小鼠原代肝細胞糖異生研究模型的建立

李輝龍，萬祿明，楊歡，彭雨蒙，王化鵬，韋猛，莫運海，徐藝心，魏從文，鐘輝，吳飛翔，4，5

1.廣西醫科大學附屬腫瘤醫院 肝膽外科，廣西 南寧 530021；2.軍事醫學研究院 生物工程研究所，北京 100071；3.空軍軍醫大學 基礎醫學院，陜西 西安 710032；4.廣西肝癌診療工程技術研究中心，廣西 南寧 530021；5.區域性高發腫瘤早期防治研究教育部重點實驗室，廣西 南寧 530021

糖尿病是全球公共衛生問題，也是全球第七大死亡原因。其特征是機體長時間處于高血糖狀態，如果不及時治療，糖尿病會引起許多并發癥。嚴重的長期并發癥包括心血管疾病、中風、慢性腎臟病、足部潰瘍、神經系統損傷和認知障礙等[1]。機體通過復雜的激素反饋機制將血糖控制在狹窄的范圍，這種嚴格的調節稱為葡萄糖穩態[2]。降低血糖的胰島素和升高血糖的胰高血糖素是其中最主要的激素[3]。當血糖處于低水平時，胰腺釋放胰高血糖素（glucagon，GCG），后者通過促進糖原異生和糖原分解來升高血糖[4]。在短期饑餓中，機體主要通過肝臟糖原的分解來維持血糖平衡；而在長期禁食期間，隨著糖原儲存的逐漸消耗，糖原分解的貢獻逐漸減少，此時肝臟中糖異生的貢獻逐漸增加[5]。在GCG介導下，細胞內環磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）積累并誘導cAMP依賴性蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）激活，進而觸發酶和調節蛋白的磷酸化[6]。然而，肝臟糖異生過程處于異常激活狀態時，會增加肝糖輸出，導致血糖升高，這種長期的高血糖狀態可對機體組織造成損傷，引起胰島素敏感性降低，進一步形成糖尿病[7]。

肝臟是藥物代謝、生物轉化和各種生物分子儲存的主要器官[8]。原代肝細胞是體內肝細胞的良好代表，是在體外研究肝功能的有用工具，如基因表達的變化、內源性物質的代謝以及外源性藥物的藥理特性，新分離的肝細胞比肝臟來源的細胞株更能反映正常肝臟在體內的功能[9]。原代肝細胞的分離方法包括非灌流的機械分離法、胰酶消化法和膠原酶消化法，采用灌流的離體膠原酶灌流法、Seglen兩步灌流法、下腔靜脈逆向膠原酶灌流法和Gerlach五步膠原酶灌流法。迄今，Seglen兩步灌流法是分離大量高活性原代肝細胞的首選方法。在第一步中，含EGTA的無鈣灌注液迅速破壞細胞間連接，第二步用膠原酶破壞支持肝實質細胞結構的細胞外基質[10]。該分離方法是利用動物自身的循環系統通過肝門靜脈向肝臟灌注的技術[9]。該方法能夠減少分離過程中肝細胞的損傷，尚存在灌流針易掉出導致組織消化不充分、細胞提純過程中細胞死亡等問題，仍有待改善實驗技術，進一步提高肝細胞的活率并維持細胞形態。本實驗在Seglen兩步灌流法分離小鼠原代肝細胞的基礎上，進一步完善實驗技術，用糖原染色鑒定原代肝實質細胞，通過細胞對胰高血糖素的響應，進而表現出細胞糖異生葡萄糖的產出水平變化，關鍵酶基因的表達差異以及cAMP-PKA系統的應答反應，建立小鼠原代肝細胞糖異生研究模型。

1 材料和方法

1.1 材料

6只8周齡SPF級雄性C57BL/6J小鼠，體重18～22 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，合格證號為SCXK2020-0006。小鼠飼養于相對濕度40%～70%、溫度20～25℃的環境中，實驗前適應性飼養7 d。

Hank′s緩沖鹽溶液和BCA蛋白濃度測定試劑盒購自Beyotime公司；EGTA購自Meilunbio公司；Ⅳ型膠原酶購自Biofroxx公司；低糖DMEM和無糖DMEM購自Solarbio公司；DMEM/F-12購自Biosharp公司；胎牛血清（FBS）購自Thermo Fisher Scientific公司；丙酮酸鈉和乳酸鈉購自Sigma公司；胰高血糖素購自MedChemExpress公司；cAMPS-Rp購自Tocris公司；二甲基亞砜（DMSO）購自Innochem公司；葡萄糖產出檢測試劑盒購自Invitrogen公司；NucleoZOL購自Macherey-Nagel公司；RNA逆轉錄試劑盒和實時熒光定量PCR試劑購自TransGen Biotech公司；PKA激酶活性檢測試劑盒和cAMP檢測試劑盒購自Abcam公司；qRTPCR引物由北京擎科生物科技有限公司合成。

密閉式靜脈留置針購自BD公司（Becton，Dickinson and Company）；實時熒光定量PCR儀和恒溫培養箱購自Thermo Fisher Scientific公司；倒置顯微鏡購自Nikon公司；全自動酶標儀購自Tecan公司；低溫高速離心機購自北京大龍興創實驗儀器公司；PCR儀購自北京東勝創新生物科技有限公司。

1.2 分離小鼠原代肝細胞

兩步灌流法分離小鼠原代肝細胞。取8周齡SPF級雄性C57BL/6J小鼠，禁食12 h后用10%水合氯醛麻醉，腹部向上膠帶固定四肢，將小鼠固定于吸水工作臺墊上，75%乙醇徹底清潔腹部和胸部區域；用剪刀和直鉗取下腹部切口，剪開表皮和肌肉層，暴露肝臟，用平口鑷將腹部臟器向右外側牽拉，充分暴露并識別肝門靜脈與下腔靜脈；啟動蠕動泵，密閉式靜脈留置針前端有液體緩慢流出后，伴隨液體的流出迅速將留置針置入肝門靜脈，用37℃溫浴的前灌流液進行灌注，剪斷下腔靜脈釋放灌注壓力，灌注體積為75 mL/只；更換含Ⅳ型膠原酶的低糖DMEM消化液繼續緩慢灌注，灌注體積為75 mL/只；待肝臟膠原結構充分消化后，快速切取整個肝臟于含有10 mL DMEM分散液的10 cm培養皿中；更換至生物安全柜中，按照嚴格的無菌要求，用無菌直鑷撕裂肝葉，使肝實質細胞充分游離于分散液中，加入10%胎牛血清以保持肝細胞活力，用10 mL移液管吹打肝細胞懸浮液后，用70～75 μm過濾網過濾細胞懸浮液于50 mL錐形管中；在蕩平式離心機中以4℃、50 r/min離心2 min，去除上清并用含10%胎牛血清的低溫DMEM/F-12洗滌液重懸細胞洗滌，重復離心洗滌4次去除間質細胞和細胞碎片；最后一次離心完成后，吸棄上清，即得小鼠原代肝細胞。

1.3 小鼠原代肝細胞培養

向獲得的小鼠原代肝細胞沉淀中加入25～50 mL DMEM培養基（含10% FBS，1%青霉素-鏈霉素）并重懸、混勻細胞，按密度4.5×108/L平均鋪板于6孔細胞培養板，在37℃、5% CO2恒溫培養箱中培養6～8 h使細胞充分貼壁，吸棄舊培養基，PBS洗滌一次，更換成無血清DMEM培養基繼續培養以充分保持細胞形態和活力，細胞貼壁后，糖原染色鑒定小鼠原代肝細胞，在倒置顯微鏡下觀察細胞生長形態。

1.4 葡萄糖產出檢測

細胞培養24 h后，更換成含10 mmol/L丙酮酸鈉和10 mmol/L乳散鈉的無糖無酚紅DMEM培養基，37℃培養箱孵育4 h后，收集細胞上清于1.5 mL離心管中，1500 r/min離心3 min，收集上清液，盡量避免吸到管底細胞碎片沉淀，上清采用葡萄糖檢測試劑盒檢測葡萄糖產出量，并利用相應蛋白質含量將數據標準化。

1.5 蛋白提取

吸棄培養基，用PBS洗滌2次，加入NP40裂解液，反復吹打細胞使細胞全部脫落，收集細胞懸液于1.5 mL離心管中，置于冰上裂解10 min，4℃、12 000 r/min離心10 min，收集上清液，BCA法測定蛋白質濃度。

1.6 RNA提取

吸棄培養基，PBS洗滌2次，在小鼠原代肝細胞樣品中加入適量NucleoZOL細胞裂解液，吹打細胞使之全部脫落，收集裂解液于1.5 mL離心管，放至勻漿機渦旋振蕩充分裂解細胞，用異丙醇有機試劑沉淀核酸，75%乙醇洗滌核酸沉淀，根據RNA沉淀量多少加入焦碳酸二乙酯（DEPC）水充分溶解，獲得純度及完整性較高的RNA樣本。

1.7 實時熒光定量PCR

如前所述，用NucleoZOL試劑從細胞中提取總RNA，用RNA逆轉錄試劑盒將1 μg純化的RNA逆轉錄為cDNA，采用實時熒光定量PCR儀，利用特異性引物進行定量檢測。結果采用2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達量。

1.8 PKA活性檢測

吸棄培養基，PBS洗滌2次，用配制的細胞裂解液充分裂解細胞，收集裂解液于1.5 mL離心管中，用PKA活性檢測試劑盒測定PKA活性，并利用相應蛋白質含量將數據標準化。

1.9 cAMP含量檢測

吸棄培養基，PBS洗滌2次，用配制的細胞裂解液充分裂解細胞，收集裂解液于1.5 mL離心管中，用cAMP含量檢測試劑盒測定cAMP活性，并利用相應蛋白質含量將數據標準化。

1.10 統計學處理

用GraphPad軟件進行統計學分析，計量數據以x±s表示，采用非配對樣本的雙尾t檢驗和多因素方差分析對不同組數據進行比較。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 小鼠原代肝細胞分離

分離小鼠原代肝細胞后24 h，在倒置顯微鏡下觀察細胞形態并進行糖原染色（圖1）。細胞貼壁良好，具有典型的肝細胞形態，可見雙核，呈多邊形，且細胞相互接觸，排列成肝索樣結構。

圖1 分離的小鼠原代肝細胞

2.2 胰高血糖素通過促進小鼠原代肝細胞糖異生產生葡萄糖

小鼠原代肝細胞分離后，細胞存活率高，形態完整，可進行下一步實驗。為檢測小鼠原代肝細胞是否具有糖異生能力，并優化糖異生研究模型，我們將培養24 h的細胞分成DMSO對照組和GCG實驗組。結果顯示，與DMSO對照組相比，GCG實驗組0 h糖異生葡萄糖產出量無明顯變化，GCG作用1、2、4和8 h細胞糖異生葡萄糖產出量顯著增加（P＜0.001，圖2A）。同時檢測了不同濃度GCG作用4 h后小鼠原代肝細胞糖異生葡萄糖的產出量，結果顯示，與DMSO對照組相比，100、250、500、1000和2000 nmol/L GCG作用下，細胞糖異生葡萄糖產出量顯著增加（P＜0.001，圖2B），GCG濃度為0～1000 nmol/L時葡萄糖產出量呈劑量依賴性，GCG濃度高于1000 nmol/L后葡萄糖產出量達到平臺期。

圖2 GCG作用下小鼠原代肝細胞葡萄糖產出水平

2.3 胰高血糖素上調小鼠原代肝細胞糖異生關鍵酶基因表達

GCG能夠促進小鼠原代肝細胞糖異生產生葡萄糖，并呈時間依賴和劑量依賴。為了進一步研究GCG如何促進小鼠原代肝細胞糖異生產生葡萄糖，我們檢測了在GCG作用下細胞糖異生關鍵酶基因mRNA的相對表達量。結果顯示，與對照組相比，GCG作用后小鼠原代肝細胞的Pcx、Fbp1、Pck1和G6pc等糖異生關鍵酶基因mRNA表達量顯著增加（P＜0.001，圖3A）。同時檢測了細胞糖酵解關鍵酶基因mRNA的相對表達量，結果顯示，與對照組相比，GCG作用后小鼠原代肝細胞的Hk2、Pkm和Pfkl等糖酵解關鍵酶基因mRNA表達量下降（P＜0.001，圖3B）。最后，我們還檢測了糖原分解和糖原合成關鍵酶基因的相對表達量，結果顯示，與對照組相比，GCG作用后小鼠原代肝細胞糖原分解關鍵酶基因Pygl的mRNA表達量顯著增加（P＜0.001，圖3C），而糖原合成關鍵酶基因Gys2的mRNA表達量顯著下降（P＜0.001，圖3D）。

圖3 GCG作用下小鼠原代肝細胞糖代謝關鍵酶基因的mRNA相對表達量

2.4 胰高血糖素上調小鼠原代肝細胞cAMP水平

GCG上調小鼠原代肝細胞糖異生關鍵酶基因Pcx、Fbp1、Pck1和G6pc的mRNA表達，基因表達受上游信號分子調控，其中cAMP發揮關鍵作用。為了進一步研究GCG促進細胞糖異生的作用機制，我們檢測了在GCG作用下細胞cAMP的水平，結果顯示，與DMSO對照組相比，GCG實驗組小鼠原代肝細胞cAMP水平顯著上升（P＜0.001，圖4A）。同時檢測了添加cAMP抑制劑后GCG作用的細胞葡萄糖產出水平，實驗分為DMSO、GCG、GCG和cAMPS-Rp等3組。與GCG組相比，同時加GCG和cAMP-Rp組葡萄糖水平顯著下降（P＜0.001，圖4B），與加DMSO對照組葡萄糖水平相近，表明GCG通過cAMP信號通路促進小鼠原代肝細胞糖異生。我們還檢測了GCG作用下小鼠原代肝細胞PKA活性，結果表明，與DMSO對照組相比，GCG組小鼠原代肝細胞PKA活性顯著提高（P＞0.001，圖4C）。

圖4 GCG作用下小鼠原代肝細胞cAMP和PKA活性

3 討論

哺乳動物禁食期間，糖異生過程被激活產出葡萄糖以維持機體血糖穩定在狹窄的范圍內，其中腎臟的貢獻值為10%，而肝臟的貢獻值達到90%[11]。GCG與位于細胞質膜上的GCG受體（一種G蛋白偶聯受體）結合，受體的構象變化激活了G蛋白，G蛋白是具有α、β和γ亞基的異源三聚體蛋白[12]。當GCG與受體的G蛋白相互作用時，導致該異源三聚體蛋白從β和γ亞基釋放α亞基，α亞基特異性激活級聯反應中的下一個酶——腺苷酸環化酶[13]，該酶產生cAMP，可激活cAMP依賴性PKA[14]。GCG通過PKA活化調節肝糖異生，在急性環境中，通過促進PKA磷酸化來刺激肝糖異生關鍵酶Pcx、Pck1、Fbp1和G6pc的基因表達，并激活這些糖異生過程中的關鍵酶系[15]，進而使血糖穩定在正常范圍內，維持葡萄糖穩態平衡。

在本研究中，我們發現若要獲得活率高形態好的小鼠原代肝細胞，在灌流階段必須充分消化肝組織支持結構。實驗初期，我們時常面臨灌流針從門靜脈掉出或者刺穿門靜脈，導致灌流不充分并影響膠原酶消化肝組織支持結構。為了克服這個技術難題，我們使用留置針代替普通灌流針，避免了灌流針從門靜脈掉出，能夠使肝細胞支持結構充分消化。在小鼠原代肝細胞分離過程中，充分消化肝組織支持結構方能獲得高活率的原代細胞，多次提取原代細胞的經驗表明，灌流75 mL膠原酶液能夠使肝組織支持結構充分消化，肝臟顏色變黃，組織徹底軟化，在肝下葉看到小的清亮透明的部分并可能出現濕透的條紋布樣紋理。當灌流膠原酶充分消化肝組織彈性纖維結構，分散液中可不加膠原酶消化液，對肝細胞活率并無明顯影響。我們發現小鼠原代肝細胞分離洗滌過程中，與單純洗滌液相比，在洗滌液中加入10%的胎牛血清可以更大程度滿足細胞的營養需求，進一步維持細胞活性和細胞形態，分離后的原代肝細胞存活率達95%以上，細胞能夠良好貼壁，貼壁后具有典型的肝細胞形態。研究表明，含有血清的培養條件更有利于細胞貼壁，細胞貼壁后我們比較了有無血清的培養條件下的細胞形態，發現無血清的培養環境更有利于維持小鼠原代肝細胞的形態和活性。

我們比較了小鼠原代肝細胞在有無GCG作用下的糖異生水平，發現小鼠原代肝細胞狀態良好，能夠對GCG做出有效響應。與DMSO對照組相比，在GCG作用下，細胞糖異生葡萄糖產出水平上升。此外，我們檢測了糖代謝相關的關鍵酶系的mRNA相對表達量，結果表明，在GCG作用下，糖異生關鍵酶系基因的表達顯著上升，糖酵解關鍵酶系基因的表達下降。進一步探究原代肝細胞對糖異生信號級聯通路的應答情況，發現GCG作用下細胞cAMP含量顯著增加，而在GCG處理的細胞中加入cAMP抑制劑，GCG上調葡萄糖產出水平的現象消失。為進一步觀察細胞對糖異生信號級聯通路的響應，我們還檢測了細胞的PKA活性，結果表明GCG刺激的細胞PKA活性顯著上調。糖代謝是機體為維持血糖穩定做出的各種調節和代償性反應，由各器官協同應答，共同參與對機體血糖波動的調節。小鼠原代肝細胞能夠在葡萄糖產出水平及信號級聯通路水平在體外有效模擬哺乳動物肝臟的糖異生代謝，可用于分子機制研究以及藥物代謝評價研究。