三種猴頭菇口服液對大鼠胃黏膜損傷的保護作用研究

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(1.廣東輕工職業技術學院食品生物與技術學院,廣東廣州 510300;2.華南理工大學食品科學與工程學院,廣東廣州 510641;3.廣東太陽神集團有限公司,廣東廣州 510665)

猴頭菇亦稱猴頭菌(Hericiumerinaceus(Rull ex F.)Pers.),是一種外形獨特、營養豐富且功效多樣的食用菌資源,是我國珍貴的藥食兼用真菌,又稱猴頭菌、猴頭、猴菇、猴蘑[1-3]。猴頭菇的主要活性成分包括多糖、寡糖、甾醇類、萜類和酚類等,我國傳統醫學認為其性平、味甘、益五臟,具有助消化的作用,現代醫學還發現其具有提高免疫力、抗腫瘤、抗衰老、降血脂等多種保健功能[5-6]。

近些年來,現代食藥工業為猴頭菇的產品化注入了新的活力,例如猴菇米稀、猴菇酥性餅干、猴頭健胃靈膠囊、猴頭菇胃腸保健口服液、猴頭菇口服液以及猴菇飲等[7]。其中,猴頭菇口服液產品的生產由來已久,而且受眾廣泛且不斷推陳出新?？诜寒a品的主要功效包括養胃和中以及輔助保護胃黏膜[8-9],其主要活性成分猴頭菇多糖的生物活性、入藥機理及潛在的應用途徑也被進行了大量研究[10-12]。但是,關于猴頭菇口服液產品之間的功效比較方面研究卻鮮有報道。

本研究以猴頭菇口服液為研究對象,基于大鼠胃黏膜損傷模型評估三種猴頭菇口服液對胃黏膜損傷的保護作用,并對損傷指標的差異進行全面系統的闡述。以期為消費者在此類產品的功效篩選方面提供理論依據,又為科研人員在構建大鼠胃黏膜損傷模型方面提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

猴頭菇口服液A(產品主要原料為猴頭菇,輔料為雞與蛇,提取工藝為高溫水提,多糖含量≥120 mg/100 mL,批號20161021,下文簡稱口服液A)、猴頭菇口服液B(產品主要原料為猴頭菇,輔料為雞,提取工藝為先酶解再高溫水提,多糖含量≥200 mg/100 mL,批號20161021,下文簡稱口服液B) 廣東太陽神集團有限公司提供;猴菇飲口服液 湖北東信藥業有限公司生產,產品主要原料為猴頭菇,國藥準字Z42020182,批號151215,下文簡稱猴菇飲;硫糖鋁 上海旭東海普藥業有限公司生產,國藥準字H10950279,批號KF151007;實驗動物 SD大鼠,SPF級,體重200～230 g,中山大學(大學城)實驗動物中心,實驗動物生產許可證號SCXK(粵)2011-0029;無水乙醇 南京化學試劑股份有限公司;95%乙醇 天津市富宇精細化工有限公司;乙酸(AR級)、氯化鈉、NaH2PO4·2H2O 廣州化學試劑廠;Na2HPO4·12H2O 甲醛天津市福晨化學試劑廠;中性樹膠 廣州市秀威貿易有限公司;TO型生物透明劑 廣西岑溪市松香廠;蘇木素 Fluka上?；瘜W試劑公司;伊紅 Ameresco公司。

BS110S電子天平 北京賽多利斯天平有限公司;ACS-1A1型電子計量秤 深圳愛華衡器有限公司;OLYMPUS SZ61型體視顯微鏡、OLYMPUS CX31型顯微鏡 日本OLYMPUS公司;MICROM HM450電腦程控式切片機 德國MICROM公司;TB-718生物組織自動包埋機、TC-120組織自動脫水機 孝感市泰維電子公司;BI2000圖像處理系統 成都泰盟科技有限公司;DM5000B型正置熒光顯微鏡 德國LEICA公司;全自動菌落分析儀 杭州訊數科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 大鼠急性胃粘膜損傷模型的構建與治療

1.2.1.1 實驗動物分組 選取健康的SD雌性大鼠144只,體重200～230 g,大鼠隨機分成12組,每組12只,分別為正常組,乙醇模型組,口服液A低、中、高劑量組,口服液B低、中、高劑量組,猴菇飲低、中、高劑量組以及硫糖鋁陽性對照組。

1.2.1.2 給藥方案 采用預先給藥的方式。正常組、模型組及陽性對照組的每日給藥劑量相同,不同的是前兩者給予等體積的純凈水,其余組別的給藥劑量見表1;全部樣品均經口灌胃給藥,每日定時給藥1次,其中,硫糖鋁陽性對照組在造模前一周開始給藥(給藥1周),余下各組灌胃給藥30 d。

表1 按體重系數等效換算的給藥劑量Table 1 Equivalent conversion of the dose according to the body weight coefficient

1.2.1.3 大鼠胃黏膜大體形態觀察、組織病理學檢查 在各組大鼠給藥結束后,將大鼠禁食24 h(不禁水)。除正常對照組外,其余各組大鼠灌胃給予無水乙醇,劑量為1 mL/只。1 h后處死動物,暴露完整胃,結扎幽門,灌注適量10%甲醛溶液,固定20 min,然后沿胃大彎剪開,洗凈胃內容物,展開胃粘膜,置于體視顯微鏡下觀察。大體形態觀察完畢后,將每只動物胃粘膜損傷最嚴重的部位切下,固定于10%甲醛溶液,常規制片,蘇木素-伊紅(hematoxylin-eosin staining,HE)染色,脫水,封片,鏡下觀察。

1.2.1.4 急性損傷指標測定 胃黏膜急性損傷指標主要包括胃粘膜充血面積、損傷積分指數、損傷發生率、損傷抑制率以及胃黏膜鏡下積分[13]。

胃粘膜充血面積=出血帶長度×出血帶寬度,評分標準見表2;

表2 急性損傷肉眼觀察評分標準Table 2 Scoring criteria for visual observation of acute injury

損傷總積分=A+B+C×2

式中,A、B、C分別為出血點分值、出血帶長度分值及出血帶寬度分值;

損傷積分指數=某組損傷評分總和/該組動物數量;

損傷發生率(%)=某組出現出血充血的大鼠數量/該組大鼠數量×100;

式中,A、B分別為模型組與實驗組的損傷積分;

胃黏膜鏡下積分:以胃黏膜病變部位為研究對象,選擇胃粘膜正橫切面,包括粘膜全層的區域觀察,評分標準見表3;

表3 急性損傷鏡下觀察評分標準Table 3 Scoring criteria for microscopic observation of acute injury

病變總積分=A+B×2+C×3

式中,A、B、C分別為充血積分、出血積分及上皮細胞變性壞死積分。

1.2.2 大鼠慢性胃粘膜損傷模型的構建與治療

1.2.2.1 實驗動物分組 選取健康的SD雌性大鼠144只,體重200～230 g,檢疫7 d。具體的建模方式如下[14-19]:將全部動物禁食24 h(不禁水),之后用10%水合氯醛麻醉后實施剖腹手術,消毒腹部,于劍突下切開腹腔,將胃輕輕拉出腹腔外,假手術組于胃幽門處漿膜下,采用微量注射器注射50 μL的滅菌生理鹽水,其它組別在同一部位局部注射50 μL的60%乙酸溶液,縫合切口。每只大鼠術后肌內注射青霉素2000 U,且連續抗生素處理3 d,直至傷口完全愈合。術后第2 d,將大鼠隨機分成12組,每組12只,分別為假手術組,乙酸模型組,口服液A低、中、高劑量組,口服液B低、中、高劑量組,猴菇飲低、中、高劑量組以及硫糖鋁陽性對照組。

1.2.2.2 給藥方案 假手術組、模型組及陽性對照組的每日給藥劑量相同,不同的是前兩者給予等體積的純凈水,其余組別的給藥劑量同1.2.1.2,全部樣品均經口灌胃給藥,每日給藥1次,連續給藥7d。

1.2.2.3 胃黏膜大體形態觀察 在各組大鼠給藥結束后,將大鼠禁食24 h(不禁水),之后處死動物,取出整個胃浸泡于10%的甲醛內,浸泡20 min后沿胃小彎剪開,洗凈內容物,取腺胃區展開平鋪于玻璃板上,用紙吸干潰瘍內的水分,置于顯微鏡下觀察。

1.2.2.4 慢性潰瘍指標測定 胃黏膜慢性損傷在體內表現為潰瘍,潰瘍指標主要為潰瘍面積。將洗凈內容物后的不含水分的胃黏膜置于全自動菌落分析儀中觀察并對胃潰瘍組織進行拍照,利用圖像處理系統分析并測量潰瘍底部的面積。

1.3 數據處理

實驗結果以均值±標準差表示。采用SPSS 21.0軟件對數據進行統計學分析,運用student t檢驗評價顯著性水平,P<0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 口服液樣品對大鼠急性胃粘膜損傷的保護作用

2.1.1 口服液樣品對胃黏膜大體形態及病變組織的影響 如圖1所示,正常組大鼠胃黏膜紅潤,無出血點或出血帶;模型組胃黏膜局部腫脹,有清晰可辨的出血帶,充血嚴重;陽性組胃黏膜無明顯的出血帶,局部有輕微的充血現象。此外,在三種口服液處理組中,樣品對胃黏膜形態的保護呈現出典型的量效關系,即同模型組比較,隨著口服液樣品的劑量升高,無水乙醇對大鼠胃黏膜的損傷程度減弱。

圖1 不同組別大鼠的胃黏膜大體形態Fig.1 General morphology of gastric mucosa of rats in different groups

選取大鼠胃黏膜的病變部位,制成組織切片,之后進行HE染色。如圖2所示,正常組大鼠胃黏膜細胞緊實、密集,細胞的藍紫色較深,胃黏膜形態完整、邊界清晰;模型組胃黏膜細胞排列松散、碎片化嚴重,空腔細胞成片聚集,胃黏膜呈現病理性腫脹;陽性組胃黏膜細胞排列較為緊密,局部出現空腔細胞,胃黏膜輕微腫脹且邊界清晰。此外,在三種口服液處理組中,樣品對胃黏膜病理癥狀的緩解呈現出典型的量效關系,即同模型組比較,隨著口服液樣品的劑量升高,無水乙醇對大鼠胃黏膜的病理性損傷減弱。

圖2 不同組別大鼠胃黏膜HE染色(40×)Fig.2 HE staining pictures of gastric mucosa of rats in different groups(40×)

2.1.2 口服液樣品對胃黏膜急性損傷指標的影響 由表4可知,模型組大鼠胃黏膜出血充血嚴重,并且其胃黏膜充血面積、損傷積分指數及胃黏膜鏡下積分等多項損傷指標均偏高;中、高劑量口服液A,高劑量口服液B以及高劑量猴菇飲的損傷積分指數均明顯降低,能夠不同程度地緩解乙醇誘致的大鼠胃粘膜出血充血程度,與同期乙醇模型組相比,具有顯著性差異(相應的P值分別為P<0.05、P<0.01、P<0.001及P<0.01);高劑量口服液A,低、中、高劑量口服液B以及低、中、高劑量猴菇飲的胃粘膜鏡下積分明顯減少,與同期乙醇模型組相比,具有顯著性差異(相應的P值分別為P<0.001、P<0.01、P<0.05、P<0.001、P<0.01、P<0.01及P<0.001);硫糖鋁陽性對照組大鼠的胃粘膜出血情況明顯減輕,并且其損傷積分指數、胃黏膜鏡下積分均明顯降低,與同期乙醇模型組相比,具有顯著性差異(相應的P值分別為P<0.001及P<0.001)。

表4 口服液樣品對大鼠胃黏膜急性損傷指標的影響Table 4 Effects of oral liquid samples on the indexes of acute injury of gastric mucosa in rats

上述結果表明,三種口服液樣品對胃粘膜均具有不同程度的保護作用,這種作用雖然不及臨床使用的陽性藥物,但卻較好地緩解了胃黏膜急性損傷。其中,高劑量口服液B能夠極顯著地降低胃黏膜損傷積分指數及胃黏膜鏡下積分,因此在治療或保護胃黏膜急性損傷方面,口服液B最佳。

2.2 口服液樣品對大鼠慢性胃粘膜損傷的保護作用

2.2.1 口服液樣品對胃黏膜大體形態的影響 在慢性損傷試驗中,不同樣品對大鼠胃黏膜的大體形態的影響如圖3所示。假手術組大鼠胃黏膜色澤鮮麗,無淤青無囊腫;模型組的胃黏膜淤青聚集,出現較大面積的囊腫、潰爛;陽性組的胃黏膜色澤微暗,無明顯的淤青、囊腫。此外,在三種口服液處理組中,樣品對胃黏膜形態的保護呈現出典型的量效關系,即同模型組比較,隨著口服液樣品的劑量升高,乙酸誘導的大鼠胃黏膜的潰瘍程度減弱。

圖3 不同組別大鼠的胃黏膜大體形態Fig.3 General morphology of gastric mucosa of rats in different groups

2.2.2 口服液樣品對胃黏膜慢性潰瘍指標的影響 不同樣品對乙酸誘導的大鼠慢性胃粘膜損傷的保護作用主要體現在對慢性潰瘍指標的影響,實驗數據如表5所示。假手術組大鼠胃粘膜的潰瘍面積幾乎可以忽略,故在實驗中沒有計算出潰瘍面積;乙酸模型組大鼠的胃漿膜層下注射乙酸溶液后發生明顯的潰瘍,其潰瘍面積明顯升高;與同期模型組比較,中、高劑量的口服液A以及高劑量的猴菇飲可以明顯減少大鼠的胃潰瘍面積,具有顯著性差異(相應的P值分別為P<0.01、P<0.001及P<0.05);然而,與同期模型組比較,陽性藥物硫糖鋁并不能夠明顯減少大鼠的胃潰瘍面積,在數值上無統計學差異。上述結果表明,口服液A在治療或保護胃黏膜慢性損傷方面具有良好的效果。

表5 口服液樣品對大鼠胃黏膜慢性潰瘍指標的影響Table 5 Effects of oral liquid samples on the indexes of chronic ulcer of gastric mucosa in rats

3 討論與結論

本文研究了三種不同的猴頭菇口服液對大鼠胃黏膜損傷的保護功效。在大鼠胃黏膜急性損傷模型中,三種口服液樣品能夠不同程度地保護胃粘膜,低濃度的三種樣品對胃黏膜的保護功效差別不大;然而,高濃度樣品的功效差異明顯,其中,口服液B的功效最佳,其療效優于猴菇飲、次于硫糖鋁。在大鼠胃黏膜慢性損傷模型中,口服液A的護胃效果較好,能夠促進慢性胃潰瘍的創傷愈合及修復;猴菇飲的功效次之;口服液B的護胃效果較弱,與同期模型組相比,其僅在胃潰瘍面積的平均值方面有減少的趨勢,但并無統計學意義上的顯著性差異。

文中涉及的動物模型為大鼠胃黏膜損傷模型,其實,關于此類模型的構建并不簡單。急性胃粘膜損傷模型的構建在文獻中屢有報道[20-22],難度相對較低。而慢性胃黏膜損傷模型的構建涉及動物手術,難度偏大且建模成功率較低;具體來講,乙酸誘導大鼠慢性胃粘膜損傷的模型成功與否關鍵在于是否將乙酸溶液完全注射在漿膜層以下[23-24],由于胃壁含有非富的血管,胃組織被乙酸腐蝕后即發生壞死及出血,注射后第二天大鼠出現胃穿孔現象,隨著時間的延長,粘膜層開始修復,包圍底部形成脊形態,同時胃底部肌層逐漸生長并形成疤痕。本文中測量的胃潰瘍面積即是脊(再生粘膜層)的底部,胃潰瘍體積為與脊平齊的注入液體的體積。雖然已有報道探究了猴頭菇口服液對胃上皮細胞的保護作用[25]以及猴頭菇胃腸保健口服液對HAART藥物所致胃腸道反應的療效[26],但是本文的研究內容仍有獨特之處,即在既往研究的基礎上完善了不同猴頭菇口服液產品的護胃功效的評價體系。

綜上所述,本文成功構建了大鼠胃黏膜損傷模型并基于此評估了不同的猴頭菇口服液的護胃功效,但不同產品功效各異。猴菇飲口服液作為非處方藥,效用相對溫和一些,對急、慢性胃黏膜損傷都有溫和的保護作用;猴頭菇口服液B、猴頭菇口服液A分別對急性胃黏膜損傷、慢性胃黏膜損傷有良好的保護作用。使上述產品存在差異的原因可能在于產品配方、提取工藝及多糖濃度,本文的研究結果可為開發具有胃黏膜損傷保護作用的功能食品、保健食品及藥品提供科學的參考價值。