原抗體反應。接下來放大樣本進行檢測，結果顯示基于本研究優勢表位區段抗原所建立的IgM和IgG檢測方法可以很好地區分COVID-19患者和健康對照，尤其是IgG檢測具有優異的檢測性能。

在本研究中，抗NP-IgM（90%）和抗NP-IgG（100%）檢測的特異性均較高，但本次實驗檢測的COVID-19患者中抗NP-IgG的陽性率（95.65%）卻顯著高于抗NP-IgM的陽性率（60.87%），這可能是由于IgM抗體出現在感染最早期，抗NP-IgM的血清轉化發生在發病后7～12 d，而有些患者則發生在癥狀出現后1 d[8]。隨著感染時間延長，一些患者的IgM抗體發生陰轉，繼而出現IgG抗體。血清中抗體的轉化時間是因人而異的，同樣，由于病情嚴重程度不同，患者的血清學反應也會有所不同[9]。本研究入組的COVID-19患者均已確診并入院治療，并非全部為早期感染者，所以NP-IgM的陽性率較低。根據本研究結果綜合考慮，抗NP-IgG和抗NP-IgM對COVID-19的鑒別診斷都有價值，在早期篩查診斷中應該將兩者聯合使用，以提高診斷效率和篩查準確率。而在大規模流行病學調查中，由于IgG在患者體內存在時間更長久，NP-IgG是更好的檢測標志物。

據報道，COVID-19抗體檢測方法還可檢測針對SARS-CoV-2中S蛋白的血清IgM/IgG抗體[10]。研究發現，抗N蛋白與抗S蛋白抗體聯合檢測可在發病后1周內將陽性率從41.7%顯著提高至75%[11-12]，將抗N蛋白抗體與抗S蛋白抗體檢測相結合，是提高COVID-19篩查能力的更有效策略。因此，為了進一步提高抗體檢測的靈敏度，我們在后期研究中設計將易表達的N蛋白優勢表位區段與難表達的S蛋白優勢表位區段構建成一個融合表達抗原，進一步提高檢測的靈敏度和特異性。