微生物levan果聚糖 及其益生功能研究進展

姜 靜,劉麗娜,張 鑫,趙 丹,*

(1.黑龍江大學生命科學學院微生物省高校重點實驗室,黑龍江哈爾濱 150080; 2.黑龍江大學農業微生物技術教育部工程研究中心,黑龍江哈爾濱 150500)

自然界中普遍存在兩種果聚糖,一類是levan果聚糖,它是一種從植物或微生物中提取的天然高分子多糖聚合物,主要以β-(2,6)糖苷鍵作為主鏈、少量β-(2,1)糖苷鍵作為支鏈[1]。另一類是菊粉(Inulin)果聚糖,由多個果糖分子通過β-(2,1)糖苷鍵連接成(圖1)。果聚糖由廣泛的微生物作為胞外多糖(Extracellular polysaccharide,EPS)和有限的植物物種作為非結構性存儲碳水化合物產生的。在微生物中,這些聚合物既有助于EPS基質的形成,還有助于微生物生物膜的形成[2-3]。

圖1 果聚糖的分子結構Fig.1 Structures of fructans:(A)levan[6],(B)inulin

由于levan果聚糖能夠對一些腸道內有益宿主健康的微生物起到選擇性刺激或促進的作用,因此對宿主健康有益[4]。Levan果聚糖具有生物相容性、生物降解性、可再生性、抗氧化、抗炎、抗癌、高血糖抑制劑等生物活性和生理功能[5],因而被認為是一種益生素,使levan果聚糖成為具有競爭力的商業合成聚合物替代品。除此之外,levan果聚糖的主干結構使其成為良好保健品配方的優選成分,在安全性上更可靠。Levan果聚糖多樣的益生功能使其在生物醫學、工業、食品和制藥等領域的開發利用擁有巨大的潛力。

1 Levan果聚糖的性質和生物合成

1.1 Levan果聚糖的性質

Levan果聚糖是一種由d-果糖-呋喃糖基殘基組成的天然、具有功能性和生物活性的分子,在核心和支鏈上分別以β-(2,6)鍵和β-(2,1)鍵進行連接,并在鏈末端帶有d-葡萄糖基殘基[7-8]。生物體可以依靠不同的底物產生具有結構相似的levan,但是重復單元的聚合和分支的程度各不相同。來自唾液鏈球菌(Streptococcussalivarius)的levan分支度為10%,多粘芽孢桿菌(Bacilluspolymixa)為12%,而產果聚糖氣桿菌(Aerobacterlevanicum)為9%[9]。腸桿菌(Brenneriasp.)利用果聚糖蔗糖酶(Levansucrase,EC 2.4.1.10)合成的levan平均分子量高達1.41×108Da,而在其中沒有檢測出果糖單體的分支摩爾分數,表明它僅由β-(2,6)d-果糖-呋喃糖基重復單元組成[6],與嗜鹽單胞菌(Halomonassp.)產生的線性果聚糖相似[10]。除此之外,levan由于具有β-(2,6)鍵,使得levan既溶于水又溶于油,但不溶于大多數有機溶劑。Levan的性質與其他聚合物存在較大的差異,levan在水中不會溶脹,從而能夠形成水膠體[11],使其在面包的烘焙中得到廣泛的應用,改變了面團的粘度和彈性,進而改善了面包的體積和面包屑質地[12]。

Levan具有較低的特性粘度,表觀粘度可影響levan的流變學特性。此前的研究發現,分子量在1600～2400 Da之間的levan在水中的固有粘度為0.07～0.18 dL/g[13],當處于約3%低濃度的levan水溶液中,Brenneriasp.、運動發酵單胞菌(Zymomonasmobilis)和草生歐文氏菌(Erwiniaherbicola)呈現牛頓行為。而當處于約6%～12%高濃度levan的水溶液時,表現出非牛頓特性。在1%～8%濃度的levan溶液中,枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)顯示完全牛頓行為[9],其原因在于不同的levan支鏈、聚合物分子量或粒子間相互作用可能導致不同的流變行為。此外,levan的剪切變稀特性在生產乳制品、食用糖漿等食品工業中可發揮巨大的作用[14]。

1.2 Levan果聚糖的生物合成

Levan廣泛存在于細菌中,在一些植物、酵母、真菌中也同樣存在,其生物合成通常由levansucrase進行催化[15]。Levansucrase的生物合成發生在細胞內,在細胞周質空間積累,然后通過信號肽裂解及蛋白折疊(革蘭氏陽性細菌,G+)或通過信號肽途徑自身啟動的機制(革蘭氏陽性細菌,G-)從細胞中排泄到周圍環境[16-17]。

Levansucrase可以催化三種反應:水解、轉糖基和聚合,蔗糖在其中既可充當唯一底物同時還可充當果糖基受體和果糖基供體[18]。在微生物中,Levansucrase催化合成levan,實際上是一個將己糖基從供體分子轉移到受體分子的過程,單個呋喃果糖基單元被添加到生長levan多糖鏈的非還原性果糖末端的C6羥基上[19]。如圖2所示,果糖基供體(通常是蔗糖分子的水解反應)中糖苷鍵斷裂的同時,酶的親核基團羰基進攻蔗糖的異頭碳導致共價果糖基-酶中間體的形成和葡萄糖的部分釋放。隨后,果糖基部分從酶轉移至受體分子,果糖-受體分子生長成levan多糖鏈,levansucrase發生聚合反應,不斷向生長中的levan多糖鏈中添加果糖亞基,完成levan的合成。當水分子作為果糖基中間體的受體時,發生水解反應,果糖被釋放到反應介質中;當葡萄糖作為果糖基中間體的受體時,發生蔗糖的置換;受體為乳糖時發生低聚乳果糖的合成反應;當受體為levan時則發生多糖聚合反應[20-21]。

圖2 Levan的生物合成Fig.2 Biosynthesis of levan注:Glc,葡萄糖;Fru,果糖。

對于levansucrase是如何通過果糖基中間體來合成levan,其生物合成轉化的機制和結構基礎仍然不清楚。一般認為低分子量(Low molecular weight,LMW)的levan分子量在80～50000 Da左右,而高分子量(High molecular weight,HMW)的levan則分子量為>50000 Da。在LMW或HMW產物的合成過程中,可能涉及酶的非保守區域的過程伸長或非過程伸長機制[22]。2018年,Carbajal等[23]以蔗糖以及內在不同反應固有受體作為底物,探究B.subtilislevansucrase合成LMW levan的非過程延伸的傳遞反應網絡。如圖3所示,早期階段先開始形成1-蔗果三糖(1-kestose)、6-蔗果三糖(6-kestose)和新-蔗果三糖(neo-kestose),它們是轉果糖基化的第一個產物,隨后6-kestose和1-kestose延伸到相應的levan系列,neo-kestose積累,只用于合成6-新-蔗果四糖(6-neo-nystose)。當葡萄糖和果糖達到足夠的濃度后成為果糖基受體,隨即產生ercose、菊粉二糖(inulobiose)、blastose和果聚二糖(levanbiose)。最后,在蔗糖消耗階段,初級中間產物neo-kestose和6-neo-nystose作為果糖基殘基的供體,產生blasto-FOS,增加了這些次級中間產物的濃度。因此,低分子量levan為一組果糖低聚糖(Fructooligosaccharide,FOS)系列,不同階段受不同引發劑延伸而成,且在反應的不同階段受不同受體的調節。與之相似,2019年,Elena等[24]在探究來自B.subtilis和巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)在合成LMW levan過程中,發現溶液中的levan結構對其形成具有很大的影響。

圖3 B. subtilis levansucrase合成低分子量levan的中間體/產物和果糖基化/水解反應圖Fig.3 Diagram of the intermediates/products and fructosylation/hydrolysis reactions inherent to the B. subtilis levansucrase non-processive mechanism for LMW levan synthesis注:sucrose,蔗糖;Glucose,葡萄糖;Fructose,果糖;1-kestose,1-蔗果三糖;6-kestose,6-蔗果三糖; neo-kestose,新-蔗果三糖;levanbiose,果聚二糖;inulobiose,菊粉二糖;1,6-nystose,1,6-真菌四糖;6,6-nystose,6,6-真菌四糖;6-neo-nystose,6-新-真菌四糖。

2 微生物levan果聚糖的益生功能

2.1 促進益生菌的增殖

益生元是食品工業中有益的功能性成分，原因在于其可被益生菌所發酵，促進益生菌的生長，從而對宿主產生有益作用[25-26]。長期以來,益生元的作用主要與促進雙歧桿菌(Bifidobacterium)和乳酸菌(Lactic acid bacteria,LAB)的生長有關。文獻資料表明,這兩種細菌均可利用levan進行生長[27]。從這方面來看,levan被認為是潛在促進益生菌生長的候選組分。Adamberg等[28]探究了由丁香假單胞菌(Pseudomonassyringaepv.)生產的levan對糞便細菌群的動態調節作用,發現levan可以作為胃腸道微生物群的選擇性生長基質,并且levan的加入明顯促進了糞便微生物群中擬桿菌(Bacteroides)、大腸桿菌(Escherichiacoli)、鏈球菌(Streptococcus)和糞小桿菌(Faecalibacterium)的生長。Franck等[26]發現舊金山乳桿菌(Lactobacillussanfranciscensis)產生的高分子量levan,可以促進Bifidobacterium的生長。除此之外,levan在肉雞的飼糧中,能夠使肉雞后期的生長性能得到改善、盲腸LAB和Bifidobacterium的濃度升高以及盲腸E.coli和產氣莢膜梭菌(Clostridiumperfringens)的濃度降低[29]。Levan是FOS的一種前體物,levan酸水解后可以轉化為FOS,從而刺激內源性Bifidobacterium的生長,進而顯著調節結腸微生物群[30]。同樣,Guolin等[31]以及Dom等[27]觀察到,通過levan的酸水解得到的levan型FOS可以被不同的Bifidobacterium代謝,從而進一步展示了levan的益生潛能。

2.2 抑制有害菌的生長

2.2.1 抑制食源性致病菌及抗病毒活性 Levan能夠抑制食源性致病菌及抗病毒。Bo等[32]首次提出levan對食源性致病菌具有廣譜抗菌作用的觀點,并且發現levan分子量不同,呈現不同的抗菌特性。測試的腐敗菌和致病菌包括B.subtilis、蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、單核細胞增生李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)、大腸桿菌O157∶H7(E.coliO157∶H7)、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimurium)、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)和產氣腸桿菌(Enterobacteraerogenes)。測試結果表明:低分子量levan對所有測試的致病菌和腐敗菌具有強烈的抑制作用。而高分子量levan,除了B.subtilis、S.typhimurium和E.aerogenes外,能夠有效地抑制大多數測試的腐敗和致病細菌的生長。類似地,Abid等[33]發現來自特基拉芽孢桿菌(Bacillustequilensis)的levan對E.coli、糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)和L.monocytogenes均有抑制作用,其中對E.coli抑制效果最強。同時,levan還能夠破壞預形成的致病菌生物膜,并且增加levan濃度,膜的破壞活性也隨之加強。除此之外,levan還具有抗病毒活性,Esawy等[34]從不同來源的蜂蜜中分離出M、K、A、C、E和G 6株芽孢桿菌(Bacillussp),發現K、M、E株產生的levan對致病性禽流感呼吸道病毒(HPAI、H5N1)的活性具有明顯的抑制作用,甚至可以滅活,而A、M株產生的levan對腸道病毒(腺病毒40型)的活性具有抑制作用。

2.2.2 Levan的粘附作用 EPS可以作為一種粘附因子,能夠幫助LAB在腸道黏膜上定殖[35],從而對人體腸道環境有一定的修復,促進其消化吸收等[36]。最近研究發現,EPS的代謝物levan可以作為產腸毒素大腸桿菌(EnterotoxigenicE.coli,ETEC)的抗粘附劑。ETEC的致病過程通常分兩步:粘附素的定殖過程和腸毒素的致病過程[37]。ETEC通過表面定殖因子附著在腸上皮細胞上發生定殖,隨即產生腸毒素破壞腸液的穩態,進而引起腹瀉[38]?；谶@種感染機制,ETEC與宿主細胞的粘附被認為是感染過程中的一個重要步驟[39]。而levan作為ETEC的抗粘附劑,其機理為:通過EPS緊密黏附在ETEC細胞上而阻斷ETEC粘附素與宿主受體相互作用,從而對ETEC引起的腹瀉起到明顯的治療作用。來源于解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)的levan抗黏附活性與分子量及分支程度相關聯,levan分子量高分支程度低,與抗黏附活性呈負相關,因此levan展現出可作為一種預防腹瀉的抗凝劑的潛力[31]。

2.3 激活免疫因子

隨著功能性多糖對人體健康益處被不斷闡明,多糖和多糖蛋白復合物因其具有免疫調節和抗癌作用而受到生物化學和醫學領域的廣泛關注,使果糖的研究再次引起了人們的興趣。近年來,研究學者們不斷發現levan具有直接或間接調節免疫系統的功能。Levan對巨噬細胞、B細胞和T細胞都具有免疫調節作用,并且不同來源的levan由于結構的差異而體現不同的免疫調節作用。來源于腸膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)的levan作用于HT-29細胞分別測定了IL-4、IL-10、IL-12和TNF-α誘導水平,發現levan對IL-10、IL-12和TNF-α沒有誘導作用,而對IL-4產生了誘導作用,揭示了IL-4是一種重要的抗炎細胞因子,顯示了levan潛在的免疫調節作用[40]。以博氏擬桿菌(Paenibacillusbovissp.)為原料合成的levan對小鼠脾臟細胞的免疫調節中,發現在測試的細胞因子(IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17A、IFNg和TNF-α)中,只有TNF-α的表達顯著增加,由此通過上調TNF-α表達水平顯示出免疫刺激活性,從而證明levan對小鼠淋巴瘤有抑制作用[41]。從發酵大豆中提取的levan在體外通過TLR4誘導巨噬細胞,產生TNF-α和IL-12 p40活性,并且levan作為一種有效的IL-12誘導劑,可抑制IgE產生的過敏性炎癥。除此之外,當levan通過酸水解分解為單果糖時,levan的免疫刺激能力完全喪失,證明β-(2,6)-果聚糖骨架對levan的免疫調節作用至關重要[42]。

Levan作為一種免疫刺激劑,在魚類的免疫系統中被認為是安全有效的。Levan的作用是通過快速激活非特異性防御機制,保護魚類免受致病病原體的侵害[43]。Dina等[44]對鯉魚幼魚投喂添加levan的飼糧,結果發現添加levan的鯉魚幼魚的紅細胞和血紅蛋白含量顯著增加,除此之外,levan還可以提高鯉魚對嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)腹腔內感染的存活率,相對存活率隨食物中levan濃度的增加而增加,證明levan可以作為鯉魚幼體的膳食免疫刺激劑。與之相似,Huang等[45]研究發現添加levan的飼糧均顯著降低石斑魚腸道中需氧菌和弧菌的存活數量,還刺激了血清總蛋白水平、球蛋白水平和溶菌酶活性,從而使石斑魚的生長性能和抗病性得到有效的提升。

2.4 降低血糖和血脂

自Burkitt和Trowell的膳食纖維假說中提出:膳食纖維在降低心血管疾病、糖尿病等方面具有重要的作用之后[42],人們針對糖以及糖類的不可消化低聚物等膳食纖維開展了大量的研究。Dahech等[46]研究發現地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)產生的levan對四氧嘧啶誘導的糖尿病小鼠具有降血糖的作用。將四氧嘧啶誘導的糖尿病小鼠以口服方式灌服levan后,發現血漿葡萄糖水平明顯下降,糖原水平明顯升高。同時,levan還降低了糖尿病小鼠的肝臟、腎、胰腺和心臟中硫代巴比妥酸反應物質含量,且使超氧化物歧化酶、過氧化氫酶的含量得到提升。此外,糖尿病小鼠的肝臟和腎臟指標毒性,包括堿性磷酸酶、天門冬氨酸轉氨酶和乳酸轉氨酶活性以及總膽紅素、肌酐和尿素水平分別均有所降低?？傮w而言,levan被證實可抑制由糖尿病引起的高血糖,從而對成年小鼠的糖尿病具有有效的預防和治療作用。

Belghith等[47]探究來自B.licheniformis的levan對高膽固醇小鼠的降血脂作用,口服作用于高膽固醇小鼠,測定血漿抗氧化酶和脂質譜,發現顯著增加了小鼠肝組織中過氧化氫酶和超氧化物歧化酶活性,說明levan對總膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇和甘油三酯都有明顯的正向影響。而硫代巴比妥酸濃度、天門冬氨酸轉氨酶、乳酸轉氨酶濃度和總膽紅素活性均發生顯著降低,由此證明levan具有潛在的降血脂和抗氧化作用。

2.5 其他益生功能

Levan可以促進益生菌的增殖、抑制有害菌的生長、激活免疫因子、降血糖及血脂,這些優異性能使levan成為一種多功能聚合物。除此之外,levan還具有抗腫瘤、抗氧化等功能[48],在抗腫瘤活性相關的研究中,發現levan分子量大小和分支程度起決定性因素。Yoo等[49]從產左聚糖微桿菌(Microbacteriumlaevaniformans)中提取的levan對胃細胞瘤(SNU-1)、肝細胞瘤(HepG2)及惡性肉瘤細胞(S180V)等八種腫瘤細胞株均具有一定的抗性。同年,Yoon等采用菊粉酶對M.laevaniformansKCTC 9732進行分支結構的改變,發現分支結構改變后的levan展現出對腫瘤細胞的抗性相對較低[50]。這可能是由于β-葡萄糖醛酸酶活性會隨著levan攝入量的增加而增加,同時levan還降低了盲腸內pH,增加結腸中Bifidobacterium和短鏈脂肪酸的數量,從而促進LAB的生長,使結腸能夠抵擋致癌物的侵襲[21]。

Levan除了在抗腫瘤方面有一定功能外,其在抗氧化方面也具有潛在的作用。據報道,很多不同來源的levan具有抗氧化活性,使其在化妝品及醫藥行業有很強的需求[51-52]。目前大量研究表明,levan的抗氧化能力具有濃度依賴性,濃度越高,抗氧化能力越強。使用DPPH自由基清除法測定來源于木醋桿菌(Acetobacterxylinum)的levan的抗氧化活性,以標準抗氧化劑抗壞血酸為對照,在1 mg/mL相同濃度下,抗壞血酸表現出100%抗氧化活性,而A.xylinumlevan表現出81.26%的抗氧化活性。當A.xylinumlevan濃度為1.25 mg/mL時,表現為100%抗氧化活性[53]。同樣的,采用羥自由基清除法測定了來源于Leu.mesenteroides的levan體外抗氧化活性。實驗表明,在6 mg/mL的濃度下,levan的清除率幾乎達到100%,顯示出作為潛在抗氧化劑的能力[54],從而證實了levan可以作為一種強抗氧化劑用于醫藥和生物醫學應用。

此外,大量文獻證實,levan的磺?；?、乙?；?、硫酸化等衍生物與天然levan相比,具有更高的抗腫瘤能力。Bayoumi等[55]研究發現來自枯草芽孢桿菌硫化的levan具有明顯的抗腫瘤活性。張穎等[56]對來自B.amyloliquefaciens的levan進行乙?；?、磺?；?、硫酸化修飾,結果發現經化學修飾后,levan抗氧化活性以及對宮頸癌細胞(Hela)的抑制活性均有所增加。

3 結語

微生物來源的levan果聚糖具有促進益生菌的增殖、抑制有害菌的生長、激活免疫因子、降血糖及血脂等重要的生物學功能,在食品加工、生物制藥以及化妝品等領域具備極大的市場價值。然而,依舊存在一些問題:首先,levan果聚糖在工業生產上由于有限的生產策略,使其在商業規模的醫療和制藥領域的利用率相對較低。其次,關于levan降膽固醇的報道相對較少,對于其機理的猜想可能是由于類固醇的腸肝循環紊亂所致,然而確切的機制還需要進一步的研究來闡明,為接下來開發關于降膽固醇類藥物提供依據。針對存在的問題,提出以下建議:為了降低成本,提高levan產量,可以從優化培養條件或通過一些生物技術手段來提高levan的產量。除此之外,很多與levan衍生物相關的學術研究,可以考慮從其衍生物角度入手,開發更多的預防及治療藥物,以便將levan更多地用于制藥領域的商業化生產。實際上,據報道levan已經作為抗氧化劑以及抗腫瘤藥物進入市場,但作為醫療制藥領域仍具有更大的潛力。