人參低聚肽對老年db/db小鼠血糖及免疫調節的作用

樊 蕊,郝云濤,劉欣然,李 勇

(北京大學公共衛生學院營養與食品衛生學系,北京 100191)

糖尿病(Diabetes)是以高血糖為特征,由體內胰島素分泌絕對或相對不足而引起以糖、脂肪、蛋白質代謝紊亂為主的內分泌疾病。長期糖脂代謝紊亂可引起多系統損害,導致眼、腎、心臟、血管等組織器官的慢性進行性病變、功能減退及衰竭。如今,人口老齡化是全球正在面臨的挑戰,增齡可能是糖尿病發病的一個危險因素,同時糖尿病老年患者更是面臨多種并發癥,因此,預防老年人的糖尿病發生以及改善糖尿病老年患者的生存質量具有重要的意義。

早在1988年,有學者從人參中分離出一個具有胰島素作用的14肽,表明其具有抗脂肪分解,降低血糖和肝糖原的作用[1]。隨后,多項動物實驗研究表明人參肽具有調節血糖血脂的作用,但這些研究涉及的動物模型均為人工造模[2-4],而對于自發糖尿病動物的降糖作用,特別是自發糖尿病老年小鼠的血糖水平和疾病狀態鮮有報道。并且相比于多肽,低聚肽具有吸收快、安全性高、生物活性強的優點[5]。因此,是否可將人參低聚肽用于糖尿病的營養防治具有重要的現實意義。

研究報道,細胞衰老與糖尿病的關系復雜而微妙,糖尿病造成的高糖、炎癥微環境及脂毒性等促使細胞衰老并進一步累積,反之,細胞衰老由于永久性周期停滯直接引起胰島β細胞功能障礙、脂質代謝障礙等細胞功能障礙、通過間接分泌衰老相關分泌表型介導慢性低水平炎癥狀態等,引起糖尿病及其并發癥[6]?？梢?探討老年糖尿病的疾病狀態對提高老年糖尿病患者的生存質量具有重要的作用。

雖然以往研究報道人參肽可以降低過氧化損傷模型大鼠血清脂質氧化產物和蛋白質氧化產物含量,提高其血清抗氧化酶活力[7],并且可以減輕大鼠慢性炎癥[8],但人參低聚肽是否可以通過調節糖尿病老年小鼠的炎癥反應和氧化應激狀態,達到改善血糖的效果并未有所證實。因此,本文對db/db小鼠進行終生喂養,對老年db/db小鼠進行血糖和糖耐量水平的測定,評價其炎癥反應程度和氧化應激狀態,評估人參低聚肽對老年db/db小鼠疾病狀態的改善作用,為改善老年糖尿病患者的生存質量提供有效的膳食營養解決方案。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

人參低聚肽 吉林肽谷生物工程有限責任公司,淡黃色固體粉末,利用生物酶解技術從吉林人參中得到的小分子生物活性肽的混合物。經過高效液相色譜純化后,利用質譜儀分析,混合物中小分子低聚肽的質量分數占95.42%。進一步利用高效液相色譜法分析,可知其游離氨基酸總量占3.94%,氨基酸組成見表1;IL-1β、IL-6、TNF-α試劑盒 北京麥格泰克科技有限公司;GSH-Px、SOD、MDA試劑盒 北京中生北控公司;db/db 型小鼠 北京大學醫學部實驗動物中心提供(實驗動物生產許可證號:SCXK(京)2016-0010),屏障環境動物房(實驗動物使用許可證號:SYXK(京)2016-0041)。

表1 人參低聚肽氨基酸成分表Table 1 The amino acid composition of Ginseng oligopeptide

安穩血糖儀、安穩血糖試紙 三諾公司;352型酶標儀 芬蘭Labsystems Multiskan MS公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗動物及分組 選取10周齡的45只空腹血糖水平≥11.1 mmol/L的db/db雄性小鼠(體重23±2 g),按空腹血糖水平隨機分為3組:老年模型對照組、陽性對照組(鹽酸二甲雙胍腸溶片225 mg/kg·bw)、人參低聚肽干預組(0. 50 g/kg·bw),每組15只。另取10周齡15只db/m雄性小鼠作為正常對照組,待以上小鼠飼養至57周,另取10周齡空腹血糖水平≥11.1 mmol/L db/db雄性小鼠(15只)作為青年模型對照組,各組小鼠繼續飼養,終生干預。整個干預期各組小鼠均給予普通飼料,自由飲食、飲水。同時陽性對照組和人參低聚肽干預組分別予以相應劑量的二甲雙胍和人參低聚肽,每天灌胃1次。飼養實驗室符合國標清潔級,溫度范圍(25±1) ℃,相對濕度50%～60%,室內照明控制在12 h/12 h光暗周期節律。待老年模型組、正常對照組、陽性對照組和人參低聚肽干預組小鼠飼養至70周以后,青年對照組小鼠飼養至23周后,進行空腹血糖、糖耐量指標檢測。老年模型組、正常對照組、陽性對照組和人參低聚肽干預組小鼠飼養至82周,青年對照組小鼠飼養至35周,處死。

1.2.2 指標檢測

1.2.2.1 動物一般狀態觀察及體格指標測定 每周觀測并記錄動物的活動度、毛發光澤、攝食量、飲水量、體質重量。

1.2.2.2 隨機空腹血糖檢測 小鼠飼養至70周后,每隔4周監測隨機空腹血糖,測定前禁食6 h,測定時剪尾取血,采用血糖儀測定及記錄。

1.2.2.3 糖耐量檢測方法 分別將飼養至82周的db/db和db/m小鼠,飼養至35周齡的青年db/db小鼠在測定前一天禁食12 h(自由飲水),禁食結束時灌胃給予葡萄糖溶液(50%質量分數),劑量為4 μg/g·bw,測定給予葡萄糖后0、0.5、1.0、2 h 的血糖值,并計算血糖曲線下面積。

血糖曲線下面積(AUC)=1/2×(0 h 血糖值+0.5 h 血糖值)×0.5+1/2×(0.5 h 血糖值+1 h 血糖值)×0.5+1/2×(1 h 血糖值+2 h 血糖值)×1

1.2.2.4 臟器質量和指數 分別將飼養至82周的db/db和db/m小鼠,飼養至35周齡的db/db小鼠,稱重后脫頸椎處死,無菌快速分離腎周脂肪、睪周脂肪,剝離腓腸肌,稱重;分別稱取小鼠的肝臟、腎臟、脾、胰腺、肺,計算臟器指數/脂肪指數。

臟器/脂肪指數(%)=臟器/脂肪重量(g)/體重(kg)×100

1.2.2.5 血清炎癥指標檢測 分別將飼養至82周的db/db和db/m小鼠,飼養至35周齡的db/db小鼠,摘眼球采血,取血清,按照試劑盒說明書操作,檢測白細胞介素-6(IL-6)、白細胞介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)水平。

1.2.2.6 血清氧化應激指標檢測 分別將飼養至82周的db/db和db/m小鼠,飼養至35周齡的db/db小鼠,摘眼球采血,取血清,按照試劑盒說明書操作,檢測丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)水平。

1.3 數據處理

2 結果與分析

2.1 一般狀態觀察

正常對照組小鼠狀態良好,活動正常,反應靈敏,動作敏捷,毛色有光澤;老年模型對照組、青年模型對照組、以及陽性對照組和人參低聚肽干預組均出現明顯的多飲、多食及多尿癥狀,并且活動量出現不同程度的減少,動作遲緩,被毛不光潔甚至脫毛的現象,但其中人參低聚肽干預組可以明顯的觀察到小鼠的反應和動作速度有一定程度的改善,并且脫毛現象也不及其它各組嚴重。

各組老年小鼠飼養至82周,正常對照組未見死亡,老年模型對照組死亡4只;陽性對照組死亡2只,人參低聚肽干預組死亡1只。

2.2 人參低聚肽對老年db/db小鼠血糖調節的影響

由表2可以看到,隨著周齡增加,老年模型對照組小鼠血糖出現降低趨勢,陽性對照組小鼠血糖出現增加趨勢。老年模型對照組血糖高于正常對照組、陽性對照組和人參低聚肽干預組。其中老年模型對照組小鼠在70周齡時的空腹血糖顯著高于正常對照組(P<0.05),同時,陽性對照組和人參低聚肽干預組的小鼠空腹血糖低于老年模型對照組(P<0.05)。隨著飼養時間延長,陽性對照組和人參低聚肽干預組的小鼠空腹血糖顯著低于老年模型對照組,但未呈現顯著性差異(P>0.05),其原因可能是隨著周齡的增加,老年模型對照組的血糖出現了下降的趨勢,同時,老年模型對照組出現了一定數量的小鼠死亡現象,此想象與前期報道相似[9-10]。

表2 人參低聚肽對老年db/db血糖水平調節的影響Table 2 Effect of ginseng oligopeptide on blood glucose level in the aging db/db mice

由圖1a可知,除了老年模型對照組在餐后1 h出現血糖峰值,且血糖峰值保持恒定,其他各組小鼠均在餐后0.5 h達到血糖峰值,隨后血糖水平出現不同程度的下降,其中老年模型對照組的血糖峰值最高,其次為青年模型對照組,人參低聚肽干預組和正常對照組的血糖峰值較低。

圖1b反映了各個組小鼠口服糖耐量的AUC變化,可以清楚看到,各個組小鼠AUC大小排序為:正常對照組<人參低聚肽干預組<陽性對照組<老年模型對照組<青年模型對照組,其中老年模型對照組、陽性對照組和青年模型對照組AUC顯著大于正常對照組(P<0.05)。人參低聚肽干預組AUC與正常對照組AUC相當,說明人參低聚肽可以改善老年db/db小鼠的糖耐量水平。

圖1 人參低聚肽對db/db小鼠糖耐量情況的影響Fig.1 The effect of ginseng oligopeptide on glucose tolerance in db/db mice注:與正常對照組相比,*代表差異顯著,P<0.05。

2.3 人參低聚肽對db/db小鼠臟器質量和指數的影響

由表3可以看到,老年模型對照組小鼠的肝臟、腎臟、脾質量和指數均低于人參低聚肽干預組和陽性對照組,其中老年模型對照組脾質量顯著低于正常對照組(P<0.05),而老年模型對照組和青年模型對照組的脾臟指數均顯著低于正常對照組(P<0.05)。老年模型對照組的胰腺質量和指數均高于人參低聚肽干預組和陽性對照組,其中胰腺指數顯著高于青年模型對照組(P<0.05)。老年模型對照和青年模型對照組的腎周脂肪質量顯著高于人參低聚肽干預組和陽性對照組(P<0.05),而老年模型對照組的睪周脂肪質量和指數顯著高于正常對照組、人參低聚肽干預組和陽性對照組(P<0.05)。

表3 人參低聚肽對db/db小鼠臟器質量和指數的影響Table 3 Effects of ginseng oligopeptide on organ mass and index in db/db mice

2.4 人參低聚肽對db/db小鼠炎癥反應程度的影響

由表4可以看出,老年模型對照組IL-1β、IL-6含量均大于其余各組,而人參低聚肽干預組的IL-6低于正常對照組,同時顯著低于老年模型對照組(P<0.05),TNF-α含量較高的組是青年模型對照組和老年模型對照組,而正常對照組和人參低聚肽干預組的TNF-α含量相當,均小于老年模型對照組、青年模型對照組。 此表明人參低聚肽干預可以降低炎癥反應。

表4 人參低聚肽對db/db小鼠炎癥反應程度的影響Table 4 Effects of ginseng oligopeptide on the inflammatory reaction in db/db mice

2.5 人參低聚肽對db/db小鼠氧化應激狀態的影響

由表5可以看到,老年模型對照和青年模型對照組的MDA含量高于其他各組,但各組之間并未存在統計學差異,而老年模型對照組的SOD含量和GSH-Px含量顯著低于正常對照組和人參低聚肽干預組、陽性對照和青年模型對照組(P<0.05)。

表5 人參低聚肽對db/db小鼠氧化應激狀態的影響Table 5 Effects of ginseng oligopeptide on the oxidative stress status in db/db mice

3 總結與討論

相比于正常對照組小鼠,db/db小鼠均出現明顯的多飲、多食及多尿癥狀,并且出現不同程度的活動減少,動作遲緩,被毛不光潔甚至脫毛的現象。通過測定各個組小鼠的空腹血糖,可以發現,老年模型對照組血糖高于正常對照組、人參低聚肽干預組和陽性對照組,其中70周齡老年模型對照組小鼠空腹血糖顯著高于正常對照組(P<0.05),同時,陽性對照組和人參低聚肽干預組的db/db小鼠空腹血糖顯著低于老年模型對照組(P<0.05)。老年模型對照組和青年模型對照組的AUC高于陽性對照組和人參低聚肽干預組,并且老年模型對照組糖耐量表現出起點較低,血糖峰值出現較晚,血糖起伏大,但其血糖峰值持續時間長的特點。通過測定本實驗使用的干預物人參低聚肽,其精氨酸含量豐富。研究顯示,精氨酸能有效改善胰島素抵抗,加速胰島素分泌[11]。因此,推測人參低聚肽降低血糖的機制可能與人參低聚肽中富含精氨酸相關。

老年模型對照和青年模型對照組的小鼠的肝臟、腎臟、脾質量和指數均低于正常對照組和人參低聚肽干預組,其中老年模型對照組脾質量顯著低于正常對照組(P<0.05),這與文獻報道的db/db小鼠的脾臟小于db/m小鼠一致[12],這也符合肥胖糖尿病鼠免疫力低下的原則,這表明人參低聚肽干預可以在一定程度上提高老年db/db小鼠的免疫力。這與前期文獻報道相似[13]。研究表明7月齡db/db純合仔小鼠見胰腺、胰島部分體積較大,胰島中均見淋巴細胞浸潤;12月齡db/db小鼠胰腺部分胰島內及其周圍組織有灶性淋巴細胞浸潤,部分胰島內見較多小導管樣病變,胰腺小導管病變有增生擴張及潴留,使得胰島細胞之間間隙增寬[12]。Homo-Delarche等[14]報道糖尿病動物模型會出現胰島增生肥大的病理改變。本實驗中同樣發現老年模型對照組的胰腺質量和指數均高于人參低聚肽干預組。

老年模型和青年模型對照組的腎周脂肪質量顯著高于人參低聚肽干預組(P<0.05),而老年模型對照組的睪周脂肪質量和指數顯著高于正常對照組、人參低聚肽干預組和陽性對照組(P<0.05)。與皮下脂肪相比,內臟脂肪周圍存在密集的血管,具有較高代謝活性,很可能與促炎癥因子相關[15],更易產生大量TNF-α、IL-6等[16]。與脂肪指數顯示的實驗結果類似,老年模型對照組IL-1β、IL-6含量均大于其余各組小鼠的含量,研究表明肥胖患者伴隨脂肪物質的過度沉積,容易引起炎癥標記物的改變。過度的炎癥反應,會引起相關的代謝平衡紊亂,如淋巴淤滯、氧化應激、內質網應激等,產生惡性循環并造成器官的代謝功能障礙。另一方面,脂肪細胞的過度肥大可促使細胞破裂,加劇炎癥反應[17]。脂肪細胞對內質網的需求增加,內質網應激可通過激活JNK信號轉導通路,引發胰島素抵抗;其次,內質網還可激活NF-λB激酶抑制劑(IKK)信號轉導通路,參與2型糖尿病的發生和發展[18]。此外,高血糖也能促進脂肪細胞產生大量活性氧,導致脂源性炎癥因子的釋放增加。本文中氧化應激狀態的結果可以反映上述的機制,老年模型對照組和青年模型對照組的MDA含量高于人參低聚肽干預組和正常對照組,同時,正常對照組、人參低聚肽干預組和青年模型對照組的SOD和GSH-Px含量均顯著高于老年模型對照組(P<0.05)?？梢娙藚⒌途垭目梢杂行Ы档蚫b/db小鼠氧化應激和炎癥反應。此結論與文獻報道相似[7-8]。

綜合圖1人參低聚肽調節血糖變化的結果與炎癥因子和氧化應激的結果發現,抑制炎癥因子的表達和分泌,抑制氧化應激,可以減輕機體的炎癥狀態,從而改善胰島素抵抗和糖代謝異常。因此,人參低聚肽通過降低老年db/db小鼠炎癥反應和氧化應激來降低血糖水平。

本研究雖然未能直接檢測小鼠的胰島素敏感性,但是人參低聚肽干預的db/db的糖耐量異常改善、內臟脂肪含量減少,表明胰島素敏感性得到了一定的改善,同時血清主要炎癥因子TNF-α、IL-6的水平降低,氧化應激狀態改善,這表明抑制炎癥因子的分泌、降低氧化應激可能是人參低聚肽增加胰島素敏感性和改善糖代謝異常的可能作用機制之一,而后期將對人參低聚肽如何抑制炎癥因子進行深入探討,揭示其改善糖尿病疾病狀態的可能機制。