蛋白質結構的“限域下最低能量結構片段”假說與蛋白質進化的“石器時代”

曹傲能

上海大學納米化學與生物學研究所，上海 200444

1 引言

蛋白質是地球上所有生命體中大多數功能的執行者。蛋白質的一維氨基酸鏈只有折疊成特定的三維空間結構，才具有生物活性。從這個意義上可以說，生命始于蛋白質折疊，因而蛋白質折疊問題也被稱為第二遺傳密碼。遺憾的是，經過數十年大量的研究，至今仍然沒有找到任何折疊密碼，蛋白質結構似乎不存在簡單的規則。Anfinsen于上個世紀六十年代左右提出，蛋白質的氨基酸序列包含其天然結構的全部信息，而蛋白質的天然結構是其熱力學最穩態1。這個假說至今仍是唯一普遍接受的關于蛋白質結構和折疊問題的理論。但實驗研究發現一些蛋白質的天然活性態結構并不是其熱力學最穩態，這說明Anfinsen的熱力學假說并不完全正確，而且這一黑匣子式的論斷也沒有提供關于第二遺傳密碼的任何細節。蛋白質序列仍然如天書般“句讀之不知，惑之不解”。蛋白質折疊問題也被Science雜志列為125個未解決的科學問題之一2。

科學家很早就希望尋找類似一個DNA密碼子對應一個氨基酸那樣簡潔的蛋白質序列-結構對應關系。一維的DNA可以簡單地對應一維的氨基酸序列，但是想要把一維的氨基酸序列和三維的蛋白質結構對應起來就沒那么簡單，甚至是不可能的。所有將局部氨基酸序列與特定局部結構對應的努力都已宣告失敗。無論是天然蛋白質的結構數據，還是蛋白質全新設計的結果都表明，蛋白質中的長程作用力對局部序列的結構具有重要影響3?；蛘哒f，蛋白質中的長程作用力相當于文章中的有關聯的“上下文”，可以改變一句話(蛋白質局部序列)的含義(局部結構)。但長程作用力怎樣影響局部序列的結構仍然是未解之謎。

另一方面，一些蛋白質中的片段可以嫁接到完全不同的蛋白質骨架上并保持原來的結構和功能。說明在不同的蛋白質序列“上下文”中，局部多肽片段也可以采取相同的結構。這一結果可以理解成這些不同的“上下文”對局部句子的影響可以是相同的。而最近我們更是將天然抗體蛋白中的CDR (complementarity-determining region，互補決定區)環區片段嫁接到無機納米粒子上，成功重建了CDR環區在原天然抗體中的結構和識別原來抗原的功能，制備出人工納米抗體4。這一工作暗示，蛋白質完整序列的“上下文”也是可有可無的。這類交叉領域的工作進展，為我們認識蛋白質的結構和折疊問題帶來新的啟示。本文結合我們最近的工作，提出了蛋白質結構的“限域下最低能量結構片段”假說。

2 蛋白質結構與折疊基本特征

2.1 尋找蛋白質局部序列的結構傾向性

如果不考慮氨基酸殘基的側鏈構象，蛋白質主鏈結構可以用各氨基酸殘基的兩二面角(Φ，Ψ)來表示。每個氨基酸殘基的兩個二面角都有一個允許取值范圍，可以畫出相應的Ramachandran圖5。雖然不同氨基酸的二面角的允許范圍有所不同，但每個氨基酸都可以采取無數個二面角組合，也就是說，不存在固定的氨基酸-結構對應關系。大量已解析的蛋白質結構也表明，同一種氨基酸可以在不同的二級結構中出現，雖然出現概率有很大的不同6,7，但不存在簡單的氨基酸-結構一一對應關系。顯然，尋找第二遺傳密碼不能寄希望于單個氨基酸對應關系。

蛋白質結構中存在多種典型的局部結構特征，即蛋白質各種二級結構(α螺旋、β折疊股(βstrand)、轉角、環區等)。早在第一個蛋白質結構解析出來之前，Pauling與合作者就從理論上預測了蛋白質局部二級結構α螺旋和β折疊的存在8,9。但Pauling等的工作主要是基于蛋白質主鏈的，沒有考慮氨基酸的側鏈，也就是說沒有序列特異性。蛋白質結構的解析證明了Pauling理論預測的正確性，然而蛋白質結構數據的統計分析表明，同樣不存在局部序列-結構的一一對應關系。而且蛋白質中絕大多數多肽片段在單獨存在時沒有穩定構象，或與天然蛋白質中構象不同。從簡單一維序列信息到復雜的三維結構，顯然在序列上不相鄰的氨基酸之間的長程作用力是至關重要的。

2.2 蛋白質結構中的長程作用力

蛋白質結構中長程作用力包括二硫鍵及多種非鍵相互作用，如靜電相互作用、疏水作用、范德華力、氫鍵等。這些長程作用力是維持蛋白質三級結構和四級結構的主要原因。

Baker與合作者曾經定義一個相對接觸級數(Contact order)來度量蛋白質結構中序列上不相鄰的氨基酸之間的接觸作用，并發現一些可自動折疊的小蛋白質的接觸級數與其折疊動力學之間存在一定的關聯10。Baker等的接觸級數概念主要存在兩個問題。一是沒有考慮多個氨基酸協同形成的長程作用團(比如疏水核心)，這種作用團往往比單獨的作用更強，對蛋白質結構的穩定貢獻更大。二是接觸級數不區分接觸的作用類型，只要兩個殘基的原子在空間中的距離在范德華半徑接觸距離內就同等對待。但顯然，不同類型的相互作用(比如氫鍵和二硫鍵)的強度差別及其對蛋白質結構與折疊貢獻的差別是巨大的。所以，接觸級數與折疊速率的關聯僅僅是一個表觀的相關性擬合，不能說明他們存在因果關系，也不可能反映真實的蛋白質結構與折疊原理。

不同的長程作用力對蛋白質結構的穩定性作用是千差萬別的，部分甚至是無足輕重的。以氫鍵為例，盡管氫鍵是蛋白質α螺旋和β折疊等二級結構的一個顯著特征，但氫鍵的作用其實并沒有想象中的那么大。地球上的生物都是“水做的”，蛋白質分子中的氫鍵給體和受體除了形成鏈內氫鍵外，也可以與環境中的水分子形成氫鍵，所以蛋白質鏈內形成氫鍵并不增加包括環境在內的整個系統的氫鍵總量。因而，考察某個作用力對蛋白質結構穩定性的貢獻，必須綜合考慮它對包含蛋白質分子和溶劑環境在內的整個系統的凈貢獻。事實上，盡管蛋白質中存在數目巨大的弱相互作用力，他們對蛋白質穩定的凈作用力是比較小的，僅僅相當于幾個氫鍵的作用力。

雖然一般來說單個氫鍵的作用對蛋白質結構穩定性貢獻較小，但如果多個氫鍵形成協同效應則可以產生一個穩定的局部結構。比如，β折疊片之間氫鍵的協同效應可以產生非常強的長程相互作用，對蛋白質結構起到很大的穩定作用。典型的βαβ超二級結構就是蛋白質結構中常見的模塊(Rossmann fold，見圖1a)。同樣，β折疊片之間氫鍵的協同效應也是蛋白質的β結構纖維化聚集體穩定的主要原因。而α螺旋中雖然也有規律排列的i-i+ 4氫鍵，但其協同效應相對β折疊片之間的氫鍵協同效應要弱很多。一些單股的α螺旋穩定性不一定高，但在典型的亮氨酸拉鏈結構中，兩股α螺旋可以通過規則的亮氨酸拉鏈形成緊密的堆積而得到穩定11。這里的亮氨酸拉鏈就是另一個強協同長程作用的代表，也是一種疏水作用(見圖1b)。

疏水作用不僅存在于亮氨酸拉鏈結構中，更普遍地存在于蛋白質結構內部。蛋白質鏈中的疏水氨基酸傾向于折疊到蛋白質內部，形成一個疏水核心(見圖1c)。疏水核心由疏水氨基酸堆積而成，其中固然有大量數目的范德華力，但疏水作用是一個綜合效應，一般認為主要是因為熵效應的貢獻12。

和以上眾多弱相互作用協同形成的長程作用不同，單個二硫鍵就是很強的長程作用力。盡管Anfinsen與合作者已經證明核糖核酸酶A (RNase A)等小蛋白質的二硫鍵打開后，可以在正常生理條件下自動氧化恢復正確的二硫鍵和天然活性1。但在沒有氧化還原劑和二硫鍵異構酶存在下，僅僅通過蛋白質的構象變化是不能改變二硫鍵結構的。二硫鍵是蛋白質一維氨基酸鏈之外的唯一共價結構，正確配對的二硫鍵是蛋白質形成正確構象的必要條件(見圖1d)。

圖1 對蛋白質結構穩定性起重要作用的長程相互作用Fig.1 Typical long-range interactions critical to the stability of protein structures.

蛋白質結構中還常常含有金屬離子結合位點，一類是功能性金屬結合位點，與蛋白質的功能相關，沒有金屬離子存在時蛋白質仍然可保持穩定結構13；而另有一類是維持蛋白質結構穩定的結構性金屬結合位點，比如鋅指結構14。在典型的鋅指結構中，鋅離子和蛋白質中的多個組氨酸中的氮或半胱氨酸中的硫通過配位鍵結合，穩定并保持局部二級結構的相對位置(見圖1e)。

在沒有以上這些強長程作用或特征性的協同作用存在下，蛋白質二級結構之間堆積而形成的眾多非鍵相互作用，也可以起到一定的互相支撐穩定作用。比如RNase A中N端的α螺旋和其余部分的相互作用。RNase A甚至可以切開成一個前20個氨基酸組成的S肽和一個剩余104個氨基酸組成的S蛋白(包含4對正確的二硫鍵)兩個獨立的片段(見圖1f)。這兩個片段單獨存在時都不能形成穩定的天然結構，但當他們結合后(也被稱為核糖核酸酶S)具有RNase A的結構和功能15。而且即使再去掉S肽C端的5個氨基酸，仍然可以形成RNase A的結構和功能16。從這些實驗事實我們可以得出，長程作用不需要來自同一條肽鏈，兩條獨立的肽鏈組合也可以形成和一條長鏈一樣的結構。事實上，蛋白質和其他分子(輔基、抑制劑等)的結合也可以起到穩定蛋白質結構的作用，這些分子其實也相當于提供了一些“長程作用”。

另外，還存在一些沒有典型特性、相對較弱的長程作用，他們雖然對蛋白質結構的整體穩定性影響不大，但在調節蛋白質的構象變化和活性方面發揮關鍵的作用。例如，多次跨膜的膜蛋白跨膜區為胞內外的區域提供一定的限域作用，膜蛋白與受體結合后，通過跨膜區帶動胞內外區構象變化的聯動。

通過以上分析可以看出，蛋白質中的長程作用或蛋白質語言其實有一定的規律可循。大量突變實驗還表明，蛋白質序列具有一定的容錯率，除了少數位置之外的單點突變一般并不改變蛋白質結構和功能；某些蛋白質中部分片段甚至可以被整體刪除，而不影響其余部分的結構和功能。

2.3 蛋白質折疊過程

蛋白質在遇強酸、強堿、高溫或低溫、變性劑等條件下都可能失活變性17。雞蛋煮熟后凝固就是因為蛋白質變性。蛋白質折疊是蛋白質變性的逆過程，因此蛋白質折疊問題也被稱為使煮熟的雞蛋重新變成生雞蛋。我國科學家吳憲早在1929年就在第13屆國際生理學會上提出蛋白質變性學說，并于1931年正式提出，蛋白質變性是肽鏈的構象變化而非共價鍵變化18。Anfinsen與合作者于上個世紀50年代末到60年代完成了RNase A的氧化還原折疊的經典實驗，發現還原態RNase A在除去還原劑和變性劑后能夠自動氧化恢復活性1。在此基礎上，Anfinsen提出了蛋白質的天然結構是其熱力學最穩態的假說19,20。

熱力學并不是蛋白質折疊問題的全部。蛋白質怎樣從一維鏈折疊成三維結構的動力學過程更是困擾科學家的一大難題。Levinthal于上世紀60年代末提出了被稱為Levinthal’s paradox的著名思想實驗，指出蛋白質不可能遍歷其天文數字的構象空間，因此蛋白質折疊一定存在折疊路徑(折疊中間體)，蛋白質局部結構的形成可能是折疊的起始21。在此后的數十年里，蛋白質的體外折疊動力學實驗研究一直是個熱點領域22-25。蛋白質折疊實驗發現了一些規律。比如，同源蛋白質的折疊動力學過程具有相似性26，這顯然是與進化相關的；另外，我們發現蛋白質的折疊動力學常數與熱力學穩定性之間存在一定的線性關系27。

關于蛋白質折疊過程中早期構象的形成機制主要存在兩種比較有影響的理論模型。一種是框架模型(Framework model)28-30，該模型認為蛋白質首先形成部分二級結構，三級結構隨后慢慢形成；另一種是疏水坍塌(Hydrophobic collapse model)模型31,32，該模型認為蛋白質折疊始于疏水作用引起的松散變性蛋白質鏈坍塌成為緊密的熔球態(Molten globule state)33。這兩種模型觀點明顯不同，各有實驗證據支持34,35，至今仍有大量相關研究36。

對蛋白質體內折疊的研究是近年來的另一個熱點。和體外折疊不同，體內折疊從新生肽鏈合成出來就已開始，并有大量的折疊輔助分子，比如二硫鍵異構酶，脯氨酸順反異構酶，分子伴侶等37。

蛋白質折疊研究另一個熱門方向是計算機模擬，包括應用一些簡化的晶格模型模擬蛋白質的折疊過程38，或通過分子動力學模擬計算真實蛋白質的折疊過程39。而在理論研究基礎上提出的折疊漏斗(Folding Funnel)是對蛋白質折疊過程中自由能變化的一個比較形象的定性描述40,41。

3 蛋白質片段的嫁接

雖然蛋白質中的片段作為獨立的多肽時常常是沒有結構和活性的，但實驗發現，一些蛋白質中的片段可以嫁接到另一個完全不同的蛋白質骨架上，并保持其原來的結構和功能。最典型的例子就是蛋白質的環區嫁接。比如，RNase A和血管生成素Angiogenin各有一個環區，如果將RNase A的環區嫁接到Angiogenin的環區位置，得到的新蛋白質則具有RNase A的活性42；反之，把Angiogenin的環區嫁接到RNase A的環區位置，得到新蛋白質則具有Angiogenin的活性(見圖2a，b)43。同樣，抗體中的CDR環區也可以嫁接到其他骨架上，使得到的新蛋白質具有和原抗體一樣的抗原識別功能44。近年來，蛋白質環區的嫁接已經成為蛋白質工程的一個重要手段，而常用來嫁接環區的骨架蛋白(包括β-barrel，Helix-bundle，Kunitz結構域，Knottins等)都具有特別穩定的長程作用45,46。

圖2 蛋白質片段嫁接到不同骨架上Fig.2 Protein fragments grafting onto different scaffolds.

如果說，將一個蛋白質的片段嫁接到另一個蛋白質骨架上后，仍然存在蛋白質“上下文”影響的話，那么我們最近將天然抗體的CDR環區嫁接到金納米粒子表面制成人工納米抗體的工作則明確否定了蛋白質序列“上下文”存在的必要性(見圖2c，d)4。

蛋白質環區在金納米粒子上嫁接成功表明，環區片段自身要保持其天然構象，只需要確定其跨度的長程作用，即只要保持環區兩端的距離和在原蛋白質中的距離相同，這段環區片段就可以自動折疊成和原蛋白質中一樣的片段結構，并具有和原來一樣的功能。也就是說，蛋白質局部片段的結構只受極少數的長程作用影響，蛋白質序列中大多數遠距離氨基酸對局部結構的影響都很小?；谶@一實驗事實，我們提出了蛋白質結構的“限域下最低能量結構片段”假說。

4 “限域下最低能量結構片段”假說

我們金抗體工作清楚地表明，蛋白質完整序列的“上下文”對局部片段的結構并不是必須的。以我們嫁接的抗體CDR片段為例，完整序列“上下文”的長程作用僅僅和金納米粒子上提供的兩個錨點的限域作用相當。因此，可以認為，只要對這個片段給一個和天然蛋白質中相同的限域作用，它就會自動折疊成其天然構象。換一句話說，蛋白質中局部片段的天然構象是在少數強長程作用限域下的熱力學最穩態；而整個蛋白質結構可以看做是由少量限域位點分隔成的多個“限域結構穩定片段”拼合而成。

蛋白質結構中可以充當這些限域位點的就是前面討論的強長程作用力，包括二硫鍵、疏水中心、結構性金屬結合位點、多股的β折疊片層以及亮氨酸拉鏈結構等由多個氨基酸協同組成的結構單元。在正常生理條件下，這些強長程相互作用一般難以被蛋白質分子常溫下的熱運動破壞，為蛋白質局部片段提供了穩定的限域作用。

在沒有長程作用力存在的條件下，片段的局部結構的穩定力主要來自相鄰氨基酸的空間位阻限制和少量鏈內氫鍵(主要存在于α螺旋和部分轉角等)。這些作用力通常比較弱，雖然可以使其天然構象比其他巨大數目構象的平均出現概率高出若干倍，但由于肽鏈巨大的構象空間，這些天然構象出現的幾率仍然極低，所以大多數片段在獨立存在時沒有穩定的結構。而自由多肽片段的構象空間可能存在多個局部能量極小，一旦長程限域作用將其限定在某個極小附近，則這個極小就變成了在這一限域作用下的最小。這就是相同的多肽片段可以在不同蛋白質中(不同限域作用下)存在不同天然結構的原因。

蛋白質結構由一些長程強相互作用位點分隔成多個“限域結構穩定片段”，大大簡化了蛋白質的折疊過程，并解決了Levinthal’s paradox。因為各個“限域結構穩定片段”可以相對獨立地折疊，將極大地減少蛋白質折疊的構象空間。因而，蛋白質折疊過程中的一個關鍵事件是形成正確的限域位點。這也是為什么在很多蛋白質的折疊過程中，快速的疏水坍塌常常是折疊的第一步。在折疊過程中，一旦形成了天然的限域作用，則多肽片段可以沿著光滑的勢能面，快速折疊到限域下的能量最低態。如果在折疊過程中形成了非天然的強長程作用，則往往會使蛋白質陷于錯誤的局部勢阱，形成錯誤折疊中間體；而跳出這個局部勢阱則是一個慢速過程。同樣，對含有多個二硫鍵的蛋白質來說，在二硫鍵被還原后的氧化再折疊過程中，形成天然的正確二硫鍵配對是折疊成正確結構的先決條件。只要保持正確的二硫鍵，其天然構象的形成往往是一個快速的自動折疊過程(當然也可能會存在X-Pro的順反異構等局部范圍內的慢速步驟22)。

正確的天然限域位點的形成和局部片段形成最低能量結構的傾向性是相輔相成的。正確限域位點的形成為局部片段提供限域作用，特別是通過熵效應限制局部片段的構象空間(排除形成大量無規結構的可能性)，提高局部結構的穩定性。而局部片段形成最低能量結構的傾向性也有助于形成正確的限域位點。比如，Scheraga與合作者發現47，一段來源于RNase A的包含三個半胱氨酸的多肽片段在體外形成不同二硫鍵配對時，其中對應于RNase A中正確配對方式的組分所占比例比隨機比例高很多，說明局部結構對形成正確配對是有很大幫助的。這一實驗結果也非常符合我們提出的“限域下最低能量結構片段”假說。一般來說，天然的(進化來的)局部結構具有焓的優勢，為形成正確限域位點提供驅動力；而正確的限域位點則為穩定局部天然結構提供有利的熵效應。這也很好地解釋了蛋白質折疊的框架模型和疏水坍塌模型之間的矛盾。折疊符合框架模型的蛋白質的結構片段可能具有更大的局部結構的焓效應優勢，而符合疏水坍塌模型的蛋白質結構可能更依賴長程作用力提供的熵效應。

由一個個“限域下最低能量結構片段”拼合起來的完整蛋白質并不保證整體的蛋白質處于熱力學最低能量狀態。也就是說，Anfinsen的熱力學假說并不一定正確。事實上，實驗發現部分蛋白質的天然活性結構是熱力學亞穩態，還存在更穩定的非活性結構48,49。還有一些蛋白質在天然狀態下是沒有固定結構的，只有和其他蛋白質結合后才有結構和功能50。這一類現象可以很好地用“限域下最低能量結構片段”假說解釋，因為這些蛋白質在活性的亞穩態和非活性的穩態之間的變化對應于不同的限域作用。從嚴格意義上講，幾乎所有的單個蛋白質分子的天然結構都不能算是整個系統的熱力學最穩態，因為蛋白質分子都有形成纖維化聚集的傾向51,52，而纖維化聚集則可能是比單個蛋白質分子天然結構更穩定的狀態。以“限域下最低能量結構片段”假說的觀點來看，纖維化聚集是因為纖維種子為蛋白質鏈提供了一個更穩定的，涉及大多數氨基酸的限域作用。

“限域下最低能量結構片段”假說還可以解釋分子伴侶幫助蛋白質折疊的機制。分子伴侶通過和蛋白質折疊的錯誤中間體(形成了非天然的長程作用)結合，從而為其提供新的限域作用，讓錯誤折疊的局部片段重新折疊(在新限域作用下，折疊到新的局部能量最低態)。這也從另一個角度說明，蛋白質折疊的長程作用不一定要在同一條鏈上，分子伴侶就是一種外部的影響蛋白質局部結構的作用力。幫助蛋白質折疊的各種異構酶的作用機制同樣如此。另外，對蛋白質結構限域作用還表現在蛋白質與其他分子的相互作用中，包括配體受體結合，膜蛋白的跨膜區在細胞膜上的錨定作用等。

根據量子力學原理，蛋白質鏈上的所有原子都是同一個分子的一部分，理論上所有的原子都對其他原子的結構有影響。實際上，即使是分子量比蛋白質小得多的多原子分子，其薛定諤方程都是無法精確求解的，更不用說分子量在數萬到數百萬道爾頓范圍的蛋白質分子了。所以，采取一定的近似來求解是唯一可行的出路?！跋抻蛳伦畹湍芰拷Y構片段”假說可以看作是這樣的近似處理手段，即只考慮強長程作用，這樣就相當于把大分子的蛋白質化為多個小分子量的多肽，為通過計算預測和設計蛋白質結構提供了新的思路。當然，這樣做的前提是要先正確地確定或預測出蛋白質中的關鍵強長程作用位點。在此基礎上，長鏈蛋白質結構的計算，可以分解為多個短肽的結構計算，從而極大地減少計算量。

蛋白質中的關鍵強長程作用位點對穩定蛋白質結構至關重要，所以這些位點一般是進化保守位點，突變除去這些位點(比如半胱氨酸突變以去除二硫鍵)將極大地降低蛋白質的穩定性。相反，增強合理的長程作用則可以提高蛋白質結構的穩定性，比如可以通過突變或定向進化增加蛋白質(酶)的穩定性。而用納米材料包裹蛋白質同樣也可以將蛋白質的部分氨基酸殘基固定在天然結構中的正確的相對位置上。這相當于給蛋白質增加了強長程作用位點，可以極大地提高被包裹蛋白質的穩定性53-60。大量的納米包裹提高蛋白質穩定性的實例從另一個角度證明了“限域下最低能量結構片段”假說的合理性。

5 蛋白質進化的“石器時代”

按照大爆炸理論，宇宙誕生時是沒有生命的。生命只能是在星球產生之后，慢慢從小分子逐步進化而來。地球上最早的生命可以追溯到35億年以前的太古宙時期61，而有機分子可能早在40億年以前冥古宙時期就已經出現。

從有機分子自然進化出生命是宇宙中的一個奇跡。而核酸和蛋白質是對生命最重要的兩種生物大分子，他們的形成和進化顯然對生命的出現至關重要。原始的生命形式或“半生命”形式到底以哪一種物質為主，目前有不同的觀點。其中，RNA世界的理論是一個比較熱門的理論62，但存在重大缺陷。進化的一個基本觀點和立足點是逐步完善而不是推倒重來。目前地球上的所有已知生命中的主要功能執行者是蛋白質，不同的氨基酸組合成多肽的序列和結構的多樣性也是RNA和DNA不能比擬的，只有這種多樣性才能保證功能的多樣性，復雜的生命才可能從中產生。盡管部分RNA也可能具有某種催化酶的功能，完全由RNA行使功能的簡單生命體即使不是沒有存在過，也至少不是在地球目前生命系統的進化線路當中的。因為如果先有了以RNA為主的生命系統，再由RNA轉錄到對應的多肽序列雖然很容易，但這樣得到的多肽幾乎是不可能折疊成穩定結構的。而如果先進化出穩定結構和功能的蛋白質，和它對應的RNA或DNA序列是肯定可以存在的。因此蛋白質必然是獨立進化的，而不是由RNA轉錄出來的。其原因可以用一句話概況：RNA不懂蛋白質折疊！所以在進化或協同進化中，只可能是蛋白質獨立進化并選擇RNA或DNA作為信息儲存介質；而不可能是先存在一個RNA(或DNA)世界，再由RNA(或DNA)指導蛋白質的合成。

Miller的經典實驗表明63，在模擬的原始地球大氣環境條件下，自然界可以合成出多種氨基酸。事實上，原始地球上出現的氨基酸種類可能遠遠多于現存生物中的氨基酸種類。而氨基酸之間通過肽鍵連接就得到多肽。但從小肽變成可折疊的蛋白質就困難得多。最大的困難在于，在不同氨基酸隨機組合得到的天文數字的不同序列中，只有極其少量的序列能夠折疊成穩定的結構。因而蛋白質幾乎不可能從隨機長鏈多肽庫中直接進化出來。因為即使按原始氨基酸只有20種計，鏈長100個氨基酸的隨機多肽庫具有20100種不同序列，即使每種序列只合成一條多肽鏈，所需要物質的質量也比整個宇宙的質量都多得多。因此蛋白質必須是分階段一步步進化出來的，這就要求有一個具有相對穩定結構和功能的短肽階段，而這又與極大多數短肽都沒有穩定結構的事實相矛盾。

基于我們金抗體工作和前面提出的“限域下最低能量結構片段”假說，我們認為，在蛋白質進化的早期可能存在一個“石器時代”。在這一時期，獨立時沒有穩定結構和功能的短肽可以通過固定在各種表界面上(比如“石頭”(各種巖石或原始湯中的微粒甚至納米顆粒)、微乳囊泡等，而且某些巖石還可能對氨基酸和多肽的合成起到催化作用)，依靠表界面的限域作用而獲得穩定的結構和功能。即，首先進化出蛋白質的片段(“限域下最低能量結構片段”)，但這些片段不是獨立存在的。從某種意義上，“石器時代”的蛋白質相當于半無機半有機的雜合蛋白質；而在下一步進化中，這些短肽可以逐步進化變長，同時也可以通過依附在同一界面上的多個“限域下最低能量結構片段”的組合形成具有更復雜結構和功能的雜合蛋白；在最后階段，長鏈蛋白質脫離依附的介質，走出“石器時代”(如圖3所示)。

圖3 蛋白質進化史前的石器時代Fig.3 “Stone Age” of the prebiotic evolution of proteins.

原始地球含硫的氣氛(H2S，SO2等)使得合成含巰基的氨基酸(比如半胱氨酸)是非?？赡艿?。事實上，運用現代分析技術重新分析Miller加入H2S后的模擬原始地球環境實驗的樣品，發現存在多種含硫氨基酸64。而單質金是自然界天然存在的一種“石頭”。所以含巰基的氨基酸可以以Au―S鍵(鍵能約為125 kJ·mol-1)與金表面結合。也就是說，在原始地球上，以金抗體類似的形成短肽-金(或者其他表界面)形式的具有穩定結構和蛋白質功能的雜合蛋白質是可能的。另外，由于二硫鍵的鍵能(約為250 kJ·mol-1)與兩個Au―S鍵的鍵能相當，使得在同一個金表面的多個多肽片段在一定條件下形成二硫鍵而脫離金表面成為可能，從而進一步進化出獨立的具有結構和功能的原始蛋白質。

另外，蛋白質結構的一個特征是存在相對獨立的結構域。盡管單個蛋白質分子可以非常大，但單個結構域的大小存在一個上限。一般認為，結構域存在上限是因為受折疊動力學限制。而從“限域下最低能量結構片段”假說來看，結構域存在上限是因為片段拼合的原因，即，從進化上講有用的結構片段不應該被拼合在蛋白質結構內部。這個解釋顯然更合理?；蛘哒f，蛋白質結構域大小上限的存在從一個側面證明了“限域下最低能量結構片段”假說和蛋白質進化的“石器時代”的合理性。

6 展望

蛋白質結構和折疊問題已經被研究了近一個世紀，距離揭開最終的秘密可能就差捅破一層窗戶紙?！跋抻蛳伦畹湍芰拷Y構片段”假說是否就是蛋白質結構的最終秘密有待進一步的驗證。目前來看，這一假說能夠很好地解釋已有的實驗現象，并可以推出合理的蛋白質早期進化假說。

一個成功的理論和假說不僅要解釋已有的現象，還需要做出合理的可以檢驗的預測。根據“限域下最低能量結構片段”假說，眾多的天然蛋白質應該可以進行解剖和剪輯。除了天然蛋白質之間互換骨架和片段的剪接外，利用其它非蛋白質骨架，比如納米粒子，也可以合成更多非肽-肽雜合蛋白質。我們最近的探索表明，除了環區外，蛋白質其他的結構片段也可以嫁接到金納米粒子表面，并可以重建原蛋白的局部結構和功能；而且除了金納米粒子外，其他納米粒子、脂質體以及細胞膜等都可以用來重構蛋白質片段的結構和功能。

按照上面提出的蛋白質進化路線，在進化早期，多種不同的多肽片段可以在界面上聚集而協同完成一個更復雜的功能。盡管無法追蹤這一進化事件，但現在同樣可以將不同片段嫁接到同一個納米粒子上，使他們協同完成一個更高級的功能，包括多重特異性，識別與催化的結合等。自然界的進化是在沒有人的干預下緩慢地進行的，而人工干預可以有目的地(定向)加快進化過程。同樣，自然進化不可能出現的結構也可以通過全新設計得到，比如，既具有天然蛋白質的功能，又具有無機材料穩定性的納米-多肽雜合人造蛋白質。我們的初步探索結果表明這些都是可以實現的。