5種食用菌多糖的結構特征及抗氧化活性對比

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(1.東北農業大學食品學院,黑龍江哈爾濱 150030;2.乳品科學教育部重點實驗室,黑龍江哈爾濱 150030)

食用真菌具有豐富的營養價值和功能,多糖作為食用菌中的主要活性成分之一,不僅參與了食用菌的生長,還具有多種生物活性[1]。多糖是幾乎存在于所有生物體的生物大分子[2],具有多種生物活性,如抗糖尿病[3]、抗腫瘤[4]、免疫調節活性[5]、保肝作用[6]、抗氧化活性等,其在功能性食品、藥理學和生物化學領域引起了廣泛關注。

近年來,食用真菌和其多糖的抗氧化活性引起了人們的廣泛關注。例如從冬蟲夏草[7]、牛肝菌[8]、羊肚菌[9]和猴頭菇等食用真菌中分離得到的各種多糖對ABTS+·和DPPH·都具有明顯的清除作用[10]。但是盡管天然來源的多糖具有多種生物活性,但大多數活性多糖由于組成復雜、分子量大,使其結構特征尚不明確,限制了其應用[11]。生物大分子的生物活性與其結構有著緊密的聯系,多糖的分子量[12]、官能團[13]、分支以及構象等結構特征對多糖的生物活性有著影響[14]。朱曉冉等[15]對比了野生黑木耳多糖的三組分子量多糖(Sp1>100 ku;100 ku>Sp2>30 ku;30 ku>Sp3)的抗氧化活性,結果顯示,小分子量的Sp3對ABTS+·、DPPH·、·OH的清除效果最好。伯繼芳等[16]對比了硫酸化修飾的杏鮑菇多糖(SPEP)和未修飾的杏鮑菇多糖(PEP)的體外生物活性,結果顯示,在相同劑量下,SPEP較PEP表現出更好的抗氧化活性及對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶具有抑制作用。以上結果表明,多糖的分子量、硫酸化修飾等與真菌多糖的抗氧化能力有關,但是目前,關于食用真菌多糖結構與抗氧化活性之間關系的研究尚少。

本研究為了探討真菌多糖結構與抗氧化活性的構效關系,選取了銀耳(Tremellafuciformis)、黑木耳(Auriculariaauricula-judae)、杏鮑菇(Pleurotuseryngii)、金針菇(Flammulinavelutipes)和猴頭菇(Hericiumerinaceus)這5種食用菌作為多糖的提取原料,利用高效液相色譜法(HPLC)測定了其單糖的組成,采用傅里葉變換紅外光譜、剛果紅實驗及X-射線衍射(X-ray diffraction,XRD)對它們的結構特征進行分析,同時測定它們的抗氧化活性,比較它們的結構特征、抗氧化活性、50%抑制濃度(half maximal inhibitory concentration,IC50)和單糖的組成,分析其結構與抗氧化的相關性,闡明具有較高抗氧化活性的食用真菌多糖的結構特征,以期為開發多糖功能性食品及抗氧化真菌多糖提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

金針菇、杏鮑菇鮮品 市售;銀耳、黑木耳、猴頭菇干品 哈爾濱北大荒提供;氯化硝基四氮唑藍(nitrotetrazolium blue chloride,NBT)、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide,NADH)、吩嗪硫酸甲酯(phenazine methosulfate,PMS) 美國Sigma公司;單糖 標準品,上海源葉生物有限公司;乙腈 色譜純,德國默克公司;其他試劑 均為國產分析純。

HH-4水浴鍋 常州賽普實驗儀器廠;Alpha 2-4 LSCplus真空冷凍干燥箱 德國Marin Christ公司;YRE-5299旋轉蒸發器 予華儀器有限責任公司;Avanti J-E離心機 美國Backman Coulter有限公司;D-8紫外-可見分光光度計 南京菲勒儀器有限公司;Agilent 1260高效液相色譜儀 美國Agilent科技有限公司;Nicolet傅里葉變換紅外光譜儀 美國尼高力公司;2700 X射線衍射儀 丹東方圓儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 多糖的提取 采用熱浸醇沉的方法對5種食用真菌的多糖進行提取。將5種食用菌在55 ℃烘箱中烘至恒重,粉碎,過80目篩。稱取一定質量的食用真菌粉末,按照料液比1∶20加入蒸餾水,浸泡過夜。85 ℃條件下水浴2 h,過濾得濾液。將濾渣再次熱水浸提、過濾,將兩次濾液混合后,蒸發濃縮至原體積的1/3,4000 r/min離心15 min,上清液中加入無水乙醇,使體系中乙醇濃度為65%,4 ℃過夜。4500 r/min離心20 min,沉淀依次用無水乙醇和95%乙醇洗滌,得食用真菌粗多糖。通過Savge法脫蛋白,重復操作五次后,利用活性炭去除色素,透析(截留分子質量8000～14000 Da)72 h,冷凍干燥得銀耳多糖(Tremellafuciformispolysaccharides,TFP)、黑木耳多糖(Auriculariaauricula-judaepolysaccharides,AAP)、杏鮑菇多糖(Pleurotuseryngiipolysaccharides,PEP)、金針菇多糖(Flammulinavelutipespolysaccharides,FVP)和猴頭菇多糖(Hericiumerinaceuspolysaccharides,HEP)。

1.2.2 多糖化學組成的測定 采用苯酚-硫酸法測定總糖含量[17];采用考馬斯亮藍法測定蛋白質含量[18];采用間羥基聯苯法測定多糖糖醛酸含量[19];采用氯化鋇-明膠比色法測定多糖中硫酸基的含量[20];灰分根據GB 5009.4-2016進行測定。

多糖的單糖組成采取柱前衍生化高效液相色譜法測定[21],稱取多糖樣品2 mg,加入0.5 mL 2 mol/L三氟乙酸溶液,120 ℃溫度條件下水解120 min,氮吹吹干。向水解后的單糖樣品中加入0.5 mol/L的PMP溶液(溶于無水甲醇)和0.3 mol/L的NaOH溶液各0.5 mL,充分混勻后,70 ℃溫度條件下反應30 min。冷卻至室溫,加入0.3 mol/L HCl溶液0.5 mL,充分混勻。加入0.5 mL氯仿,充分振蕩萃取,5000 r/min離心5 min去除氯仿層,萃取3次,0.22 μm濾膜過濾后,待上機。單糖標準品包括葡萄糖、半乳糖、甘露糖、巖藻糖、木糖、鼠李糖、阿拉伯糖、葡萄糖醛酸及半乳糖醛酸,單糖標準品前處理方法與樣品相同。

儀器條件:色譜柱:Agilent Extend C18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動相:0.1 mol/L pH7.0磷酸鹽緩沖溶液-乙腈82.2∶17.8;流速:1.0 mL/min;進樣量:10 μL;柱溫:25 ℃;波長:245 nm。

1.2.3 結構特征的測定

1.2.3.1 傅里葉變換紅外光譜分析 稱取干燥多糖樣品1～2 mg和KBr研磨均勻,壓片,在4000～400 cm-1波長范圍內進行紅外光譜掃描,記錄光譜圖。

1.2.3.2 剛果紅實驗 取1.0 mL 2 mg/mL多糖樣品溶液,分別加入3 mL濃度為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mol/L的NaOH溶液,并加入1.5 mL剛果紅溶液以及0.5 mL蒸餾水,充分混勻后,靜置1 h。運用紫外分光光度計對反應液進行200～800 nm全波長掃描,記錄最大吸收波長,蒸餾水作空白對照。

1.2.3.3 X-射線衍射分析 多糖的X-射線衍射分析的測定條件為:Cu輻射、掃描步長為0.05 °、掃描范圍為2θ=5 °～80 °;管流為25 mA,管壓為35 kV;發射狹縫(DS)為1 °、接收狹縫(RS)為8 mm,采集后的數據經MDJ Jade 6.0軟件進行分析。

1.2.4 多糖抗氧化活性的測定

1.2.4.1 對DPPH·清除活性的測定 將25 mg的DPPH溶于1 L甲醇中,制備濃度為60 mmol/L的DPPH工作液。取1.0 mL不同濃度樣品溶液加入3.9 mL DPPH工作液,混合均勻,室溫避光反應30 min,于517 nm處測定吸光度[22]。以維生素C作對照,按下式計算DPPH·清除率:

式中:A0為蒸餾水代替樣品按上述步驟測定的吸光度;A1為按上述步驟測定的多糖樣品的吸光度。

1.2.4.2 對ABTS+·清除活性的測定 將7 mmol/L ABTS溶液加入到等體積的2.45 mmol/L 過硫酸鉀溶液中,室溫黑暗中放置12 h后,用0.1 mol/L pH7.4磷酸緩沖液稀釋,使其在734 nm處的吸光值為0.7±0.02,得ABTS工作液。取1.0 mL不同濃度樣品加入4 mL ABTS工作液,搖勻,于734 nm處測定吸光度[23]。以維生素C作對照,按下式計算對ABTS+·清除率:

式中:A0為蒸餾水代替樣品按上述步驟測定的吸光度;A1為按上述步驟測定的多糖樣品的吸光度;A2為蒸餾水代替ABTS工作液按上述步驟測定的吸光度。

1.2.4.3 對·OH清除活性的測定 取0.5 mL 9 mmol/L的FeSO4溶液和1.0 mL 8.8 mmol/L H2O2溶液混合,使其發生Fenton反應,生成·OH。取1 mL不同濃度樣品溶液加入Fenton反應體系中,后加入0.1 mL 9 mmol/L水楊酸溶液,混合均勻,37 ℃水浴1 h,于510 nm處測定吸光度[22]。以維生素C作對照,按下式計算·OH清除率:

式中:A0為蒸餾水代替樣品按上述步驟測定的吸光度;A1為按上述步驟測定的多糖樣品的吸光度;A2為蒸餾水代替水楊酸溶液按上述步驟測定的吸光度。

1.2.4.4 對超氧陰離子清除活性的測定 取1.0 mL不同濃度樣品溶液和1.0 mL 300 μmol/L NBT溶液混合,加入1.0 mL 936 μmol/L NADH溶液和1 mL 120 μmol/L PMS溶液(溶解于10 mmol/L pH7.4 磷酸緩沖液),室溫放置5 min,于569 nm處測定吸光度[1]。以維生素C作對照,按下式計算超氧陰離子清除率:

式中:A0為蒸餾水代替樣品按上述步驟測定的吸光度;A1為按上述步驟測定的多糖樣品的吸光度。

1.3 數據處理

2 結果與分析

2.1 5種食用真菌多糖的化學組成

5種食用真菌多糖的化學組成見表1。5種食用真菌多糖經5次Sevag法脫蛋白之后均含有蛋白質,可能是由于Sevag法除去的蛋白為多糖中游離的蛋白質,一些與糖基結合的蛋白質不易被去除。某些表現出特殊生理活性的多糖中糖醛酸含量較高,而具有糖醛酸結構的多糖一般為植物多糖,所以測定本研究中5種食用真菌多糖的糖醛酸含量具有極為重要的意義[24]。通過分析得出5種食用真菌多糖中AAP的糖醛酸含量顯著高于其他4種多糖(P<0.05),其次是TFP,此結果與吳小燕[25]的研究相比,糖醛酸含量較低,可能是原材料的品種和產地不同導致的。硫酸基含量指多糖糖基所帶硫酸基的個數,多糖的許多生物活性功能與硫酸基含量有直接關系[26]。通過分析得出5種食用真菌多糖中PEP中的硫酸基含量顯著高于其他4種多糖(P<0.05)。

表1 5種食用真菌多糖的化學組成Table 1 Chemical composition of polysaccharides from five species of edible mushrooms

表2 5種食用真菌多糖的單糖組成Table 2 Monosaccharide composition of polysaccharides from five species of edible mushrooms

2.2 5種食用真菌多糖的單糖組成

5種食用真菌多糖的單糖組成見表2。5種食用真菌多糖均含有葡萄糖、半乳糖、甘露糖和巖藻糖。其中TFP和AAP主要以葡萄糖(28.2%、24.4%)和甘露糖(38.4%、44.4%)為主,還含有少量的木糖、鼠李糖和葡萄糖醛酸,銀耳中還含有20.9%的阿拉伯糖,此結果與吳振亞和王雪[27-28]的研究結果一致。PEP、FVP和HEP主要以葡萄糖(51.5%～59.9%)和半乳糖(18.9%～28.4%)為主,還含有少量葡萄糖醛酸,PEP中含有少量的半乳糖醛酸,此結果與閆晶敏[29]的研究結果一致。

2.3 結構特征

2.3.1 傅里葉變換紅外光譜分析 由圖1可知,本研究5種食用真菌多糖均具有多糖的特征吸收峰:3400 cm-1附近(3406～3417 cm-1)的寬峰為分子間或者分子內O-H伸縮振動峰;2930 cm-1附近(2926～2928 cm-1)的吸收峰為C-H的伸縮振動峰;1640 cm-1(1632～1641 cm-1)和1400 cm-1(1371～1385 cm-1)附近的吸收峰分別為C=O非對稱伸縮振動峰及C-H變形振動峰。1100 cm-1(1034～1078 cm-1)附近的吸收峰表明可能存在β-吡喃型糖環結構[30]。此外,TFP和AAP中還含有1250 cm-1的吸收峰,此峰源于S-O的不對稱伸縮振動[31],AAP含有1732 cm-1吸收峰,此吸收峰為酯基-COOR中C=O伸縮振動引起的[28]。

圖1 5種食用真菌多糖的紅外光譜圖Fig.1 Infrared spectra of five speciesof edible fungus polysaccharides

2.3.2 剛果紅實驗結果 有關多糖生物活性和結構特征的研究發現,二者關系不僅建立在多糖的一級結構上,還與多糖分子的空間構象有關[32]。因此本研究通過剛果紅實驗測定5種多糖是否具有三螺旋結構。具有三股螺旋結構的多糖會與剛果紅染色劑形成絡合物,在堿性條件下,與空白對照相比,紫外光譜最大吸收波長會發生變化。如果多糖不具有三股螺旋結構,其與剛果紅染色劑形成的絡合物的最大吸收波長的變化趨勢會與空白對照趨勢相近。如圖2所示,加入0.1 mol/L NaOH溶液的HEP樣品的光吸收向長波移動,表明樣品可與剛果紅形成絡合物,具有三股螺旋結構。當加入的NaOH溶液濃度升高,分子間氫鍵被破壞,三股螺旋結構被破壞[33]。除HEP外,其他4種食用真菌多糖均未與剛果紅形成絡合物,說明除HEP外的4種多糖均不具有三股螺旋結構。

圖2 剛果紅-食用真菌多糖絡合物紫外光譜最大吸收波長Fig.2 UV spectrum maximum absorption wavelength ofCongo red-edible fungus polysaccharides complex

2.3.3 X射線衍射結果 X射線衍射(XRD)是一種測定高分子聚合物結晶結構的重要手段,具有直接、方便的優點。如圖3可知,在2θ為10 °～80 °范圍內,5種食用真菌多糖的X射線曲線最高峰都出現22 °附近。經分析得出5種食用真菌多糖的結晶度從大到小分別為:HEP>TFP>AAP>FVP>PEP。白文強[34]的研究發現,經離子液體-高壓微射流改性處理后的β-葡聚糖天然的三螺旋構象被破壞后,結晶度降低。因此本實驗結果可能是由于HEP具有三螺旋結構,而其他4種多糖不具有三螺旋結構,導致了5種多糖的不同結晶度。

圖3 5種食用真菌多糖的X射線衍射圖Fig.3 X-ray diffraction spectra offive species of edible fungus polysaccharides

2.4 5種食用真菌多糖抗氧化活性的對比

2.4.1 DPPH·清除活力的測定結果 DPPH為一種暗紫色的大棱柱形晶體,在與抗氧化劑反應后,顏色會由深變淺,吸光值也會由大變小[35]。由圖4可知,隨著濃度的增加,5種食用真菌多糖(TFP、AAP、PEP、FVP和HEP)對DPPH·的清除率均增加,在相同濃度條件下,不同食用真菌多糖對DPPH·的清除率均顯著低于維生素C(P<0.05)。同時以IC50值衡量5種食用真菌多糖的抗氧化活性強度,發現5種食用真菌多糖種AAP的DPPH·清除能力顯著高于其他4種多糖(P<0.05),IC50為6.774 mg/mL。

圖4 5種食用真菌多糖對DPPH·的清除活力Fig.4 Scavenging ability of five species ofedible fungus polysaccharides on DPPH·注:相同濃度不同字母代表組間差異顯著(P<0.05);圖5～圖7同。

2.4.2 ABTS+·清除活力的測定結果 ABTS+·是ABTS在過硫酸鹽的條件下被氧化生成相對穩定的藍綠色自由基。由于抗氧化劑奪取ABTS+·中的自由基從而使溶液褪色,吸光值相應值變低。由圖5可知,隨著濃度的增加,5種食用真菌多糖(TFP、AAP、PEP、FVP和HEP)對ABTS+·的清除率均增加,在相同濃度條件下,不同食用真菌多糖對ABTS+·的清除率均顯著低于維生素C(P<0.05)。AAP的ABTS+·清除能力顯著高于其他4種多糖(P<0.05),IC50為2.349 mg/mL。AAP具有較高的DPPH·清除活力和ABTS+·清除活力可能是多糖中糖醛酸含量導致,AAP的糖醛酸含量顯著高于其他4種多糖(P<0.05),有研究報道,糖醛酸含量和自由基清除活力呈正相關[36]。此外,Sun等[37]的研究結果顯示,糖醛酸含量越高的黑木耳子實體多糖抗清除自由基的能力越強。

圖5 5種食用真菌多糖對ABTS+·的清除率Fig.5 Scavenging ability of five species ofedible fungus polysaccharides on ABTS+·

2.4.3 ·OH清除活力的測定結果 ·OH是一種很強大的氧化劑,它幾乎能與所有的生物分子(如蛋白質、脂類和碳水化合物)發生反應,產生的氧化應激可以導致多種疾病和退化[38]。由圖6可知,隨著濃度的增加,5種食用真菌多糖對·OH的清除率均增加,在相同濃度條件下,不同食用真菌多糖對·OH的清除率均顯著低于維生素C(P<0.05)。PEP的·OH清除能力高于其他4種多糖,IC50為5.484 mg/mL。這種現象可能是由于多糖中硫酸基含量不同導致,據Guo等[39]報道,·OH清除率與樣品中氨基酸基團數量有關,本文的實驗結果中PEP的蛋白質含量略高于其他4種多糖,可能是因為其具有較多的氨基酸基團,進而使PEP的·OH清除活力高于其他4種多糖。

圖6 5種食用真菌多糖對·OH的清除活力Fig.6 Scavenging ability of five species ofedible fungus polysaccharides on ·OH

2.4.4 超氧陰離子清除活力的測定結果 超氧陰離子是一種活性氧,是在生物體內被生產的第一個氧自由基,可以引發一系列體內自由基的產生,進而對機體產生危害[40]。由圖7可知,隨著濃度的增加,5種食用真菌多糖對超氧陰離子的清除率均增加,在相同濃度條件下,不同食用真菌多糖對超氧陰離子的清除率均顯著低于維生素C(P<0.05)。HEP對超氧陰離子的清除活力顯著強于其他4種多糖(P<0.05),IC50為3.327 mg/mL。這種現象可能是由5種多糖的空間構象不同導致的,由XRD結果和剛果紅實驗結果可知,HEP具有三螺旋結構且具有更好的空間構象。Zhang等[41]的研究發現,具有三股螺旋結構的香菇多糖的抗腫瘤活性明顯高于單股螺旋多糖,且螺旋鏈一旦破壞,抗腫瘤活性會明顯下降。因此多糖的三螺旋結構可能會影響多糖的生物活性,推測HEP較高的抗氧化能力可能與其具有三螺旋結構有關。

圖7 5種食用真菌多糖對超氧陰離子的清除率Fig.7 Scavenging ability of five species ofedible fungus polysaccharides on superoxide anion radical

2.5 5種食用真菌多糖組分與抗氧化活性的相關性分析

多糖的生物活性受很多因素影響,包括化學成分、結構等,提取方法也會對多糖的生物活性產生影響[42]。因此將5種食用真菌多糖的化學組成及單糖組成與抗氧化活性(IC50)進行Pearson相關性分析以期探索兩者之間的構效關系。

由圖8可知,鼠李糖、木糖和阿拉伯糖含量對抗氧化活性均沒有顯著影響。對ABTS+·的IC50值影響較為顯著(P<0.05)的為糖醛酸和葡萄糖醛酸含量,R2分別為-0.79和-0.82,此結果與2.4.2具有一致性,除了此之外,巖藻糖、甘露糖和半乳糖的含量也對多糖的ABTS+·清除活力有影響。大部分多糖的組成成分都對DPPH·的IC50值有顯著影響(P<0.05),其中較為顯著(P<0.05)的影響因素為糖醛酸和葡萄糖醛酸的含量,R2分別為-0.85和-0.84,其次為半乳糖和硫酸基的含量,且均呈正相關,R2分別為0.72和0.66。此外伯繼芳等[16]的研究也發現硫酸化修飾后的杏鮑菇多糖與未修飾的杏鮑菇多糖相比,對DPPH·的清除效果相對較差,這可能是-OSO3H團未能激活異頭碳上的氫原子所導致的[43]。5種多糖的蛋白質、葡萄糖和甘露糖含量對多糖的·OH清除活力有顯著影響(P<0.05),其中蛋白質和葡萄糖含量與·OH的IC50值呈負相關,R2分別為-0.56和-0.52,甘露糖含量和·OH清除活力呈正相關,這與2.4.3的結果一致,Lei等[42]通過對比由一種多毛菌發酵液產生的胞內多糖和胞外多糖的·OH清除活力和單糖組成,也發現多糖的葡萄糖和甘露糖含量影響多糖的·OH清除活力。5種多糖的巖藻糖含量和多糖的超氧陰離子的IC50值呈正相關,R2為0.52。通過Pearson相關性分析分析了5種多糖的化學組成分析與抗氧化能力,發現了食用真菌多糖具有的抗氧化能力與其化學組成相關,但是是否所有食用真菌多糖的上述組成均影響其抗氧化活力,還需要大量食用真菌多糖樣本進一步驗證。

圖8 5種食用真菌多糖組分與抗氧化活性的相關性分析Fig.8 Correlation of antioxidantactivities with molecular properties注:有數字標識代表抗氧化活性IC50值與組分含量顯著相關(P<0.05),圖中顯示值代表Pearson 相關性值R2，+表示正相關，-表示負相關。

3 結論

本研究提取了5種食用真菌多糖,測定了它們的組成、結構及抗氧化活性,并對5種多糖的化學組成與其抗氧化活性進行Pearson相關性分析。結果顯示,5種多糖均由大量葡萄糖、半乳糖和甘露糖組成,且AAP含有較多糖醛酸,PEP含有較多蛋白質。結構測定結果表明,5種食用真菌多糖均含有多糖特征峰,HEP具有三螺旋結構且結晶度顯著高于其他4種多糖(P<0.05)。5種食用真菌多糖均具有抗氧化活性,可作為潛在的天然抗氧化劑應用于藥品和食品工業中。經Pearson分析后發現多糖的各組分含量與其抗氧化活性相關,但是是否所有食用真菌多糖的組成均影響其抗氧化活力,還需要大量食用真菌多糖樣本進一步驗證。