miR-148a靶向Wnt1通路對結直腸癌細胞侵襲、遷移能力的影響

蔣學軍，楊勇，庹磊，吉祖進，雷新益

湖北省十堰市國藥東風總醫院，湖北十堰442001

結直腸癌(CRC)是臨床常見的惡性腫瘤之一，具有發病隱匿、惡變時間長的特點，發病率和病死率逐年升高[1]。Wnt1可調控細胞生長、分化、遷移，是結腸癌發生發展的經典調控分子[2]。N-鈣黏蛋白(N-cadherin)可介導細胞與細胞間的動態黏附，其高表達可導致大量癌基因作用增強，并促進腫瘤的浸潤和轉移[3]?；|金屬蛋白酶2(MMP-2)可降解細胞外基質(ECM)，促進癌細胞向前移行[4]。有研究發現，長鏈和短鏈非編碼RNA可調控Wnt1分泌并參與調控經典的Wnt通路促進CRC細胞的增殖和遷移[5，6]。微小RNA-148a(miR-148a)屬于短鏈非編碼RNA，參與腫瘤發生發展過程，與CRC預后不良密切相關[7]。2019年3～11月，我們觀察了miR-148a對CRC細胞侵襲、遷移能力的影響，并探討其與Wnt1通路的關系，旨在為臨床治療CRC提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 細胞、試劑與儀器 人正常結直腸黏膜細胞FHC購自上海冠導生物工程有限公司，人CRC細胞HCT116購自上海博湖生物科技有限公司，人CRC細胞SW620購自上海冠導生物工程有限公司。miR-148a激動劑(miR-148a mimic)及陰性對照(miR-148a NC)均購自無錫萊弗思生物實驗器材有限公司，Lipo2000轉染試劑盒購自上海聯碩生物科技有限公司，DMEM高糖和RPMI-1640培養基購自美國Hyclone公司，BCA蛋白定量試劑盒購自美國Pierce公司，N-cadherin、MMP-2、β-連環蛋白(β-catenin)、Wnt1抗體購自美國Santa Cruz公司。Transwell小室(美國BD公司)，全自動酶標儀(美國Versamax公司)，實時熒光定量PCR儀(德國QIAGEN Rotor-Gene Q)。

1.2 細胞培養 將FHC、HCT116、SW620細胞快速解凍，離心收集細胞，按1×105/孔接種于含10%胎牛血清(FBS)的RPMI-1640培養基中，置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養48 h，常規傳代、計數。

1.3 細胞miR-148a、Wnt1 mRNA表達檢測 采用qRT-PCR法。取對數生長期FHC、HCT116、SW620細胞，加入胰酶消化，離心，收集細胞，用TRIzol試劑盒抽提總RNA，逆轉錄試劑盒合成cDNA。按試劑盒說明建立反應體系及參數，進行擴增。PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列：miR-148a上游5′-CTCGGCAGTCAGGCGT-3′，下游5′-GTCTCCGTCGCTTTCAGACGAT-3′；Wnt1上游5′-TGCTGTCCCTGTGGTATTGT-3′，下游5′-ACAGCTTTCCTTGCCCTTTC-3′；U6上游5′-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT-3′，下游5′-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3′；GAPDH上游5′-AGTCAGGTATCCCACAGGAAACAG-3′，下游5′-TGTGTCCGTCGTGGATCTGA-3′。反應條件：95 ℃預熱3 min；95 ℃ 20 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 10 s，共36個循環；72 ℃ 5 min終止反應。分別以U6、GAPDH為內參，采用2-ΔΔCt法計算miR-148a、Wnt1 mRNA的相對表達量，實驗重復3次。

1.4 轉染miR-148a激動劑對HCT116細胞侵襲和遷移能力的影響分析

1.4.1 細胞分組與轉染 收集對數生長期HCT116細胞，按1×105/孔接種于6孔板，加入完全培養基，培養箱中培養過夜，更換為無血清培養基繼續培養2 h。將細胞分為Control組、miR-148a mimic組、miR-148a NC組。miR-148a mimic組、miR-148a NC組分別加入miR-148a mimic液、miR-148a NC液與Lipo2000轉染液的混合物，用不含胎牛血清的培養基培養48 h，Control組不做任何處理。收集各組細胞，進行后續試驗。

1.4.2 細胞侵襲能力觀察 采用Transwell小室實驗。收集三組細胞，加入胰酶消化，離心，收集細胞，用不含胎牛血清的培養基重懸，調整細胞密度為5×105/mL。預先用不含胎牛血清的培養基按1∶8稀釋Matrigel基質膠，包被每個小室基底膜，置于恒溫箱中2 h。待基質膠凝固后，取細胞懸液200 μL加入小室，置于恒溫箱中培養過夜。取出小室，PBS沖洗，用棉簽擦去小室內側的細胞，加入4%多聚甲醛溶液固定，結晶紫染色。高倍顯微鏡下拍照，隨機取5個視野計數穿膜細胞數。實驗重復3次。

1.4.3 細胞遷移能力觀察 除Transwell小室不包被Matrigel基質膠外，其余操作同“1.4.2”。

1.4.4 細胞miR-148a、Wnt1 mRNA表達檢測 采用qRT-PCR法。收集三組細胞，加入胰酶消化，離心，收集細胞。按照“1.3”步驟檢測miR-148a、Wnt1 mRNA的相對表達量。

1.4.5 細胞Wnt1、β-catenin、N-cadherin、MMP-2蛋白表達檢測 采用Western blotting法。收集三組細胞，加入RIPA裂解液進行裂解后提取總蛋白，用BCA試劑盒測定總蛋白濃度。取50 μg蛋白進行電泳、PVDF轉膜，用5%脫脂奶粉封閉液封閉1 h。加入相應的一抗(Wnt1、β-catenin、N-cadherin、MMP-2稀釋倍數均為1∶1 000，GAPDH稀釋濃度為1∶2 000)，4 ℃孵育24 h。洗滌后，加入HRP標記的二抗(羊抗兔IgG)，室溫孵育1 h。洗滌，采用增強化學發光法顯色，凝膠成像儀觀察條帶并拍照，Image J軟件分析各組蛋白的相對表達量。

1.5 miR-148a與Wnt1的靶向關系驗證 采用雙熒光素酶法。合成Wnt1的3′ 非翻譯區(3′ UTR)的miR-148a識別序列，克隆至pmiRGlo載體，得到pmiRGlo-Wnt1-3′ UTR-WT。另外對miR-148a識別區Wnt1堿基進行突變連接至pmiRGlo載體，得到pmiRGlo-Wnt1-3′ UTR-MUT。分別將pmiRGlo-Wnt1-3′ UTR-WT、pmiRGlo-Wnt1-3′ UTR-MUT質粒與miR-148a NC、miR-148a mimic共轉染，分為miR-148a NC+Wnt1-3′ UTR-WT組、miR-148a mimic+Wnt1-3′ UTR-WT組、miR-148a NC+Wnt1-3′ UTR-MUT組、miR-148a mimic+Wnt1-3′ UTR-MUT組，按照轉染試劑盒說明書進行轉染。轉染24 h后，按照雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明書，添加螢火蟲和海參熒光素酶試劑上機檢測。每孔的數值以螢火蟲熒光活性/海參熒光活性顯示。

2 結果

2.1 FHC、HCT116、SW620細胞中miR-148a、Wnt1 mRNA表達水平比較 與FHC細胞相比，HCT116、SW620細胞miR-148a表達水平降低(P均<0.05)，Wnt1 mRNA表達水平升高(P均<0.05)；HCT116細胞與SW620細胞相比，miR-148a、Wnt1 mRNA表達水平差異無統計學意義(P均>0.05)。見表1。

表1 FHC、HCT116、SW620細胞中miR-148a、Wnt1 mRNA表達水平比較

2.2 轉染miR-148a激動劑對HCT116細胞侵襲和遷移能力的影響

2.2.1 三組細胞侵襲、遷移能力比較 與Control組和miR-148a NC組相比，miR-148a mimic組細胞侵襲和遷移實驗的穿膜細胞數均明顯較少(P均<0.05)，Control組與miR-148a NC組比較差異無統計學意義(P均>0.05)。見表2。

表2 三組細胞侵襲、遷移實驗的穿膜細胞數比較(個

2.2.2 三組miR-148a、Wnt1 mRNA表達比較 與Control組和miR-148a NC組相比，miR-148a mimic組Wnt1 mRNA表達水平降低(P均<0.05)，miR-148a表達水平升高(P均<0.05)；Control組與miR-148a NC組相比差異均無統計學意義(P均>0.05)。見表3。

表3 三組miR-148a、Wnt1 mRNA表達比較

2.2.3 三組Wnt1、β-catenin、N-cadherin、MMP-2蛋白表達比較 與Control組和miR-148a NC組相比，miR-148a mimic組HCT116細胞中Wnt1、β-catenin、MMP-2、N-cadherin蛋白表達均降低(P均<0.05)；Control與miR-148a NC組相比差異無統計學意義(P均>0.05)。見表4。

表4 三組Wnt1、β-catenin、N-cadherin、MMP-2蛋白表達比較

2.3 miR-148a與Wnt1的靶向關系 miRtarbase預測顯示，miR-148a與Wnt1 mRNA的3′UTR有結合位點，見表5。雙熒光素酶報告基因檢測顯示，與miR-148a NC+Wnt1-3′ UTR-WT組比較，miR-148a mimic+Wnt1-3′ UTR-WT組熒光素酶活性降低(P<0.05)；miR-148a NC+Wnt1-3′ UTR-MUT組、miR-148a mimic+Wnt1-3′ UTR-MUT組熒光素酶活性比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表6。

表5 miRtarbase預測miR-148a與Wnt1 mRNA靶向關系

表6 各組基因熒光素酶相對活性比較

3 討論

CRC的發病率和病死率占消化道惡性腫瘤的首位。CRC進展的關鍵步驟是腫瘤細胞的侵襲、遷移，腫瘤細胞擴散到鄰近組織并在附近組織中定殖、生長，最終導致患者死亡[8]。目前研究認為，CRC的發生發展與癌基因和腫瘤抑制基因表達失調、表觀遺傳學突變等因素有關，但其確切機制目前尚不明確[9]。新型調控分子miRNA可調控癌基因和腫瘤抑制基因表達，并參與CRC發生發展過程[10，11]。

研究表明，miR-148a參與了腫瘤的發生發展過程，但其作為抑癌基因還是癌基因，目前仍存在爭議。Li等[12]報道，miR-148a可促進膠質母瘤細胞增殖、侵襲；Zhao、Dybos等[13,14]報道，miR-148a可促進骨肉瘤和前列腺癌增殖，推測miR-148a為癌基因。而Han、Liu等[15,16]報道，miR-148a過表達可抑制癌細胞侵襲，推測miR-148a為抑癌基因。關于miR-148a在CRC中的研究報道較少，Takahashi等[7]發現，miR-148a在CRC患者中低表達，可作為CRC患者晚期預測指標。本研究結果顯示，與正常結直腸FHC細胞相比，人CRC細胞HCT116、SW620中miR-148a表達顯著降低，表明miR-148a可能作為抑癌基因參與CRC的發生發展。

N-cadherin、MMP-2蛋白與腫瘤侵襲和遷移關系密切。N-cadherin是一種新型的腫瘤預后標志物，可促進CRC侵襲和遷移，加速其惡性進展進程[17]；CRC的侵襲和遷移是導致患者死亡的主要原因，而CRC的侵襲和遷移需要通過激活MMP-2的表達來實現[18]。研究表明，Wnt通路可促進CRC細胞的增殖和遷移。Cheng等[19]報道，激活Wnt/β-catenin通路可促進CRC細胞增殖。郭麗等[20]報道，抑制Wnt1/β-catenin通路激活后，胃癌細胞中侵襲遷徙相關基因N-cadherin、MMP-2 mRNA及蛋白表達均降低，提示Wnt1/β-catenin通路激活可能與腫瘤侵襲、遷移能力增強有密切關系。Wang等[21]報道，抑制CRC腫瘤組織中Wnt1分泌，可抑制CRC患者腫瘤進程。本研究發現，與正常結直腸FHC細胞相比，人CRC細胞HCT116、SW620中Wnt1 mRNA表達顯著增高，表明Wnt1在CRC中處于激活狀態，與上述文獻研究一致。但miR-148a是否通過Wnt1通路調節CRC細胞遷移、侵襲未見報道。本研究通過建立HCT116細胞miR-148a過表達體系發現，與Control組和miR-148a NC組相比，miR-148a mimic組HCT116細胞中miR-148a表達增高，Wnt1通路相關Wnt1及β-catenin蛋白表達降低，而細胞侵襲、遷移相關蛋白MMP-2、N-cadherin蛋白表達也明顯降低，表明miR-148a mimic可抑制Wnt1/β-catenin通路激活，抑制CRC細胞侵襲、遷移。進一步通過雙熒光素酶報告試驗發現，miR-148a與Wnt1 mRNA存在直接靶向關系，推測miR-148a可能通過靶向抑制Wnt1通路蛋白表達，抑制CRC細胞侵襲、遷移。

綜上所述，miR-148a可能通過靶向抑制Wnt1通路蛋白表達，抑制CRC細胞侵襲、遷移。為臨床治療CRC提供一定的參考。但腫瘤細胞侵襲、遷移等惡性腫瘤生物學過程中分子生物學機制復雜，可能有多個miRNA靶向作用于Wnt1通路，具體機制還有待進一步探討。