肉蓯蓉總多酚純化工藝及其抗運動性疲勞作用研究

(江蘇警官學院,江蘇南京 210031)

肉蓯蓉為列當科植物肉蓯蓉的干燥帶鱗葉肉質莖,長期服用具有“補精益血”之功效,被衛計委認定為藥食同源品種[1-2]。由于該植物含有多糖、多酚、生物堿、維生素及多種礦物質等營養成分,因而近年在藥品和食品領域應用較多。王麗衛等[3]研究發現肉蓯蓉可明顯改善胃腸道的消化功能;Yang等[4]另發現其可加強骨礦物質密度;而王小新、陳志豪等曾分別對肉蓯蓉的抗疲勞作用進行探討,但沒有研究具體活性成分的作用[5-6]。多酚化合物通常具有抗氧化、增強機體免疫及抗衰老等生理活性[7-8],而對肉蓯蓉多酚提取物的純化工藝優化和抗運動性疲勞作用的研究卻鮮有報道。因此,本研究利用大孔樹脂具有選擇性高、干擾因素少、可重復循環利用的特點[9-11],在提取肉蓯蓉多酚物質的工藝基礎上,探討大孔樹脂對其純化的最佳工藝條件,并通過相關動物實驗觀察其體內抗運動性疲勞的作用效果,為肉蓯蓉資源的后續開發和利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

試驗動物 健康雄性小鼠 50只(動物許可證號:SYXK(蘇)2019-0030),體質量10～18 g,由江蘇省實驗動物中心提供,生長環境溫度20～25 ℃,相對濕度50%～70%;肉蓯蓉 安徽亳州藥材市場,經鑒定為列當科肉蓯蓉屬植物肉蓯蓉;沒食子酸標準品 Sigma公司;Folin-酚試劑、無水乙醇、碳酸鈉 均為分析純國藥集團化學試劑有限公司;乳酸(BLA)、乳酸脫氫酶(LDH)、肌糖原(MG)和肝糖原(HG)檢測試劑盒 南京建成生物工程研究所;試驗用水 為去離子水。

WK-40型藥材粉碎機 青州邁德森制藥機械廠;UV759S型紫外-可見分光光度計 上海精密科學儀器有限公司;FA1004B型電子天平 上海越平科學儀器有限公司;NKA-2、HPD 100、HPD 300大孔樹脂 北京英萊克科技發展有限公司;AB-8、HPD 400樹脂 合肥四峰生物科技有限公司;Lab-1A-50E型冷凍干燥機 北京博醫康實驗儀器有限公司;SHZ-82型水浴恒溫振蕩器 常州國旺儀器有限公司;小鼠恒溫游泳池 上海艾研生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 多酚提取物制備 將干燥后的肉蓯蓉完全粉碎后,過80目篩,準確稱取20 g,加入400 mL,70%乙醇溶液,在60 ℃溫度下回流提取30 min后過濾,提取兩次,合并濾液減壓回收乙醇后,冷凍干燥備用[12]。

1.2.2 樹脂型號選擇

1.2.2.1 樹脂預處理 將大孔樹脂浸泡于90%乙醇中24 h,充分溶脹后濕法裝柱,后用90%乙醇反復沖洗,直至流出液與水混合(V液∶V水=1∶5)無白色渾濁出現,再用水洗至無乙醇氣味,加入3% 鹽酸浸泡3 h,用水洗至中性;再用3%氫氧化鈉溶液浸泡3 h,用水洗至中性,備用[13]。

1.2.2.2 靜態吸附與洗脫 準確稱取5.0 g六種不同極性的大孔樹脂(NKA-2、HPD 100、AB-8、HPD 300、HPD 400)置于錐形瓶內,分別加入6 mg/mL 100 mL提取液后,置于恒溫振蕩器內,靜態吸附24 h后過濾。通過下式測得不同類型大孔樹脂的靜態飽和吸附量與吸附率。

式(1)

式(2)

式中:m0為提取液中多酚質量,mg;me為飽和吸附后濾液中多酚質量,mg;m為干燥的大孔樹脂質量,g;Γe為飽和吸附量,mg/g;Qe為飽和吸附率,%。

利用乙醇作洗脫劑,將飽和吸附后的樹脂置于錐形瓶內,加入60%乙醇100 mL后,置于恒溫振蕩器中,靜態洗脫24 h,過濾,測定濾液中多酚的濃度,通過下式測得不同類型樹脂的洗脫率與回收率。

式(3)

式(4)

式中:m0為提取液中多酚質量,mg;me為飽和吸附后濾液中多酚質量,mg;md為洗脫液中多酚質量,mg;Dd為洗脫率,%;R為回收率,%。

1.2.3 吸附等溫線 準確配制100 mL濃度為1、2、3、4、5、6、7 mg/mL的肉蓯蓉提取物溶液加入至裝有5.0 g樹脂的錐形瓶后,分別置于25、35、45℃恒溫搖床中,振蕩吸附24 h,測得濾液總多酚濃度,計算吸附量,繪制吸附等溫線,同時利用Langmuir、Freundlich吸附模型,繪制相應等溫吸附方程[14]。

式(5)

式(6)

式中:Γm為多酚飽和吸附量,mg/g;Kb為Langmuir方程常數;Γe為多酚吸附量,mg/g;Ce為濾液多酚濃度,mg/mL;Kf為Freundlich方程常數。

1.2.4 吸附動力學曲線 準確稱取大孔樹脂5.0 g置于錐形瓶內,加入100 mL質量濃度為5 mg/mL的多酚提取液,于25 ℃振蕩吸附,分別于0.5、1.0、2.0、3.0、5.0、7.0、10.0、12.0、16.0、20.0、24.0 h取樣,測定總多酚濃度,以吸附量(Γt)為縱坐標,時間(t)為橫坐標,繪制靜態吸附動力學曲線,分析樹脂對肉蓯蓉多酚的吸附動力學行為[15]。

In(Γe-Γt)=InΓe+K1t

式(7)

式(8)

Γt=K3t1/2+C

式(9)

式中:K1為準一級速率常數,min-1;K2為準二級速率常數,mL·mg-1·min-1;K3為顆粒內擴散速率常數,mg·min-0.5·min-1。

1.2.5 大孔樹脂動態吸附

1.2.5.1 上樣液濃度影響 分別準確量取等體積的多酚提取液2、4、6、8、10 mg/mL,控制流速2 mL/min,上樣至預處理后的樹脂內(樹脂質量:5.0 g;徑高比:1∶12),收集柱后流出液,測得不同流出液中多酚濃度,計算各自吸附率。

1.2.5.2 吸附流速影響 準確量取等體積5份1.2.5.1確定的最佳濃度多酚提取液,分別控制流速1、2、3、4、5 mL/min,上樣至預處理后的樹脂內(樹脂質量:5.0 g;徑高比:1∶12),收集柱后流出液,測得不同流出液中多酚濃度,計算各自吸附率。

1.2.5.3 樹脂吸附泄露曲線 準確量取1.2.5.1確定的最佳濃度多酚提取液,以1.2.5.2實驗中確定的最佳流速上樣至預處理后的樹脂內(樹脂質量:5.0 g;徑高比:1∶12),收集柱后流出液,每管體積5 mL,直至到達飽和吸附,測得各自吸附率,繪制樹脂吸附泄露曲線并確定最佳上樣液體積。

1.2.6 大孔樹脂動態洗脫

1.2.6.1 乙醇濃度影響 以乙醇溶液作洗脫劑,分別選擇體積分數40%、50%、60%、70%、80%的乙醇溶液,控制1 mL/min洗脫流速,對1.2.5.3飽和吸附后的樹脂進行洗脫,直至洗脫完全,收集洗脫液,測定多酚濃度,計算各自洗脫率。

1.2.6.2 洗脫流速影響 配制5份1.2.6.1試驗中確定的最佳濃度乙醇溶液,分別控制流速0.5、1、2、3、4 mL/min,對1.2.5.3飽和吸附后的樹脂進行洗脫,直至洗脫完全,收集洗脫液,測定多酚濃度,計算各自洗脫率。

1.2.6.3 樹脂洗脫曲線 精密量取1.2.6.1實驗中確定的最佳濃度乙醇溶液,以1.2.6.2實驗中確定的最佳流速對1.2.5.3飽和吸附后的樹脂進行洗脫,直至洗脫完全,收集洗脫液,每管體積5 mL,測量每管總多酚濃度,繪制樹脂洗脫曲線。

1.2.7 定量分析

1.2.7.1 標準曲線繪制 按照文獻所述方法,準確稱取沒食子酸標準品20 mg溶于水中,另加入Folin-酚試劑和質量分數為20%的NaCO3溶液,配制成質量濃度為0.1～0.8 mg/L的標準溶液,并于760 nm處測定吸光度[12],以濃度為橫坐標,吸光度為縱坐標繪制標準曲線,得到標準曲線方程y=1.472x-0.0527(r=0.9961)。

1.2.7.2 多酚濃度測定 照上述步驟配制樣品溶液后,于760 nm波長處,測定吸光度后,根據方程計算樣品中多酚濃度,另作空白試驗,平行測定三次,按照下式計算樣品中多酚的純度。

式(10)

式中m0為樣品質量,mg;C為產物的多酚濃度,mg/mL;V為樣品體積,mL;D為稀釋倍數。

1.3 體內抗疲勞研究

1.3.1 模型建立 將50只健康雄性小鼠,隨機分為五組,每組10只,空白對照組采用生理鹽水灌胃,其它各組則按照小鼠體重灌藥,其中陽性對照組采用0.1 mg/g西洋參灌胃,低、中、高劑量組則依次灌胃0.05、0.10、0.20 mg/g多酚純化物,每天灌胃1次,連續灌胃30 d。每組小鼠灌胃1 h后于恒溫游泳池內開展游泳訓練,5 d為一訓練周期,共訓練4周[16]。

1.3.2 動物游泳運動 模型建立后,于鼠尾負重自身5%的重物,進行力竭性游泳運動,記錄小鼠自入水開始游泳至沉沒超過10 s的時間,即為游泳力竭時間[17]。

1.3.3 體內生化指標測定 小鼠游泳運動進行10 min后,取出擦凈,摘取眼球,抽血離心,同時分取肝與肌肉組織,采用相關試劑盒分別測得各組動物血清中乳酸、肝糖原、肌糖原含量和乳酸脫氫酶的活力[18]。

1.4 數據處理

實驗結果均采用均數±標準差表示,采用SPSS 18.0方差分析,檢驗水準α=0.05,當P<0.05表示差異顯著,P<0.01表示差異極顯著。

2 結果與討論

2.1 樹脂型號確定

表1為不同型號大孔樹脂對提取物中多酚的靜態吸附與洗脫性能比較,從表1中可知,不同樹脂的吸附能力不同,其中HPD-400大孔樹脂對肉蓯蓉多酚的吸附率最高,達到88.0%,其次為NKA-2,吸附率為77.0%,而采用60%乙醇靜態洗脫時,HPD-400大孔樹脂的洗脫率最大,達到91.2%,表明HPD-400大孔樹脂對肉蓯蓉多酚的吸附與解吸性能較好,這可能源于同其它四類樹脂相較,HPD-400樹脂極性適中,與多酚的相互作用較好,因此確定HPD-400大孔樹脂作為該純化研究的吸附樹脂。

表1 不同樹脂的靜態吸附與洗脫性能比較Table 1 Compare with static adsorptionand desorption performance of different resins

2.2 樹脂吸附等溫線

HPD-400大孔樹脂對肉蓯蓉多酚的吸附等溫線,如圖1所示,不同溫度下,隨著上樣液多酚濃度的增大,樹脂吸附量不斷增加,分別對不同溫度的吸附曲線進行擬合,結果見表2所示。從表2可知,不同溫度下HPD-400大孔樹脂對肉蓯蓉多酚的等溫吸附過程與Langmuir吸附等溫模型相近,方程相關系數r均大于0.99,同時隨著溫度升高,吸附量逐漸減少,表明該吸附過程為放熱過程。

圖1 不同溫度的吸附等溫曲線Fig.1 The adsorption curve in different temperatures

表2 不同溫度的吸附等溫線擬合方程Table 2 Fitting equations of adsorptionisotherms in different temperatures

2.3 樹脂吸附動力學曲線

HPD-400大孔樹脂對肉蓯蓉多酚的吸附動力學曲線,如圖2所示。在0～2 h時,樹脂對多酚的吸附量較大,逐漸緩慢至12 h后達到平衡,表明HPD-400大孔樹脂對肉蓯蓉多酚的吸附較快。利用相關動力學方程模型對上述吸附過程進行擬合,見表3所示,該吸附過程與準二級動力學過程更為接近,同時從Kannan擬合方程結果可知,該吸附過程分為三個階段,在0～4 h為薄膜擴散過程,在4～12 h為粒內擴散過程,Γt對t1/2均具有良好的線性關系,12 h后樹脂對多酚的吸附與脫附達到平衡。

圖2 吸附動力學曲線Fig.2 The curve of adsorption dynamics

表3 吸附動力學擬合方程Table 3 The fitting equations of adsorption dynamics

2.4 動態吸附條件選擇

2.4.1 上樣液濃度選擇 若上樣液多酚濃度過高,樹脂易過早飽和,造成樹脂吸附率下降,而上樣液多酚濃度過低,則影響實驗效率。不同上樣液濃度對吸附率的影響,見圖3所示,當多酚濃度為2～6 mg/mL時,隨著上樣液多酚濃度的增大,HPD-400大孔樹脂對多酚的吸附率處于較高水平,而多酚濃度大于6 mg/mL時,吸附率開始逐漸下降,這歸因于樣品溶液中部分多酚的泄露,因此確定上樣液最佳多酚濃度為6 mg/mL。

圖3 上樣液濃度對吸附率的影響Fig.3 The effect of loading solutionconcentration on adsorption rate

2.4.2 吸附流速選擇 在動態吸附時,上樣流速過快,多酚與樹脂接觸不充分,可能造成過早泄漏,但流速過慢,又導致純化耗時過長,且對后續樹脂再生產生不良影響。不同上樣流速對吸附率的影響,見圖4所示,當上樣流速在1～2 mL/min時,HPD-400大孔樹脂對多酚的吸附率無明顯影響,而隨著流速增大,吸附率呈下降趨勢,因此選擇2 mL/min作為最佳上樣流速。

圖4 吸附流速對吸附率的影響Fig.4 The effect of adsorption flow rate on adsorption rate

2.4.3 動態吸附泄漏曲線 當流出液的多酚濃度為上樣液濃度的10%,稱為樹脂吸附泄漏點,達到上樣液濃度的100%時稱為樹脂飽和吸附點[19]。肉蓯蓉多酚在上樣過程時不斷被樹脂吸附與脫附,當吸附速率等于脫附速率時,出現泄漏現象,見圖5所示,當上樣液體積約為60 mL時,流出液中總多酚濃度急劇上升,且超出上樣液濃度10%,達到泄漏點,上樣液體積約為140 mL時,達到飽和吸附點,因此確定HPD-400大孔樹脂純化肉蓯蓉多酚化合物的最大上樣體積為60 mL。

圖5 大孔樹脂動態吸附泄露曲線Fig.5 Dynamic adsorption leakagecurve of macroporous resin

2.5 洗脫條件選擇

2.5.1 乙醇濃度選擇 不同濃度的乙醇溶液對肉蓯蓉多酚的洗脫效果,見圖6所示。隨著洗脫液濃度增大,洗脫率逐漸增大,至60%開始下降。這可能因為低濃度乙醇破壞多酚與樹脂形成的氫鍵能力較弱,而過高濃度乙醇的極性與多酚化合物相差較大,不利于洗脫,因此確定采用60%乙醇溶液作為最佳洗脫液濃度。

圖6 洗脫液濃度對洗脫率的影響Fig.6 The effect of eluent concentration on desorption rate

2.5.2 洗脫流速選擇 不同洗脫流速對肉蓯蓉多酚的洗脫率影響,見圖7所示,隨著洗脫流速增大,洗脫率逐漸下降,這歸因于流速較快時,洗脫液不能充分接觸樹脂,但流速過低,又會延長洗脫過程,因此綜合考慮確定1 mL/min作為最佳洗脫流速。

圖7 洗脫流速對洗脫率的影響Fig.7 The effect of eluent flow rate on desorption rate

2.5.3 動態洗脫曲線 不同洗脫液用量對肉蓯蓉多酚的洗脫效果影響,見圖8所示。從圖8可知,當洗脫液體積為20 mL時,即有多酚類化合物被洗脫流出,當用量為80 mL,洗脫液中多酚含量達到最大,隨后洗脫液體積繼續增大,但多酚含量不斷下降。當用量約為180 mL時,多酚類化合物基本被完全洗脫,所得洗脫曲線單一、對稱、尖銳且無明顯拖尾,因此確定最佳濃度的洗脫液的用量為180 mL。

圖8 動態洗脫曲線Fig.8 The dynamic elution curve

2.6 驗證實驗

采取上述最佳純化工藝,對肉蓯蓉提取物中多酚類化合物,即配制體積為60 mL,多酚濃度為6 mg/mL上樣液,以2 mL/min流速,上樣至HPD-400大孔樹脂飽和吸附后,采用體積為180 mL,60%乙醇溶液,以1 mL/min流速洗脫,測得吸附率與洗脫率分別為86.72%和90.11%,產物的總多酚純度由純化前(20.12%±1.26%)提高至純化后(42.63%±1.69%),約為純化前2.12倍,而前人采用大孔樹脂純化蘋果多酚含量由35%增高至84%,為純化前2.4倍[20];黑果腺肋花楸多酚提取物經純化后含量為純化前5.5倍[21],表明該工藝分離效果較好,適于肉蓯蓉多酚化合物的純化。

2.7 抗疲勞作用研究

2.7.1 游泳力竭時間比較 負重游泳時間的長短直接反映運動過程的抗疲勞程度,不同劑量純化產物對小鼠的負重游泳時間影響[22],見表4所示。從表4可知,與空白對照組相較,陽性對照、低、中、高劑量組小鼠的負重游泳時間均有所延長,其中低劑量組與其差異具有顯著性(P<0.05),而陽性對照、中、高劑量組小鼠與其差異則極為顯著(P<0.01),表明肉蓯蓉多酚純化產物有助于增強小鼠的運動耐力。

表4 肉蓯蓉多酚對運動時間的影響Table 4 The effect of polyphenols ofCistanche on movement time

2.7.2 體內生化指標影響 身體運動后乳酸的濃度水平與疲勞程度呈正相關,機體高強度運動后會造成體內部分細胞缺氧,致使血糖發生糖酵解生成乳酸,蓄積在骨骼肌等組織中,而乳酸脫氫酶可迅速催化乳酸脫氫形成丙酮酸,有利于排泄出體外[23]。不同劑量純化產物對運動后小鼠的體內乳酸生化指標影響,見表5所示。各劑量組小鼠體內的血乳酸含量和乳酸脫氫酶酶活力與空白對照組相較,差異均極為顯著(P<0.01),表明肉蓯蓉多酚可明顯提高體內乳酸脫氫酶活力,并有利于抑制體內乳酸生成。

肝糖原與肌糖原則是機體的重要儲能物質,當機體開始運動時,肌糖原逐漸消耗至殆盡,隨后利用肝糖原以維持體內運動時血糖水平[24]。表5為不同組別小鼠的肝糖原與肌糖原含量,與空白對照組相比,低劑量組的兩種糖原含量均較高,具有顯著性差異(P<0.05),而陽性對照、中、高劑量組體內的兩種糖原含量均明顯更高,具有極顯著性差異(P<0.01),表明肉蓯蓉多酚純化產物有助于增加體內肝糖原與肌糖原儲備。

表5 肉蓯蓉多酚對體內生化指標的影響Table 5 The effect of polyphenols of Cistanche on biochemical indexs in vivo

3 結論

采用HPD-400大孔樹脂分離純化肉蓯蓉提取物中多酚類化合物,該吸附過程符合準二級動力學方程,等溫吸附線與Langmuir模型較好擬合,且多酚吸附量伴隨溫度升高而減少。通過動態吸附與洗脫試驗,優選得到最佳純化工藝條件:配制體積為60 mL,多酚濃度為6 mg/mL上樣液,以2 mL/min流速,上樣至HPD-400大孔樹脂飽和吸附后,采用體積為180 mL,60%乙醇溶液,以1 mL/min流速洗脫,樹脂對多酚類化合物的吸附率和解吸率分別達到86.72%和90.11%。產物中總多酚含量由純化前20.12%提高至純化后42.63%,約為純化前2.12倍。該工藝操作簡便、純化效率較高,低、中、高劑量產物均可明顯增強機體運動耐力,提高體內乳酸脫氫酶活力,抑制乳酸生成水平,并可增加肝糖原與肌糖原的儲備,從而具有較好的抗運動性疲勞作用。