MIR6766的抗百草枯功能及其分子機制初探

李娜，陳晨，董研博，王健，李山虎

軍事醫學研究院 生物工程研究所，北京 100850

百草枯（paraquat，PQ），化學名1-1-二甲基- 4-4-聯吡啶陽離子鹽，在溶液中以PQ2+形式存在，它可以接受一個電子形成一種穩定的紫色或藍色的百草枯自由基即PQ·+，因此最初用做氧化還原指示劑[1]。后發現PQ能快速殺死綠色植物，但在土壤中會被滅活，對植物根及宿根不發揮作用，而成為世界上最廣泛應用的農藥之一。

百草枯進入體內后，多數通過多胺攝取系統特異性地集中在肺里，尤其是肺泡Ⅰ、Ⅱ型及克拉克細胞，對肺泡細胞造成極大損傷。它的毒性極大地可能源于氧化應激產生的活性氧類物質（reactive oxygen species，ROS）[2]。PQ2+可以通過細胞內的氧化還原酶，如還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶、細胞色素P450氧化還原酶（cytochrome P450 oxidoreductase，POR）、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）泛醌/醌氧化還原酶、黃嘌呤氧化酶、一氧化氮合酶、硫氧還蛋白還原酶等[3-4]被還原為PQ·+，在有氧情況下PQ·+又重新被氧化為PQ2+，此過程可產生氧自由基（O·-）、過氧化氫（H2O2）、羥基自由基（OH·-）等一系列ROS，對細胞DNA、脂質、蛋白質、線粒體等造成傷害，引起細胞炎癥，進而致細胞死亡。由于不當使用，PQ會造成人的肺、腎等多器官衰竭及神經退行性疾病，目前無特效解毒藥。

Reczek等使用約含3000個代謝基因的代謝組文庫通過CRISPR/Cas9技術進行百草枯抗性的篩選，發現POR、ATP7A等一系列潛在的抗性基因，經150 μmol/L PQ處理48 h后，敲除POR基因的細胞內外的H2O2水平較對照細胞均顯著降低[5]，提示POR基因可能是產生ROS的主要原因。百草枯引起細胞死亡的分子機制復雜，氧化應激、炎癥反應及自噬都參與其中[5-7]。為了篩選出更加有效和具潛力的百草枯抗性基因，可以使用全基因組文庫篩選抗性基因，以求能更清晰地闡述百草枯引起死亡的分子機制。

本研究中，我們使用CRISPR/Cas9全基因組敲除文庫對A549細胞進行百草枯耐藥基因篩選，篩選出一系列單鏈向導RNA（small guide RNA，sgRNA）富集的抗性基因，其中包含MIRNA6766與POR等基因。細胞毒性實驗證實MIR6766敲除細胞表現出抗百草枯表型，其可能機制為間接降低了POR的表達水平，進而減弱了百草枯對細胞的毒性作用，為進一步研究MIR6766對百草枯抗性作用的分子機制奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

A549細胞、HEK293T細胞、大腸桿菌感受態細胞DH5α和DH10B為本實驗室保存；PQ為毒物藥物研究所贈送；胎牛血清（FBS）購自杭州四季青公司；青霉素和鏈霉素購自華北制藥有限公司；DMEM高糖培養基和含0.25% EDTA的胰蛋白酶購自Gibco公司；PBS購自索萊寶公司；嘌呤霉素購自HyClone公司；Genome-scale CRISPR Knock-Out v2.0 pooled libraries（GeCKO v2 libraries）購自 Addgene公司；LipofectAMINE 3000轉染試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒購自Thermo公司；質粒提取試劑盒購自Axygen公司；miRcute增強型miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒和miRcute增強型miRNA熒光定量檢測試劑盒購自天根公司；Cell Counting Kit8（CCK8）試劑盒購自東仁化學科技有限公司；POR抗體購自Abcam公司；CO2恒溫培養箱和MULTISKAN FC酶標儀購自Thermo公司；Q-PCR儀器購自伯樂公司。

1.2 GeCKO v2 libraries擴增及慢病毒包裝

采用電擊轉化法將GeCKO v2 libraries A、B文庫各1 μL轉化大腸桿菌DH5α感受態細菌，轉化后涂固體LB氨芐培養基，37℃溫箱培育14 h，刮取平板上的轉化子提取質粒并測定濃度后保存于-20℃。用LipofectAMINE 3000、文庫質粒與包裝質粒共同感染HEK293T細胞，包裝出慢病毒，測定病毒滴度。

1.3 全基因組CRISPR/Cas9敲除文庫篩選百草枯抗性基因

根據測定的慢病毒的滴度，將含有sgRNA的文庫慢病毒感染A549細胞，使感染復數（multipilicity of infection，MOI）≤0.3，以保證每個細胞內有且只有1個sgRNA。為保證MOI在符合范圍內，當細胞數達到3.6×108時，用175 cm2培養瓶接種初始細胞4×106/瓶。待嘌呤霉素篩選后將細胞平均分為3組，即0 d組（day0）、對照組（0 μmol/L百草枯）和藥物篩選組（12 μmol/L百草枯）。day0組在嘌呤篩選后即開始藥物篩選時凍存6×107細胞。為保證sgRNA的穩定富集，另2組分別以6×107細胞傳代，每組細胞數達到1.2×108時傳代，傳10代后分別取6×107細胞凍存，與day0組一起送上海尋百會公司進行深度測序與生物信息分析，得到sgRNA穩定富集的基因。

1.4 候選抗百草枯基因MIR6766/POR敲除質粒構建和細胞系建立

使用CRISPR-LentiV2質粒作為構建敲除細胞的慢病毒表達載體系統，靶向MIR6766、POR，對照基因的sgRNA上下游序列由博邁德公司合成。將sgRNA上下游引物按照梯度降溫的方法退火，將CRISPR-LentiV2質粒用BsmBⅠ酶切后膠回收，二者產物通過T4DNA連接酶連接，轉化大腸桿菌DH10B后涂于氨芐LB固體培養基，挑取單克隆菌落培養500 μL菌液，用設計的鑒定引物菌液PCR擴增目的條帶，鑒定正確后將菌液送博邁德生物公司測序，測序正確后提取目的質粒，測定濃度后于-20℃保存。

將293T細胞以70%～80%的密度接種于100 mm皿中，24 h后進行慢病毒包裝。按照慢病毒包裝質粒pMD2G∶包裝質粒pSPA×2∶目的質粒為1∶3∶4的比例與PEI一起轉染293T細胞，12 h后換液，24、48 h后分別收取含有病毒顆粒的培養液即慢病毒，用0.45 μm的濾膜過濾分裝后于-80℃保存。將A549細胞以30%～40%的密度接種于100 mm皿中，24 h后進行慢病毒的感染。以完全DMEM培養液∶慢病毒為1∶1的比例加于培養皿中，并添加終濃度為10 g/L的聚凝胺，12 h后更換新鮮培養液，更換培養液后24 h加入終濃度為1.5 μg/mL嘌呤霉素進行抗性篩選48 h，存活的細胞即為感染目的質粒成功的細胞。

1.5 Q-PCR驗證對照與敲除細胞的相關基因表達

感染成功的細胞采用TRIzol法提取RNA，反轉錄出cDNA，進行Q-PCR鑒定。

1.6 CCK8法檢測細胞存活率

對照細胞與敲除細胞以7×103/孔接種于96孔培養板，20 h后用于實驗。實驗設空白組、對照組（不加百草枯）、100 μmol/L百草枯組、150 μmol/L百草枯組，每組3個復孔。藥物作用72 h后棄去原有培養液。將CCK8液與培養液按1∶10的比例混勻后每孔加入100 μL，2 h后用酶標儀測定D450nm值。細胞存活率（%）=（D藥物組-D空白組）/（D對照組-D空白組）。

1.7 Western印跡驗證POR基因蛋白水平表達

將對照與敲除細胞接種于60 mm皿中，待細胞生長至80%～90%時用PBS清洗2次，吸盡殘存的PBS后置于-80℃，次日取出后加入適量的細胞裂解液，冰上裂解30 min，吹打轉移至離心管，4℃、12 000 r/min離心 10 min，取上清，加入5×SDS上樣緩沖液，用10%分離膠進行SDS-PAGE，電泳后轉膜。POR蛋白使用兔種屬一抗（1∶500），4℃孵育過夜；鼠抗兔二抗（1∶2000），室溫孵育1 h。GAPDH使用鼠種屬一抗（1∶10 000），4℃孵育過夜；羊抗鼠二抗（1∶20 000），室溫孵育30 min?；瘜W發光系統拍照。

1.8 統計學分析

用GraphPad Prism 7軟件進行數據分析及制圖，連續型變量以x±s表示，組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 CRISPR-Cas9敲除文庫篩選出A549細胞耐百草枯基因MIR6766

如圖1A，用CRISPR-Cas9敲除文庫慢病毒感染A549細胞，經嘌呤霉素篩選后，建立了全基因組敲除的A549細胞庫。將全部細胞分為day0組、對照組（0 μmol/L PQ）和實驗組（12 μmol/L PQ），篩選細胞傳10代后提取基因組DNA，經高通量測序和生物信息學分析，獲得了抗百草枯的候選基因（圖1B），為進一步篩選百草枯的抗性基因提供依據。

圖1 利用CRISPR/Cas9文庫篩選出抗百草枯基因MIR6766與POR

2.2 構建敲除MIR6766、POR的細胞系

使用對照和敲除MIR6766、POR表達的sgRNA慢病毒感染A549細胞（sgRNA上下游序列見表1），經嘌呤霉素篩選后得到穩定對照細胞系（sg-control）和MIR6766敲 除 細 胞 系（sg-MIR6766）、POR基因敲除細胞系（sg-POR）。提取sg-control、sg-MIR6766的細胞總 RNA，反轉錄出cDNA，實時熒光定量PCR定量分析（GAPDH和MIR6766熒光定量PCR引物見表2）。以sg-control為對照樣品，GAPDH表達量為對照表達量，熒光定量結果如圖2A，sg-MIR6766中MIR6766表達量相對于sg-control顯著降低（P＜0.05），表明構建出敲除MIR6766的細胞系。Western印跡表明針對POR基因2個靶點均顯著抑制POR的表達（圖2B），從而構建了敲除POR基因的A549細胞系。

圖2 構建MIR6766與POR敲除細胞系

表1 CRISPR/Cas9 sgRNA序列

表2 熒光定量PCR引物序列

2.3 敲除MIR6766和POR細胞系表現出百草枯耐藥性

CCK8細胞毒性實驗結果（圖3A）表明，經100、150 μmol/L百草枯處理3 d后，對照細胞存活率分別為21%、13%，敲除MIR6766細胞系存活率為62%、43%，具有顯著性差異（P＜0.05）。敲除POR細胞系表現出同樣的存活率差異（圖3B、C）。這表明敲除MIR6766或POR基因后，細胞表現出抗百草枯表型。

圖3 MIR6766與POR敲除細胞表現出百草枯抗性表型

2.4 sg-MIR6766的POR基因mRNA與蛋白表達水平降低

sg-MIR6766的POR基因mRNA表達水平顯著低于對照細胞（P＜0.01，圖4A）。經不同濃度百草枯處理3 d后，sg-MIR6766的POR蛋白表達量顯著低于對照細胞（圖4B、C）。提示MIR6766可能參與調控POR基因的表達。

圖4 MIR6766敲除細胞系中POR基因mRNA和蛋白表達水平

3 討論

百草枯中毒解救方法是醫學上的難題，臨床常應用血液灌流法救治病人[8]。體外和動物實驗證明，伏立諾他通過阻止Smad7在大鼠體內去乙?；?，可在一定程度上減輕百草枯誘導的肺纖維化[9]；強力霉素通過抑制中性粒細胞來源的基質金屬蛋白酶9，減輕百草枯引起的急性肺損傷[10]；姜黃素在一定程度上對肺纖維化有改善作用[11]；蜂毒肽對百草枯誘導的小鼠肺損傷具有調節氧化應激和凋亡的作用[12]。但以上救治方案效果并不理想，不能明顯降低百草枯引起的毒性損傷。

本研究利用CRISPR/Cas9全基因組敲除文庫在人肺癌A549細胞中篩選對百草枯耐藥基因，發現在百草枯作用下A549細胞中MIR6766基因的sgRNA得到富集，提示MIR6766基因可能參與百草枯耐藥表型的發生。進一步研究發現，敲除MIR6766細胞系對于百草枯引起的細胞死亡具有一定的抵抗作用，較對照細胞具有更高的存活率，表現出抗百草枯表型，提示MIR6766在百草枯引起的細胞死亡中發揮重要作用。

CRISPR/Cas9是一種古細菌防御系統，是由RNA引導的 CRISPR（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，規律成簇間隔短回文重復）相關核酸酶Cas9切割DNA，導致在基因組的特定位點引入靶向功能突變缺失[13]。人工合成的sgRNA可以引導Cas9在特定的基因組位點使DNA雙鏈斷裂[13]，產生移碼突變等導致基因功能缺失。大量sgRNA的集合可形成一個sgRNA文庫，從而可以編碼不同細胞的不同基因[14]。隨著CRISPR/Cas9高通量篩選系統的不斷發展和完善，已經篩選獲得了一系列藥物治療耐藥基因或毒物抗性基因[15-17]。

POR基因編碼的細胞色素P450氧化還原酶位于內質網膜，對細胞色素P450催化的類固醇激素、藥物代謝反應等至關重要。它具有黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD）結合結構域和黃素類毒素樣結構域，可以結合2個輔助因子FAD和黃素單核苷酸（FMN），能給所有微粒體P450酶提供電子。Reczek等使用約含3000個代謝基因的sgRNA代謝組文庫進行百草枯抗性篩選，發現降低POR基因表達可以降低百草枯引起的ROS水平，在百草枯引起的死亡中發揮了重要作用。本研究通過全基因組文庫也篩選出POR基因，敲除POR基因細胞也出現了抗百草枯表型。

MIR6766功能尚不明確。本研究表明MIR6766敲除細胞系中POR基因的mRNA與蛋白表達量顯著降低，而敲除POR基因的細胞也表現出抗百草枯表型，初步提示MIR6766可能通過影響POR基因表達量而發揮抗百草枯作用。但是兩者的相互作用機制，以及與百草枯耐藥的相關機制仍須深入探討。