P62-Nrf2通路在非酒精性脂肪性肝炎中的作用

呂梟銳 朱惠娟 龔鳳英

中國醫學科學院，北京協和醫學院，北京協和醫院內分泌科，衛健委內分泌重點實驗室，協和轉化醫學中心 100730

目前，非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的病因尚未完全明確。多數學者認為氧化應激在其發病過程中發揮重要作用。P62是一種多功能蛋白質，能激活抗氧化應激反應中的關鍵因子——核因子E2相關因子2(Nrf2)。因此，本文就P62-Nrf2通路在NASH中發揮的作用及機制作一綜述。

1 NASH概述及發病機制

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是一種由肝細胞脂質積聚引起的進行性疾病。隨著疾病發展，NAFLD可以從單純性脂肪肝進展為NASH，甚至肝硬化及肝癌。目前，NALFD被認為是最常見的慢性肝病，而其中大約有30%的NAFLD患者會發展為嚴重的NASH[1]。NASH的病理特點主要包括：脂肪變性、氣球樣變、小葉炎性反應和纖維化。然而，盡管關于NASH治療的研究越來越多，目前尚缺乏針對該疾病的專門治療藥物。

NASH的發病機制至今尚未明確，目前的主流學說為“二次打擊學說”。第一次“打擊”指肝臟發生脂肪變性。由于胰島素抵抗等因素，肝臟內游離脂肪酸流入增加，脂肪從頭生成增加，以及脂質輸出途徑受損，導致肝臟內脂肪異常積累[2]。第二次“打擊”指肝臟發生氧化應激。肝臟內脂肪酸積聚過多，伴隨線粒體功能受損，產生過量的活性氧簇，從而導致Kupffer細胞數量增多且活化，其分泌的炎性因子增加，使肝臟內炎性反應增加；此外脂肪酸還可激活肝星狀細胞，促進其產生膠原，使肝臟纖維化程度增加[3-4]。

2 P62和Nrf2概述

P62也被稱為SQSTM1/A170/ZIP/STAP，相對分子質量為62 000，最初被鑒定為一種能結合淋巴細胞特異性蛋白酪氨酸激酶(LCK)的蛋白質。磷酸化P62是其活性形式。P62具有多個功能基序，其中微管相關蛋白1輕鏈3(LC3)相互作用區(LIR)和C末端泛素相關(UBA)結構域能作為自噬受體/接收器，通過識別多泛素鏈、與LC3結合參與自噬過程，從而清除受損的蛋白質和細胞器[5]。近年來的研究還發現，P62通過激活不同通路發揮不同的作用，如P62能激活核因子-κB，促進炎性反應的發生；激活Nrf2，發揮抗氧化應激的作用；激活哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復合物1(mTORC1)，感知機體營養狀態的變化。

Nrf2(或稱Nfe2l2)是一種堿性亮氨酸拉鏈轉錄因子，能調節抗氧化酶、親電結合酶、泛素/蛋白酶體、熱休克蛋白等多種細胞應激相關因子的轉錄過程[6]。Nrf2作為抗氧化、抗炎等細胞防御手段的主要調節因子，對心血管疾病、肝臟疾病和腎臟疾病等發揮保護作用。

正常情況下，Nrf2主要通過與Kelch ECH相關蛋白1(Keap1)和肌動蛋白細胞骨架的相互作用而定位在細胞質中。而Nrf2的降解通常是由Keap1-Cul3-E3泛素連接酶復合物將其泛素化后，在26S蛋白酶體上完成的[7]。當細胞受到氧化應激刺激后，Keap1的巰基發生改變，使其與Nrf2解離，導致Nrf2進入細胞核內，與靶基因啟動子區的抗氧化反應元件(ARE)結合，促進抗氧化酶的表達，啟動抗氧化應激反應[8]。研究發現，P62能夠通過兩種途徑激活Nrf2。首先，內源性P62的積累能將Keap1隔離成聚集體，從而抑制Keap1介導的Nrf2泛素化和隨后蛋白酶體降解Nrf2的過程[9]。其次，Keap1自身的降解也受P62的調控。研究發現，P62的過表達能顯著縮短Keap1的半衰期，而抑制P62的表達則能延長Keap1的半衰期[10]。因此，P62能通過加快Keap1的降解，間接使Nrf2的積累增加，穩定性增加，從而發揮抗氧化應激的作用。Nrf2還能促進P62基因(SQSTM1基因)的轉錄。二者之間形成一個正反饋環，互相促進，共同發揮抗氧化應激的作用[11]。

3 P62和Nrf2在NASH中的作用

3.1 Nrf2在NASH中的作用 研究顯示，敲除Nrf2基因會導致小鼠從單純性脂肪肝發展為NASH[12]。主要與Nrf2改善肝臟脂肪變性和減輕炎性反應及纖維化程度有關。

研究發現，與野生型小鼠相比，Nrf2基因敲除小鼠肝臟內參與脂肪酸合成的ATP-檸檬酸裂解酶、乙酰輔酶A羧化酶-α、脂肪酸合成酶的mRNA表達顯著增加[13]；而肝臟特異性表達Nrf2的NASH模型小鼠肝臟中與β氧化相關的肉堿棕櫚酰轉移酶Ⅱ(CPT2)基因和負責甘油三酯輸出的微粒體甘油三酸酯轉移蛋白(MTTP)基因等的mRNA表達水平明顯升高[14]。上述結果表明，Nrf2能抑制肝臟內脂肪酸合成相關蛋白酶，促進脂肪酸氧化和脂質運輸相關蛋白的表達，從而改善肝臟脂肪變性。

Chowdhry等[15]研究發現，與野生型小鼠相比，Nrf2基因敲除的NASH模型小鼠肝臟內醌氧化還原酶活性及抗氧化劑谷胱甘肽含量均顯著降低，而白細胞介素-1β、腫瘤壞死因子-α、一氧化氮合酶、環氧合酶等的mRNA表達水平增加。表明Nrf2基因敲除導致小鼠的抗氧化應激能力降低，并促進炎性反應的發生。此外，過表達Nrf2的NASH模型小鼠的肝臟膠原纖維沉積程度與對照組相比明顯下降；與活性氧簇生成相關的細胞色素P450 2E1、細胞色素P450 4A10和NADPH氧化酶2等氧化劑的表達也隨之下降，提示Nrf2能改善小鼠的肝臟纖維化程度，可能與其介導的抗氧化應激反應有關[16]?？傊?，這些結果表明Nrf2可能通過介導抗氧化應激反應，減輕NASH小鼠肝臟中的炎性反應和纖維化程度。

3.2 P62-Nrf2通路在NASH中的作用 研究發現，與健康人和NAFLD患者相比，NASH患者肝臟中P62的表達明顯升高。同時，NASH模型小鼠肝臟中P62的表達也較對照小鼠顯著增加。P62能夠通過激活Nrf2促進抗氧化蛋白的表達。提示P62在NASH的發病過程中也發揮了一定作用[17]。

研究表明，與單獨敲除Nrf2或P62基因的小鼠相比，同時敲除Nrf2和P62基因(DKO型)的小鼠肝臟脂肪變性、活動度和纖維化評分均明顯增加，同時敲除Nrf2和P62基因會加重NASH的嚴重程度[18]。進一步研究發現，DKO型小鼠還表現出血清和糞便中脂多糖水平升高，而脂多糖能促進Kupffer細胞分泌的炎性因子腫瘤壞死因子-α mRNA表達增加。這些結果提示，同時敲除P62和Nrf2基因可使小鼠體內脂多糖的表達增加，導致Kupffer細胞介導的炎性反應增加，從而促進NASH的發生、發展[18]。

棕櫚酸是哺乳動物體內常見的一種飽和脂肪酸，能誘導細胞產生脂毒性。脂毒性指細胞內脂肪酸的過度積累，產生了過量的活性氧簇，導致細胞發生功能障礙或死亡，與NASH的發生、發展密切相關。Park等[19]發現，P62基因敲除小鼠胚胎成纖維細胞棕櫚酸誘導產生的活性氧簇含量是對照組的8倍左右，同時還伴有Keap1蛋白的降解減少以及Nrf2靶基因的表達下降。進一步研究發現，P62能通過促進AMP依賴性蛋白激酶和UNC-51樣自噬激活激酶-1之間的相互作用，誘導ULK1的磷酸化，導致細胞發生自噬，促進Keap1降解和Nrf2激活，從而保護細胞免受脂毒性的損害[20]。

4 基于P62-Nrf2通路的潛在治療藥物

4.1 氯硝柳胺乙醇胺(Niclosamide ethanolamine, NEN) NEN是美國食品藥品監督管理局(FDA)批準的一種驅蟲藥，廣泛應用于腸道寄生蟲感染的治療。動物實驗表明，NEN能夠降低高脂飲食小鼠肝臟內的脂肪含量和聚集程度，從而減輕肝脂肪變性[21]。還有研究發現，使用NEN干預肝Hepa1c1c7細胞后，飽和脂肪酸誘導的細胞死亡數明顯下降，同時還伴有P62的磷酸化和Keap1的降解增加[22]。而敲除P62基因后再使用NEN處理小鼠胚胎成纖維細胞發現，細胞內Nrf2的表達和飽和脂肪酸誘導的細胞死亡數與對照組相比無明顯差異。表明NEN能夠改善小鼠肝臟脂肪變性，通過激活P62-Nrf2通路減輕脂毒性的損害[22]。

4.2 依西替米(Ezetimibe) 依西替米是一種有效的膽固醇吸收抑制劑，經FDA批準廣泛用于治療高膽固醇血癥?；?5例NAFLD患者的藥物試驗發現，經過24個月的依西替米治療后，患者的肝臟病理特征如脂肪變性、壞死性炎性反應、氣球樣變以及NAFLD活性評分等與治療前相比均得到明顯改善[23]。在NASH模型小鼠中也得到了一致的結果，即給予依西替米處理能夠明顯減少小鼠肝臟內的脂滴大小和數量；降低炎性因子、轉氨酶和肝Ⅰ型膠原mRNA的表達水平以及改善纖維化程度[24-25]。進一步研究發現，與對照組相比，用含依西替米飼料喂養的小鼠肝臟內TBARS(反映肝臟氧化應激程度)水平降低，同時還檢測到P62磷酸化水平和依西替米的表達明顯增加。上述結果提示，依西替米能夠通過激活P62-Nrf2通路，減輕小鼠肝臟的氧化應激反應，從而抑制NASH的發生、發展[25]。

綜上所述，NAFLD是目前最常見的慢性肝病，大約有1/3的患者會發展為NASH。然而，目前尚未研發出能治愈NASH的藥物。Nrf2作為體內最重要的抗氧化因子，能夠被P62所激活，調控下游抗氧劑的表達，啟動抗氧化反應。研究發現，抑制P62-Nrf2通路會加重小鼠肝臟內脂肪變性、炎性反應和纖維化程度，從而促進NASH的發生、發展。而NEN和依西替米能激活該通路，介導抗氧化應激反應，從而減輕肝細胞脂毒性和NASH小鼠肝臟脂肪變性和纖維化程度。但是，目前對P62-Nrf2通路在NASH中作用機制的研究還不夠深入，同時也尚未進行NEN和依西替米治療NASH患者的臨床試驗。未來還需要繼續探索P62-Nrf2通路在NASH中的作用，為其成為NASH治療靶點提供證據。