ACE2-mCherry融合基因表達載體的構建及功能驗證

蔣曉祎,侯欣妤，張波，任禾，牛祖彪，鄭幽，王雨琪，孫強，黃紅艷

1.首都醫科大學 附屬北京世紀壇醫院腫瘤內科，北京 100038；

2.軍事醫學研究院 生物工程研究所，北京 100071

2019年末暴發的新型冠狀病毒肺炎（COVID-19），給全世界造成了巨大災難。COVID-19由SARS-CoV-2病毒引起，其感染機體的關鍵環節之一是病毒表面的刺突蛋白（S蛋白）與宿主細胞表面的受體血管緊張素轉化酶2（angiotensin-converting enzyme 2，ACE2）結合[1]。

人ACE2基因位于第17號染色體上，跨越18個外顯子[2]，編碼一個含805個氨基酸殘基的跨膜糖蛋白。該蛋白是一種與ACE同源的金屬羧肽酶，具有明顯的信號肽、單一的金屬蛋白酶活性位點和跨膜結構域，可降解血管緊張素Ⅰ（angiotensinⅠ，AngⅠ）生成Ang1-9，降解血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）生成Ang1-7[3-4]。Ang1-7作用于Mas受體，起到舒張血管和降低血壓的作用[5-6]。

ACE2在SARS-CoV-2入侵人體時發揮關鍵作用。SARS-CoV-2的S蛋白在感染細胞時起主要作用，它主要包括S1和S2兩個片段，S1片段識別細胞表面的ACE2并與之結合，介導病毒進入細胞，S2促進病毒與細胞膜間的融合[7-9]。

為了動態追蹤ACE2的表達情況，我們擬構建ACE2與紅色熒光蛋白的融合表達載體，并初步驗證載體功能，以期為后續新冠病毒的研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

人胚腎細胞293T、包含目的基因ACE2的質粒 pcDNA3.1-ACE2-3xFlag、pQCXIP-mCherry-Lamp載體、pSec-SARS-CoV-2-S質粒由本實驗室提供；大腸桿菌感受態細胞Trans10、dNTPs、TaqDNA聚合酶購自北京全式金生物技術有限公司；pQCXIP-mCherry載體購自Promega公司；Q5超保真DNA聚合酶，限制性內切酶XhoⅠ、AgeⅠ及Cutsmart酶切緩沖液購自New England Biolabs公司；同源重組試劑盒購自中美泰和生物技術（北京）有限公司；PCR試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、無內毒素質粒小提中量試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；Opti-MEM減糖培養基購自購自Thermo Fisher公司；脂質體LipofectAMINE 3000購自Invitrogen生命技術有限公司；胎牛血清（FBS）購自PAN-Biotech公司；高糖DMEM培養基、磷酸緩沖鹽溶液（PBS）、化學發光檢測盒、0.25%-EDTA胰酶購自中國邁晨科技公司；鼠源ACE2抗體、鼠源β-actin抗體購自Proteintech公司；鼠源SARS-CoV-2 spike抗體購自GeneTex公司；辣根過氧化物酶標抗鼠IgG、Hochest 33342購自CST公司。

1.2 基因測序與引物序列合成

單鏈向導 RNA（sgRNA）寡核苷酸（oligo）的DNA序列合成及基因測序由中美泰和生物技術公司完成。

1.3 PCR擴增目的基因

以pcDNA3.1-ACE2-3xFlag載體為模板設計PCR 擴增引物 ACE2-PQC-F（5′-GATCCGCGGCC GCACCGGGATCTATGTCAAGCTCTTCCTGGCTCCT TCTC-3′）、ACE2-R-mCh（5′-CTTGCTCACCATGG TGGCGACAAAGGAGGTCTGAACATCATCAGTGTT TTGG-3′）。引物的3′端包含能與模板DNA結合的堿基序列，以便擴增出目的DNA片段；引物的5′端包含與線性化載體末端同源的堿基序列，以便PCR擴增片段能與線性化載體進行重組反應。PCR反應條件：98℃預變性30 s；98℃變性10 s，60℃退火30 s，72℃延伸45 s，33個循環；72℃延伸2 min。擴增得到目的基因片段ACE2。擴增產物通過瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，紫外線透射儀下觀察電泳結果，后用膠回收試劑盒回收PCR產物。

1.4 重組載體的構建及鑒定

采用SnapGene 3.2.1軟件設計載體pQCXIPACE2-mCherry（圖1），用XhoⅠ、AgeⅠ限制性內切酶對pQCXIP-mCherry-Lamp進行切割，37℃水浴3 h，10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切結果，待DNA完全消化后（電泳顯示單一條帶），回收純化酶切產物。

圖1 pQCXIP-ACE2-mCherry載體構建示意圖

將目的基因ACE2片段與酶切后的線性化載體用同源重組酶連接，重組產物用熱激法轉化大腸桿菌Trans10感受態細胞，用氨芐青霉素（Amp）篩選，37℃培養12 h后挑取單菌落到LB培養基中，37℃、180 r/min振蕩過夜培養后測序鑒定，獲得重組表達載體pQCXIP-ACE2-mCherry。

1.5 質粒轉染

293T細胞按1.0×106/孔的密度接種于6孔板，用含10%胎牛血清的高糖培養基DMEM于37℃、5% CO2培養箱中常規培養12 h，待細胞生長至匯合度80%時進行轉染。設置實驗組和對照組。實驗組，將 1 μg pQCXIP-ACE2-mCherry表達載體和1 μg pSec-SARS-Cov2-S表達載體共同稀釋在100 μL Opti-MEM培養基中，用LipofectAMINE 3000脂質體作為瞬時轉染介質，共轉入293T細胞，6 h后換成DMEM培養基。對照組，將載體pQCXIP-ACE2-mCherry換成pQCXIP-mCherry，其他條件不變。

1.6 活細胞拍攝觀察融合基因的表達

轉染48 h后在培養基中加入Hochest 33342染料（稀釋比為1∶1000）對細胞核染色，用熒光顯微鏡（Nikon Eclipse）同時采集實驗組和對照組的293T細胞圖像（DIC、DAPI及mCherry通道），觀察熒光蛋白表達情況。

1.7 Western印跡鑒定瞬時轉染細胞系中ACE2及S蛋白的表達

熒光顯微鏡采集圖像后吸走培養基，PBS清洗后用RIPA裂解細胞，提取細胞總蛋白并用BCA法定量蛋白，每個樣品各取50 μg總蛋白，和上樣緩沖液混合后煮沸10 min變性，完成蛋白樣本的制備。將樣本進行SDS-PAGE，電泳結束后將蛋白轉至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h后加入鼠源ACE2抗體（稀釋比為1∶3000）、SARS-CoV-2 spike抗體（1∶2000）、β-actin抗體（1∶8000），4℃或室溫下孵育12 h后用二抗抗鼠IgG（1∶3000）常溫孵育1 h，加入曝光底物進行曝光。以β-actin為內參，Western印跡檢測實驗組及對照組ACE2和S蛋白的表達水平。

2 結果

2.1 pQCXIP-ACE2-mCherry載體的鑒定

用引物ACE2-PQC-F和ACE2-R-mCh擴增所得產物為2459 bp（圖2A），與預期相符，提示ACE2擴增成功。用XhoⅠ、AgeⅠ限制性內切酶對pQCXIP-mCherry-Lamp進行雙酶切，共做2份，電泳顯示2號酶切成功（圖2B）。膠回收目的片段ACE2和切割完成的線性載體pQCXIP-mCherry，用同源重組方法將ACE2與線性載體連接，轉化后挑取單克隆測序，結果顯示插入序列正確無誤（圖2C），證明pQCXIP-ACE2-mCherry融合載體構建成功。

圖2 ACE2的PCR擴增和表達載體構建

2.2 ACE2-mCherry融合蛋白在293T細胞中的表達

研究發現，SARS-CoV-2的S蛋白與ACE2受體結合后，S蛋白將裂解為S1和S2片段，其中S2片段能誘導胞膜融合[7]。在此，我們利用合胞體形成實驗來觀察是否出現膜融合現象，從而驗證ACE2-mCherry是否發揮功能。如圖3所示，載體通過脂質體法轉染293T細胞，48 h后在熒光顯微鏡下可見293T細胞有紅色熒光蛋白的表達。實驗組中，當共轉含ACE2和S蛋白的質粒時，有大量合胞體形成，而對照組無ACE2時幾乎無合胞體產生，證明ACE2-mCherry融合蛋白在293T細胞中表達，并且和S蛋白結合，使其誘導膜融合。

圖3 ACE2-mCherry融合蛋白在293T細胞中的表達

2.3 Western印跡檢測瞬時轉染細胞系中ACE2及S蛋白的表達

為了再次驗證ACE2是否成功表達且發揮功能，我們在蛋白水平檢測ACE2、S及S2蛋白的表達情況。如圖4，SARS-CoV-2的S蛋白全長在實驗組和對照組均表達且無明顯差別，證明pSec-SARS-CoV-2-S質粒均成功轉染且表達量相差不大。實驗組中S2表達，而對照組幾乎不表達，證明ACE2-mCherry發揮其作為S蛋白受體的功能。

圖4 Western印跡驗證蛋白的表達量

3 討論

ACE2是SARS-CoV-2入侵宿主細胞的關鍵受體，研究其表達譜具有重要意義。ACE2可在人體心臟、肺臟、肝臟、腎臟、睪丸、腸等多種組織中表達[4,10]。它在肺組織中主要分布于Ⅱ型肺泡細胞，少量分布于Ⅰ型肺泡細胞、氣道上皮細胞、成纖維細胞、內皮細胞和巨噬細胞，表達量下調是急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）發生的重要原因之一[11-13]。系統和/或局部的ACE/ACE2活性失衡已被認為是許多疾病的重要致病因素。

SARS-CoV-2與ACE2的結合是病毒感染的重要環節和前提條件，因此阻斷二者結合是抑制病毒感染的一種有效方法。目前能夠阻止其與病毒結合發揮作用的藥物正在被研發。Vanessa等[14]利用體外純化的臨床級人重組可溶性ACE2（human recombinant solubility ACE2，hrsACE2）將SARS-CoV-2感染的非洲綠猴腎細胞（Vero）中的病毒生長率降低至1/1000～1/5000；中國科學院生物物理研究所王祥喜團隊在前期篩選到一株對冠狀病毒β家族有廣譜中和作用的人源化單克隆抗體H014的基礎上[15]，發現了一種高效的SARSCoV-2特異性中和抗體P17，可阻礙SARS-CoV-2的RBD蛋白與受體ACE2之間的相互作用，并能阻斷病毒的膜融合過程[16]；Kruse闡述了將可溶性ACE2與免疫球蛋白Fc域融合（ACE2-Fc），既可阻斷SARS-CoV-2的進入，又可以幫助免疫系統建立持久的免疫[17]。

另外，由于ACE2參與人類疾病的多種病理生理過程，進一步了解它在疾病中的作用將有望引導探索新的治療方向。使用ACE2抑制劑進行功能研究對于闡明ACE2的調控機制至關重要。

為了進一步研究ACE2基因在介導病毒感染中的功能，建立帶有熒光標記的ACE2融合表達系統是有效方法之一。本研究利用同源重組方法構建了ACE2基因以及帶有熒光標記蛋白mCherry的真核表達載體pQCXIP-ACE2-mCherry，通過活細胞熒光顯微鏡成像及Western印跡檢測到目的熒光的表達及蛋白表達。在成功構建融合基因基礎上，本研究進一步對該表達載體表達的目的蛋白ACE2的功能進行了初步驗證。實驗結果顯示ACE2能夠介導病毒與宿主細胞結合，進而導致細胞內大量合胞體的出現，與公認已知的ACE2參與病毒感染的研究結果一致，再次說明該系統的構建能夠為進一步探討ACE2功能提供有效的模型。本研究為深入了解ACE2在SARS-CoV-2感染治療中的作用及相應機制奠定了實驗基礎。